Name: 通过定量染色体形成捕获（4C）鉴定胚胎体增强剂-促进者接触 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 了解定量染色体构象捕获技术，用于分析胚胎体中增强子与启动子区域的染色质相互作用频率。该方法结合高通量测序，为研究分化过程中的基因调控机制提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢 F. Le Dily、R. Stadhouders 以及 Graf 实验室成员提供的建议和讨论。G.S. 获得玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里学者基金（H2020-MSCA-IF-2016，miRStem）资助，T.V.T. 获得胡安·德·拉·谢尔瓦博士后基金（MINECO，FJCI-2014-22946）资助。本研究获得欧洲研究理事会第七框架计划下的支持th 欧盟第七框架计划（ERC Synergy Grant 4D-Genome，协议号 609989，授予 T.G.），西班牙经济、工业与竞争力部（MEIC）对 EMBL 合作关系的支持，塞韦罗·奥乔亚卓越中心（2013–2017），以及加泰罗尼亚自治区政府 CERCA 计划。

1. 小鼠胚胎干细胞生成拟胚体
<ol>
	<li>准备小鼠胚胎干细胞（mESC）无血清培养基：将DMEM/F12与神经基础培养基按1:1比例混合。培养基中添加MEM非必需氨基酸溶液（1x）、丙酮酸钠（1 mM）、L-谷氨酰胺（2 mM）、青霉素-链霉素（100 U/mL）、β-巯基乙醇（50 µM）、N2和B27补充剂（1x）、PD0325901（1 µM）、CHIR99021（3 µM）以及白血病抑制因子（LIF）（1,000 U/mL）。</li>
	<li>准备拟胚体（EB）分化培养基：DMEM中添加10%胎牛血清（FBS）、MEM非必需氨基酸（1x）、丙酮酸钠（1 mM）、L-谷氨酰胺（2 mM）、青霉素-链霉素（100 U/mL）、β-巯基乙醇（50 µM）。</li>
	<li>将mESC接种于预先用0.1%（w/v）明胶包被的10 cm塑料培养皿中，使用mESC无血清培养基进行培养。</li>
	<li>当mESC达到60%融合度时，吸除培养基，并用2 mL无菌PBS轻轻洗涤1次。</li>
	<li>完全吸除PBS，加入2 mL细胞解离培养基，在37 °C孵育5分钟。</li>
	<li>向培养皿中加入8 mL EB分化培养基以终止反应。</li>
	<li>通过移液器上下吹打15–20次，使mESC集落解离成单细胞悬液。</li>
	<li>在室温（RT）下以300 × g离心5分钟，小心吸除上清液。</li>
	<li>对细胞进行计数（例如使用血细胞计数板）。</li>
	<li>用EB分化培养基重悬细胞沉淀，并调整细胞浓度至2 × 104 个细胞/mL。</li>
	<li>将15 cm培养皿的皿盖翻转，在其表面使用200 µL多通道移液器滴加20 µL重悬细胞液（约400个细胞/滴）。</li>
	<li>小心将皿盖翻转后扣于培养皿底部，形成悬滴，于37 °C、5% CO2、95%湿度条件下孵育3天。</li>
	<li>用10 mL PBS轻轻冲洗皿盖以收集拟胚体（EBs），并将含有EB的悬液转移至50 mL塑料离心管中。</li>
	<li>将离心管置于室温（RT）静置30分钟，使EB依靠重力沉降至管底，小心吸除上清液。</li>
	<li>用10 mL新鲜EB分化培养基轻柔重悬EB，转移至10 cm细菌培养用培养皿中。</li>
	<li>3–6天后使用倒置显微镜检查EB形成情况。所生成的EB应呈圆形且大小均一。</li>
	<li>继续在37 °C、5% CO2、95%湿度条件下培养。EB将持续分化为三个胚层，可在不同时间点收集用于分析。</li>
</ol>
2. 胚状体的解离
<ol>
	<li>从两个至三个10 cm培养皿中收集拟胚体（EBs）至一个50 mL塑料离心管中。在室温下以300 × g 离心5分钟，然后小心移除上清液。</li>
	<li>用10 mL PBS重悬拟胚体（EBs）。在室温下以300 × g 离心3分钟，随后移除上清液。</li>
	<li>向沉淀中加入2 mL 0.25%的胰蛋白酶-EDTA，将离心管置于37 °C孵育15分钟。每隔3分钟用移液器吹打数次，以获得单细胞悬液。</li>
	<li>加入8 mL拟胚体（EB）分化培养基以终止胰蛋白酶反应。在显微镜下检查拟胚体（EB）的解离情况，并进行细胞计数。</li>
</ol>
3. 固定
<ol>
	<li>将细胞重悬于新鲜的EB培养基中，浓度为1 × 106 个细胞/mL。对于50 mL离心管，使用最多4.5 × 107 个细胞，加入45 mL培养基。</li>
	<li>从37%的储存液（使用期限不超过6个月）中加入多聚甲醛，使其终浓度为1%。 
	注意：操作多聚甲醛时应遵循适当的安全与健康规范，因其为有害化学品。</li>
	<li>在室温下旋转孵育10分钟。</li>
	<li>加入甘氨酸至终浓度0.125 M，以淬灭甲醛反应。</li>
	<li>在室温下旋转孵育5分钟。</li>
	<li>将固定后的细胞转移至冰上，此后始终保持低温（4 °C）。</li>
	<li>在预冷的离心机中以300 × g 离心5分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀用预冷的PBS重悬（每5 × 106 个细胞使用1 mL），然后转移至1.5 mL防漏离心管中。</li>
	<li>在4 °C下以300 × g 离心5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀在液氮中迅速冷冻。可于-80 °C保存，或继续进行以下实验步骤。</li>
</ol>
4. 细胞裂解与限制性内切酶消化
<ol>
	<li>每 2–5 × 106 个细胞，用 0.25 mL 新鲜配制的冰上预冷裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl pH = 8.0，10 mM NaCl，0.2% Igepal CA630 和 1× 蛋白酶抑制剂）轻轻重悬细胞沉淀。配制 5 mL 裂解缓冲液的方法见表 1。</li>
	<li>将细胞在冰上孵育 15 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，保留含有细胞核的沉淀。</li>
	<li>用 500 µL 冷裂解缓冲液洗涤沉淀的细胞核。</li>
	<li>在 1.5 mL 离心管中，用 50 µL 含 0.5% SDS 的 1× 缓冲液 2 轻轻重悬沉淀，然后将离心管置于 62 °C 加热块中孵育 10 分钟。</li>
	<li>从加热块中取出离心管，加入 170 µL 消化缓冲液（含 25 µL 10% Triton X-100）以淬灭 SDS。用移液器轻轻混匀，避免产生过多泡沫。</li>
	<li>在 37 °C 下孵育 15 分钟。</li>
	<li>加入 25 µL 消化缓冲液，通过倒置混匀，并取 8 µL 作为未消化对照样品。将未消化对照样品保存在 -20 °C。向剩余的细胞核中加入 100 U MboI 限制性内切酶（4 µL 的 25 U/µL 储液），在 37 °C 下旋转消化染色质 2 小时。再加入 100 U MboI，继续孵育 2 小时。</li>
	<li>再加入 100 U MboI，在 37 °C 下旋转孵育过夜。</li>
	<li>次日，再次加入 100 U MboI，在 37 °C 下旋转孵育 3 小时。</li>
	<li>取 8 µL 作为已消化对照样品。通过加入 80 µL TE 缓冲液（10 mM Tris pH = 8，1 mM EDTA）和 10 µL 蛋白酶 K（10 mg/mL），对已消化对照样品和步骤 4.8 中的未消化对照样品进行解交联。在 65 °C 下孵育 1 小时。</li>
