从体外感觉和运动神经中纯化成纤维细胞和施万细胞

该协议可用于快速获取大量的传感器和电机成纤维细胞和施万细胞。通过此信息获得的细胞可用于神经再生和神经系统疾病的研究。我们演示可以代表实验，更好地控制微分消化步骤的时间，使实验步骤更容易理解。

要用剪刀爆裂，做一个三厘米的切口，在背部的皮肤。拆下脊柱。小心地打开椎管，露出脊髓。

将脊髓系在60毫米培养皿中，在解剖显微镜下用三到四毫升的冰冷D汉克斯平衡盐溶液，切除腹根和背根。将它们放在冰冷的D汉克斯平衡盐溶液中。取出HSS后，用剪刀将神经切成三到五毫米。

加入一毫升0.25%的三辛，并将神经片段转移到5毫升离心管。在37摄氏度下孵育18至20分钟。接下来，为了停止消化，在含有10%胎儿牛血清的三到四毫升DMEM中加入。

轻轻上下移液混合物约10次。在 800 次 G 下离心五分钟。离心后丢弃上经剂。

并在两到三毫升DMEM中重新悬浮沉淀物，并辅以10%FBS。通过 400 网状过滤器过滤细胞悬浮液，然后使用悬浮液为 60 毫米 Petri 盘接种。在37摄氏度下孵育培养培养皿4至5天，同时存在5%的二氧化碳。

当培养达到90%汇合时，使用1XPBS清洗细胞一次。然后，要消化Schwann细胞，每60毫米培养皿在37摄氏度下加入1毫升0.25%的三丁鱼。在室温下8至10秒后，停止消化，加入3毫升DMEM，辅以10%FBS。

要分离Schwann细胞，用移液器轻轻吹在细胞上。用显微镜验证细胞是否分离。然后收集含有天鹅细胞的介质，并在800次G下离心5分钟。

丢弃上一杯，并在三毫升的介质中重新悬浮沉淀物。使用此悬浮液为未涂覆的 60 毫米培养皿接种，并在 37 摄氏度下孵育盘子 30 至 45 分钟。该培养基的品牌，其中将施万细胞到聚L赖氨酸涂层的培养皿，并在37摄氏度的温度下孵育两天。

去除含有Schwann细胞的培养基后，用1XPBS粘附在培养皿上。要消化成纤维细胞，在37摄氏度下加入0.25%的三丁辛1毫升。消化后，在37摄氏度下进行两分钟，通过添加DMEM和10%FBS来结束消化。

要分离成纤维细胞，请使用移液器吹在盘子的底部。收集介质，包括成纤维细胞，并转移到离心管。在800次G下离心管5分钟。

丢弃上一杯，用含有10%FBS的两毫升DMEM重新沉淀物。在未编码的60毫米、培养皿中接种细胞，并在37摄氏度下孵育30至45分钟。通过去除和丢弃生长介质，分离将粘附在培养皿中的成纤维细胞。

加入三毫升DMEM，辅以10%FBS。在37摄氏度下孵育两天，直到通道一个细胞达到90%的汇合。重复差分消化和粘附。

在培养成纤维细胞和施万细胞两天后，消化细胞，收集细胞，并计算它们。接种PLL涂层幻灯片的浓度是每井10个细胞的浓度，用于ICC染色。Bay 的对比显微镜显示了在整个分离过程中培养的施万细胞和成纤维细胞的形态。

经过长时间的培养，施万细胞聚集在成纤维细胞之间或位于成纤维细胞表面。消化10秒后，以红色箭头表示的Schwann细胞是圆的，而成纤维细胞保持平坦，并附着在盘子的底部。通过差分消化和差分粘附分离后，所有四种细胞类型都观察到典型的细胞形态。

运动成纤维细胞，感觉成纤维细胞，运动施万细胞和感觉施万细胞。使用锥形焦激光扫描显微镜对感觉和运动成纤维细胞进行可视化。成纤维细胞被染色的抗体对CD 90 X33342染料被用来标记细胞核。

合并的成纤维细胞免疫染色和核染色图像显示，在CD90和六边原共标记细胞中，分别有92.51%和92.64%存在于运动细胞和感觉成纤维细胞中。使用共声激光扫描显微镜对感觉和运动施万细胞进行可视化。Schwann细胞被染色的抗体对S100 X33342染料被用来标记细胞核。

天鹅细胞免疫染色和核染色的合并图像表明，S100和六边原共标记细胞分别存在91.61%和93.56%。还使用流式细胞学对细胞纯度进行了分析。在成纤维细胞培养中，大约90%的细胞是成纤维细胞，在FCA图中由M2表示，而其余细胞是施万细胞。

在Schwann细胞培养中，超过92%的细胞是Schwann细胞，在FCA图中，M2再次表明，而其余细胞是成纤维细胞。该协议很少可用于启动成纤维细胞的传感器和运动神经再生机制，以及Schwann细胞移植，以促进神经再生。