	<li>取 20 µL 样品在 0.6% 琼脂糖凝胶上电泳，以检测消化效率。成功的消化应主要产生大小在 3.0–0.5 kb 范围内的片段。</li>
</ol>
5. 邻近连接与交联逆转
<ol>
	<li>将经 MboI 消化的样品置于加热块中，在 65 °C 下孵育 20 分钟以灭活 MboI，然后冷却至室温。</li>
	<li>在室温下以 1,000 × g 离心试管 5 分钟，移除上清液，并将沉淀溶解于 200 µL 新鲜连接酶缓冲液中。</li>
	<li>向每个样品中加入 1,000 µL 连接反应主混合液。配制 1,000 µL 连接反应主混合液的方法见表 2。</li>
	<li>通过倒置混匀，并在室温下缓慢旋转（9 rpm）过夜孵育。</li>
	<li>加入 100 µL 蛋白酶 K（10 mg/mL）和 10 µL 核糖核酸酶 A（10 mg/mL），以去除 RNA 和蛋白质残留。将样品在 55 °C 下孵育 45–60 分钟。</li>
	<li>继续在 65 °C 下孵育样品额外 4 小时。</li>
</ol>
6. DNA 打断与片段大小筛选
<ol>
	<li>将离心管冷却至室温。</li>
	<li>离心5分钟，1,000 x g 4℃ &#176;C.</li>
	<li>将样品均分为三份，每份400 &#181;将 L 分装至 2 mL 管中，并加入 2 &#181;20 mg/m 的糖原溶液 40 L &#181;L 3 M 醋酸钠（pH = 5.2）和 2.5 倍体积（1 mL）的 100% 乙醇加入各管中。通过倒置混匀，于 -80 ℃ 孵育 &#176;C，45-60 分钟。</li>
	<li>16,000 x g 离心 g 4℃时 &#176;25分钟内离心。离心后立即将离心管置于冰上，并用移液器小心吸除上清液。</li>
	<li>用800 μL溶液重悬DNA沉淀进行洗涤 &#181;70% 乙醇中离心，16,000 x g 4℃下 &#176;5分钟，4℃</li>
	<li>移除上清液，并用800 μL PBS再洗涤一次 &#181;70%乙醇的L</li>
	<li>将沉淀溶解于130 &#181;L 的 1× Tris 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH = 8）中，并在 37 °C 下孵育 &#176;15分钟内充分溶解DNA。如有必要，可用移液法重悬任何沉淀物。</li>
	<li>测量DNA产量；2.5–5 &#181;1 x 10 的染色质可预期获得 g6 细胞。通过电泳检测连接效果 &#177; 0.6% 琼脂糖凝胶上电泳 200 ng 的 3C 产物。成功的连接反应主要显示 DNA 片段 &#62; 3 kb。将样品储存在 -20 &#176;C.</li>
	<li>将样品稀释至适合超声处理的0.65 mL离心管中，浓度为10 ng/μL&#181;L 在 100 &#181;L 的 1× Tris 缓冲液体积（1 &#181;每管克数）。文库制备的标准用量为 3 &#181;g，如有必要，可分三个独立的试管进行超声处理。</li>
	<li>使用超声破碎仪将DNA剪切至150-700 bp（平均400-500 bp），参数设置为：循环6-8次，每次20秒开启，60秒关闭。所得DNA片段适用于采用Illumina测序仪进行高通量测序文库构建。</li>
	<li>将剪切后的DNA转移至一个新的普通安全盖离心管中。合并同一样本的多次超声处理产物。</li>
	<li>将一瓶DNA纯化磁珠在室温下预热。从此步骤开始，使用低吸附枪头。</li>
	<li>向DNA管中加入1.8倍体积的磁珠并轻轻重悬。</li>
	<li>室温孵育5分钟。</li>
	<li>使用磁力架收集磁珠。将磁珠在磁力架上用1 mL新配制的80%乙醇洗涤2次。 
	注意：去除所有乙醇，包括残留液滴。</li>
	<li>在室温下短暂风干磁珠（2-3 分钟）。 
	注意：切勿将磁珠干燥超过5分钟，否则会降低DNA得率。</li>
	<li>用 90 微升缓冲液重悬珠子 &#181;L 的 1× Tris 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH = 8）用于洗脱 DNA。</li>
	<li>测量 DNA 产量并分析 5 &#181;将等份样品在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳。与超声处理前的产量相比，损失应极小。</li>
</ol>
7. 测序文库制备
<ol>
	<li>从文库制备试剂盒中加入15 µL主混合液。为修复剪切后DNA的末端，将10 µL 10x末端修复反应缓冲液与5 µL末端修复酶混合液混合。</li>
	<li>在室温下孵育30分钟。</li>
	<li>加入1.1倍体积的DNA纯化磁珠，并轻轻重悬。</li>
	<li>在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>使用磁力架收集磁珠。在保持离心管处于磁力架上的同时，用1 mL新配制的80%乙醇洗涤磁珠两次。去除乙醇。</li>
	<li>在室温下将磁珠干燥2-3分钟。加入42 µL 1x Tris缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH = 8）重悬磁珠，以洗脱DNA。</li>
	<li>向每个样品中加入8 µL dA加尾主混合液。配制dA加尾主混合液时，将5 µL 10x dA加尾反应缓冲液与3 µL Klenow片段（exo minus）混合。</li>
	<li>在37 °C下孵育30分钟。</li>
	<li>加入2 µL小牛肠碱性磷酸酶（CIP）以去磷酸化DNA。</li>
	<li>在37 °C下孵育30分钟，随后在50 °C下孵育60分钟。</li>
	<li>加入1.1倍体积的DNA纯化磁珠，并轻轻重悬。</li>
	<li>在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>使用磁力架收集磁珠。在保持离心管处于磁力架上的同时，用1 mL新配制的80%乙醇洗涤磁珠两次。</li>
	<li>在室温下短暂干燥磁珠（2-3分钟）。加入35 µL 1x Tris缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH = 8）重悬磁珠，以洗脱DNA。</li>
	<li>进行接头连接反应。接头/连接酶的浓度应降低，具体如表3所述。</li>
	<li>在20 °C下孵育15分钟。</li>
	<li>加入3 µL尿嘧啶DNA糖基酶与DNA糖基酶-裂解酶内切酶VII（例如USER）酶的混合液，用移液器混匀，然后在37 °C下孵育15分钟。</li>
	<li>加水至总体积为100 µL，在96 °C下煮沸5分钟，然后将样品置于冰上冷却。</li>
	<li>加入1.1倍体积的DNA纯化磁珠，并轻轻重悬。</li>
	<li>在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>使用磁力架收集磁珠。在保持离心管处于磁力架上的同时，用1 mL新配制的80%乙醇洗涤磁珠两次。</li>
	<li>在室温下将磁珠干燥2-3分钟。加入50 µL 1x Tris缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH = 8）重悬磁珠，以洗脱DNA。</li>
</ol>
8. 4C 染色质相互作用文库的扩增与纯化
<ol>
	<li>使用10 µL文库进行第一轮PCR以扩增4C文库&#160;。PCR反应体系和程序见表4。</li>
	<li>进行巢式PCR。巢式PCR反应体系和程序见表5。</li>
	<li>合并每个文库的PCR产物，并用1.1倍体积的DNA纯化磁珠进行纯化。</li>
	<li>测定DNA产量，并取5 µL上样于1.5%琼脂糖凝胶进行分析。</li>
	<li>调整文库浓度后进行测序。若文库带有索引序列，可在测序前混合多个文库。</li>
</ol>

<ol><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li>
<li>Martello, G., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The nature of embryonic stem cells.</a> Annual Review Cell and Developmental Biology. 30, 647-675 (2014).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Loh, K. M., Lim, B., Ang, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+uno+plures%3A+molecular+designs+for+embryonic+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Ex uno plures: molecular designs for embryonic pluripotency.</a> Physiological Reviews. 95 (1), 245-295 (2015).</li>
<li>Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+embryoid+bodies+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+means+to+assess+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency.</a> Stem Cells International. 2012, 738910(2012).</li>
<li>Gaszner, M., Felsenfeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulators%3A+exploiting+transcriptional+and+epigenetic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Insulators: exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms.</a> Nature Reviews in Genetics. 7 (9), 703-713 (2006).</li>
<li>Lenhard, B., Sandelin, A., Carninci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metazoan+promoters%3A+emerging+characteristics+and+insights+into+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Metazoan promoters: emerging characteristics and insights into transcriptional regulation.</a> Nature Reviews in Genetics. 13 (4), 233-245 (2012).</li>
<li>Long, H. K., Prescott, S. L., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ever-Changing+Landscapes%3A+Transcriptional+Enhancers+in+Development+and+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ever-Changing Landscapes: Transcriptional Enhancers in Development and Evolution.</a> Cell. 167 (5), 1170-1187 (2016).</li>
<li>Schoenfelder, S., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+enhancer-promoter+contacts+in+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control.</a> Nature Reviews in Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).</li>
<li>Spitz, F., Furlong, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors%3A+from+enhancer+binding+to+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcription factors: from enhancer binding to developmental control.</a> Nature Reviews in Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+and+the+regulatory+epigenome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility and the regulatory epigenome.</a> Nature Reviews in Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).</li>
<li>Rada-Iglesias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).</li>
<li>Lettice, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+five+digits+is+controlled+by+a+bipartite+long-range+cis-regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of five digits is controlled by a bipartite long-range cis-regulator.</a> Development. 141 (8), 1715-1725 (2014).</li>
<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li>
<li>de Wit, E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+3C+technologies%3A+insights+into+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization.</a> Genes and Development. 26 (1), 11-24 (2012).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li>
<li>Simonis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+organization+of+active+and+inactive+chromatin+domains+uncovered+by+chromosome+conformation+capture-on-chip+%284C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C).</a> Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).</li>
<li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology%3A+from+fixation+to+computation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: from fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li>
<li>Stadhouders, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+chromosome+conformation+capture+sequencing+for+rapid+genome-scale+high-resolution+detection+of+long-range+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions.</a> Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).</li>
<li>van de Werken, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+4C-seq+data+analysis+to+screen+for+regulatory+DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust 4C-seq data analysis to screen for regulatory DNA interactions.</a> Nature Methods. 9 (10), 969-972 (2012).</li>
<li>Schwartzman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UMI-4C+for+quantitative+and+targeted+chromosomal+contact+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">UMI-4C for quantitative and targeted chromosomal contact profiling.</a> Nature Methods. 13 (8), 685-691 (2016).</li>
<li>Tian, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whsc1+links+pluripotency+exit+with+mesendoderm+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Whsc1 links pluripotency exit with mesendoderm specification.</a> Nature Cell Biology. 21 (7), 824-834 (2019).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+interplay+between+enhancer-promoter+topology+and+gene+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Dynamic interplay between enhancer-promoter topology and gene activity.</a> Nature Genetics. 50 (9), 1296-1303 (2018).</li>
<li>Apostolou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+chromatin+interactions+of+the+Nanog+locus+in+pluripotency%2C+differentiation%2C+and+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide chromatin interactions of the Nanog locus in pluripotency, differentiation, and reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 699-712 (2013).</li>
<li>de Wit, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pluripotent+genome+in+three+dimensions+is+shaped+around+pluripotency+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pluripotent genome in three dimensions is shaped around pluripotency factors.</a> Nature. 501 (7466), 227-231 (2013).</li>
<li>Krijger, P. H. L., Geeven, G., Bianchi, V., Hilvering, C. R. E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4C-seq+from+beginning+to+end%3A+A+detailed+protocol+for+sample+preparation+and+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">4C-seq from beginning to end: A detailed protocol for sample preparation and data analysis.</a> Methods. , (2019).</li>
<li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiChIP%3A+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li>
<li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li>
<li>Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+Capture+Hi-C%3A+High-resolution%2C+Genome-wide+Profiling+of+Promoter+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

悬滴培养法无需额外添加生长因子或细胞因子，即可从预定数量的mESCs reproducibly生成均一的拟胚体（EB）群体5。本文描述了一种定量4C技术的实验方案，该方法改编自UMI-4C方法，用于在EB分化模型中定量分析谱系特异性转录因子的增强子-启动子相互作用。我们鉴定了在EB分化过程中以动态方式与Pou5f1和T基因启动子发生接触的染色质区域。Pou5f1在EB分化过程中表达下调，其启动子与远端增强子之间的接触频率也随之降低。相反，T基因在EB分化过程中表达上调，我们鉴定了三个增强子，其与启动子的接触频率在分化过程中下降（图3）。为验证上述结果，可进行活性组蛋白标记H3K27ac的染色质免疫沉淀（ChIP）实验24，因为该组蛋白修饰已被证实与增强子的激活相关，且在增强子失活过程中会丢失这一修饰标记11。
标准的4C技术已被广泛用于研究特定基因组位点的染色质互作谱25。然而，即使经过广泛的标准化处理，该方法仍难以进行定量解释26,27,28，原因在于PCR片段大小的异质性引入了偏差，且无法区分PCR重复序列。我们的定量4C方法在很大程度上与UMI-4C技术相似，后者通过超声破碎和嵌套连接介导的PCR步骤实现对单个分子的定量，从而克服经典4C方法的局限性23。然而，与使用唯一分子标识符（UMI）的UMI-4C不同，我们的定量4C方案基于超声破碎步骤产生的特异性DNA断裂来实现单分子定量。这使得我们的方案可与商业化的DNA文库构建试剂盒兼容，无需使用带有唯一分子标识符的引物。
本方案包含若干需要考虑的关键步骤。与经典的 4C 方法28类似，本方案的关键因素在于 3C 分子制备过程中消化和连接的效率。消化/连接效率低下会显著降低与目标片段相互作用的复杂性，从而导致分辨率下降。如前所述23，本方案的另一个关键步骤是文库扩增所用引物的设计。第二轮 PCR 反应的引物应位于被检测限制性酶切位点上游 5–15 nt 处。在 75 nt 的测序读长中，这可为捕获序列留下至少 40 nt 的长度用于比对。第一轮 PCR 反应所用引物应设计在第二轮引物的上游，且两者之间无重叠，同时均需具备足够的特异性以确保高效的 DNA 扩增。对于多重检测，引物应独立设计，目标熔解温度（Tm）为 60–65 °C。此外，与其他 3C 技术类似，定量 4C 方法的分辨率取决于本方案中所使用的限制性内切酶25。本方案采用识别 4 bp 序列的限制性内切酶 MboI。使用该酶所能达到的最大分辨率为约 500 bp，但此值高度依赖于基因座位置，且极少能够实现。另一项局限性在于，位于同一限制性酶切片段内的元件之间的相互作用无法被检测。此外，相距一个限制性酶切位点的相互作用无法与未消化的背景信号相区分。在连接前采用补平步骤可能有助于检测此类相互作用。
定量 4C 技术非常适合研究靶向基因座的染色质相互作用。然而，特异性 PCR 扩增步骤限制了可同时检测的基因座数量。增加靶向基因座数量的一种方法是采用多重 PCR，以同时扩增多个目标片段，但这需要所用引物之间的兼容性，并在实施前对每对引物进行测试。如果希望研究启动子区域染色质结构的全局性变化，则更适合采用全基因组范围的方法，例如 Hi-C、PC Hi-C 或 HiChIP29,30,31。

在小鼠中，3.5天龄胚胎的内细胞团（ICM）含有胚胎多能干细胞。ICM在第4.5天进一步发育为上胚层，产生外胚层、中胚层和内胚层细胞，即胚胎中的三个主要胚层。尽管ICM中的多能细胞在体内仅短暂存在，但可通过建立小鼠胚胎干细胞（mESCs）在体外培养中被捕获1,2,3。mESCs能够保持未分化状态并无限增殖，但在内在和外在刺激下，也可退出多能性状态，分化为三个发育胚层的细胞2,4。有趣的是，当在悬浮的小液滴中培养时，mESCs会形成三维聚集体（即拟胚体，EBs），并进一步分化为所有三个胚层的细胞5。拟胚体形成实验是研究早期谱系特化过程的重要工具。
在谱系特化过程中，各胚层的细胞会获得特定的基因表达程序4。基因的精确时空表达受到多种顺式调控元件的调控，包括核心启动子、增强子、沉默子和绝缘子6,7,8,9。增强子是一类通常跨越数百个碱基对的调控性DNA片段，可协调组织特异性的基因表达8。转录因子及其共因子通过结合增强子并调控局部染色质结构，从而激活或沉默增强子功能8,10。目前常用的鉴定潜在增强子的技术包括全基因组染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）以及利用测序技术检测转座酶可及性染色质（ATAC-seq）。因此，活性增强子通常具有特定的活性组蛋白修饰标记以及局部DNA可及性的增加11,12,13,14。此外，发育相关增强子被认为需要与其对应的启动子发生物理相互作用8,9。事实上，已有研究表明，破坏增强子-启动子相互作用的增强子变异或缺失可导致发育畸形15。因此，亟需开发新的技术，以提供额外信息用于识别调控发育过程中基因表达的功能性增强子。
自从染色体构象捕获（3C）技术16发展以来，染色体相互作用位点的图谱绘制已被广泛用于评估调控元件之间的物理距离。重要的是，近年来已开发出多种高通量版本的3C技术，提供了针对染色质片段间交联、消化、连接和相互作用回收的不同策略17。其中，原位Hi-C技术已成为一种流行方法，可实现全基因组范围内3C连接产物的测序18。然而，要达到适合分析增强子-启动子相互作用的分辨率，所需测序成本较高，使得该技术在特定基因座研究中难以应用。因此，研究人员开发了其他替代方法，以更高分辨率分析靶向基因座19,20,21,22。其中一种方法称为4C，即“一个对所有”策略，能够检测与选定视角位点发生相互作用的所有序列。然而，标准4C技术的一个缺点是需要进行反向PCR，该过程会扩增不同大小的片段，倾向于扩增较小产物，从而在高通量测序后的定量分析中引入偏差。最近，一种名为UMI-4C的新版4C技术被开发出来，该方法利用唯一分子标识符（UMI），实现了定量且靶向的染色体相互作用分析，克服了上述问题23。该方法采用高频切割酶、超声破碎以及嵌套连接介导的PCR流程，从而扩增出长度分布相对均一的DNA片段。这种均一性减少了PCR扩增过程中对较短序列的偏好性偏差，并有助于高效回收空间上相连的分子/片段，实现精确计数。
本文介绍了一种改进的UMI-4C技术方案，用于在拟胚体分化过程中识别并定量谱系指导性转录因子的启动子与增强子之间的染色质互作。

<table><tbody><tr><td>0.1% EmbryoMax 明胶</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-006-B</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td></td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>10136224</td><td>4C/DNA 纯化</td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>Bioruptor Pico</td><td>Diagencode</td><td>B01060010</td><td>4C/超声处理</td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td>4C</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1263</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>CIP</td><td>NEB</td><td>M0212</td><td>4C</td></tr><tr><td>cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td>4C</td></tr><tr><td>DMEM/F12 培养基</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td>4C</td></tr><tr><td>ESGRO 白血病抑制因子 (LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>甲醛溶液 (37%)</td><td>Sigma</td><td>252549-25ML</td><td>4C</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma</td><td>GE17-1323-01</td><td>4C</td></tr><tr><td>糖原</td><td>ThermoFischer</td><td>R0551</td><td>4C</td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA 聚合酶</td><td>Agilent</td><td>600675</td><td>4C</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I3021-50ML</td><td>4C</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td></td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>MboI</td><td>NEB</td><td>R0147M</td><td>4C</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>N2 添加剂</td><td>Gibco</td><td>A1370701</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>NEBNext DNA 文库构建试剂盒</td><td>NEB</td><td>E6040</td><td>4C</td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td>4C/消化</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1036</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td>4C</td></tr><tr><td>Qubit 4 荧光仪</td><td>ThermoFischer</td><td>Q33238</td><td>4C</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>ThermoFischer</td><td>Q32851</td><td>4C</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFischer</td><td>EN0531</td><td>4C</td></tr><tr><td>丙酮酸钠溶液</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>StemPro Accutase 细胞解离试剂</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶反应缓冲液</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td>4C</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶反应缓冲液</td><td>NEB</td><td>M0202M</td><td>4C</td></tr></tbody></table>

通过定量染色体构象捕获技术（4c）鉴定类胚体中的增强子-启动子相互作用

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

在哺乳动物发育过程中，细胞命运的决定依赖于调控网络的建立，这些网络定义了基因表达的特异性、时间和空间模式。由多能干细胞衍生的拟胚体（embryoid bodies, EBs）已成为研究三大胚层分化以及细胞命运决定过程中调控回路的常用模型。尽管已知组织特异性增强子通过与启动子相互作用在这些网络中发挥重要作用，但将增强子准确分配到其对应的靶基因仍具有挑战性。为实现这一目标，需要采用定量方法来研究发育过程中增强子-启动子之间的相互作用及其动态变化。本文中，我们改进了一种4C技术，用于在EB分化模型中鉴定增强子及其与对应启动子的相互联系。该方法采用高频切割的限制性内切酶、超声破碎，以及一种可与商业化DNA文库构建试剂盒兼容的嵌套连接介导PCR流程。随后，对4C文库进行高通量测序并进行生物信息学分析，从而检测和量化所有与选定启动子存在相互作用的序列。所获得的测序数据还可用于获取分化过程中增强子-启动子相互作用动态变化的信息。本研究所描述的EB分化模型中的技术易于实施。

在悬浮液滴中诱导胚胎干细胞分化后的第六天，我们获得了均一的拟胚体群体，用于后续分析（图1）。我们改进了UMI-4C方法23，以定量拟胚体中谱系特异性基因启动子区域的特定染色质相互作用24。该实验流程的示意图及各步骤代表性质量控制凝胶图谱如图2A所示。第一次质量控制用于检测MboI限制性内切酶消化效率，高效消化应产生小于3 kbp的片段（图2B）。值得注意的是，小鼠胚胎干细胞和拟胚体的染色质消化较为困难，有时会残留未完全消化的染色质。第二次质量控制在连接反应后进行，以确认大部分片段大小现已&gt; 3 kbp（图2B）。随后，通过凝胶电泳分析超声处理后获得的染色质片段，预期片段大小为400–500 bp（图2B）。
去磷酸化并连接单端接头后，进行两轮PCR以扩增目标片段。采用巢式策略为每个位点设计一对两种引物，以提高特异性。每个目标片段分别使用两对不同的引物进行扩增，以优化PCR条件（例如，Pou5f1 位点使用引物对A和B，T 位点使用引物对C和D），扩增产物在约400 bp处呈现DNA弥散条带（图2C）。 alternatively，采用多重PCR同时扩增目标A和C（图2D），纯化后获得相似大小的片段（图2D）。用于4C文库构建的引物（针对 Pou5f1 和 T 位点）见 表6。
数据分析时，首先将原始测序读段比对至参考小鼠基因组（mm10），去除所有重复及低质量（&lt; 20）的读段。针对每个诱饵序列，通过计算读段片段的数量获得每个限制性酶切片段的信息，从而得到原始接触图谱。随后，将感兴趣区域定义为距离诱饵序列2 kbp至250 kbp范围内的所有限制性酶切片段。为平滑图谱，通过依次合并相邻的限制性酶切片段，逐步增加每个片段的大小，直至感兴趣区域内原始接触总数达到5%的阈值。为确保生物学重复间的整合及不同条件间的比较，我们在限制性酶切片段水平上同时纳入了斜率和随机截距。每种条件下的平均图谱及其之间的倍数变化如图3所示。在拟胚体分化过程中，多能性基因Pou5f1的增强子与启动子之间的相互作用减少，而中胚层-内胚层谱系决定性转录因子T的增强子-启动子相互作用则增加（图3），这些结果为理解这些发育相关增强子的功能提供了重要线索。
<img alt="类胚体形成，第0天小鼠胚胎干细胞至第6天类胚体，显微镜图像，细胞分化过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60960/60960fig1.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="图1"> 
图1：小鼠胚胎干细胞及其衍生类胚体的代表性图像。 在无血清条件下培养的第0天小鼠胚胎干细胞（左侧）和均一的第6天类胚体（右侧），通过倒置显微镜观察。比例尺 = 500 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60960/60960fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA邻近连接过程，MboI消化至巢式PCR；电泳结果；分子分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60960/60960fig2.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="图2"> 
图2：4C实验流程及本方案主要步骤的代表性图像。（A）定量4C的示意图。RS = 限制性酶切位点；US = 上游；DS = 下游；UP = 通用引物；D = RS与DS之间的距离理想情况下应为5-15 bp。（B）MboI消化后的染色质（I）、细胞核内连接的染色质（II）以及超声处理后的染色质（III）的示例。左侧数字表示通过每个样品的DNA ladder测定的DNA大小。（C）在两个位点进行PCR扩增的示例：Pou5f1（引物A和B）和T（引物C和D）。（D）使用引物A和C在Pou5f1和T位点进行多重PCR扩增的示例。ES = 胚胎干细胞；EB = 胚状体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60960/60960fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因表达分析，log2倍数变化图，Pou5f1和T位点，基因组位置作图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60960/60960fig3.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="图3"> 
图3：4C分析谱图示例。 在mESC和第6天EB中检测的位于Pou5f1和T基因启动子区域的诱饵所获得的定量4C谱图。上图显示了来自两个独立生物学重复实验的平均互作信号图谱；下图显示第6天EB相对于mESC的平均互作信号倍数变化（两个重复实验的平均值）。浅蓝色方框表示在分化过程中发生动态变化的增强子位置。该图改编自Tian等人的研究24。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60960/60960fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>5 mL 用量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>50 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>10 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Igepal CA630</td>
			<td>100 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x Roche complete protease inhibitors</td>
			<td>100 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ 水</td>
			<td>4.74 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：裂解缓冲液。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1000µL用量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ水</td>
			<td>869 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X NEB T4 DNA连接酶缓冲液</td>
			<td>120 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mg/mL 牛血清白蛋白</td>
			<td>6 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2000 U/µL T4 DNA连接酶</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：连接反应主混合液的配制。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>15 µL 体系</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X Quick Ligation Reaction Buffer</td>
			<td>10 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Adaptor</td>
			<td>3 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick T4 DNA ligase</td>
			<td>2 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：接头连接反应。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PCR 反应体系设置</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>接头连接的文库（library-on-deads）</td>
			<td>10 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR 级水</td>
			<td>20.25 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 µM 目标特异性引物</td>
			<td>3.75 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 µM NEB Index 引物</td>
			<td>3.75 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herculase II 5X 缓冲液</td>
			<td>10 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTPs</td>
			<td>1.25 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herculase II 聚合酶</td>
			<td>1 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>50 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR 程序</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步骤 1：98 °C – 2 分钟</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步骤 2：98 °C – 20 秒</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步骤 3：65 °C – 30 秒</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步骤 4：72 °C – 45 秒</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步骤 5：返回步骤 2，共循环 15–18 次</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步骤 6：72 °C – 3 分钟</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步骤 7：4 °C – 保存</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：4C染色质相互作用文库扩增，第一轮PCR。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>巢式PCR反应体系配置</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第一次PCR所得DNA片段</td>
			<td>10 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR级水</td>
			<td>20.25 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 µM 特异性引物+P5 Illumina引物</td>
			<td>3.75 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 µM P7 Illumina引物</td>
			<td>3.75 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herculase II 5X缓冲液</td>
			<td>10 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 Mm dNTPs</td>
			<td>1.25 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herculase II聚合酶</td>
			<td>1 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>50 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>巢式PCR程序</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步骤1：98 °C - 2分钟</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步骤2：98 °C - 20秒</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步骤3：65 °C - 30秒</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步骤4：72 °C - 45秒</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步骤5：返回步骤2，共循环15-18次</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步骤6：72 °C - 3分钟</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步骤7：4 °C – 保温</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表5：4C染色质相互作用文库扩增，巢式PCR。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>名称</td>
			<td>序列 (5'-3')</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-Oct4-A</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTTCTTGCAAAGATAACTAAGCACCAGGCCAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>US-Oct4-A</td>
			<td>TCTCTTGCAAAGATAACTAAGCACCAGGCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-Oct4-B</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTGTGATGGGTCAGCAGGGCTGGAGCCGGGCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>US-Oct4-B</td>
			<td>ACCAGGTGGGGGTGATGGGTCAGCAGGGCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-T-C</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTCCTGGGTCCCTGCACATTCGCCAAAGGAGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>US-T-C</td>
			<td>GATTACACCTGGGTCCCTGCACATTCGCCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-T-D</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTGGCTTTGGAGAGGTCAAGGAGACCCGGGAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>US-T-D</td>
			<td>GCTGAGGCTTTGGAGAGGTCAAGGAGACC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UP-4C</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adap-i1</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adap-i2</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adap-i3</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adap-i4</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表6：用于4C文库构建的引物。

我们报道了在由胚胎干细胞生成的拟胚体中应用定量染色体构象捕获技术并结合高通量测序的方法。该技术可用于鉴定和定量分析在胚胎干细胞分化过程中特定基因的潜在增强子与启动子区域之间的相互作用。

通过定量染色体构象捕获技术（4C）鉴定类胚体中的增强子-启动子相互作用

在哺乳动物发育过程中，细胞命运通过建立调控网络来确定，这些网络定义了基因表达的特异性、时序性和空间性……

基因的精确时空调控由多种顺式调控元件介导，这些元件之间相互作用。本方案可对选定基因座（如启动子）的染色质相互作用进行定量分析。该技术使我们能够同时鉴定并量化不同调控元件之间的相互作用频率。为了生成拟胚体，首先将小鼠胚胎干细胞培养至60%融合度。然后吸除培养基，用两毫升无菌PBS洗涤两次。彻底移除PBS后，加入两毫升细胞解离液。将培养皿置于37摄氏度孵育。孵育5分钟后，向培养皿中加入8毫升EB分化培养基。为解离mESC集落以获得单细胞悬液，用移液器将培养基上下吹打15至20次，并将悬液转移至10毫升离心管中。在室温下以300 × g离心细胞5分钟。然后小心吸去上清液。细胞计数后，用EB分化培养基重悬细胞沉淀。将一个15厘米培养皿的皿盖倒置。使用200微升多通道移液器，将重悬的细胞以每滴20微升的量点在皿盖上。小心地将皿盖翻转，并将其放置在培养皿的底部部分上。将含有悬滴的培养皿孵育三天。孵育结束后，用10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗盖子。将含有拟胚体（EBs）的PBS转移至50毫升塑料管中。室温静置试管30分钟后，小心去除上清液。此时胚胎小体（EBs）将沉淀于试管底部。用10毫升新鲜的EB分化培养基轻轻重悬EBs。将悬液转移至直径10厘米的细菌培养皿中。3至6天后，使用倒置显微镜检查拟胚体（EB）的形成情况。拟胚体应呈圆形且大小均一。将两到三个10厘米培养皿中的EBs收集到一个50毫升塑料管中。在室温下以300 × g离心5分钟。小心移除上清液，并将EBs重悬于10毫升PBS中。将EBs在室温下以300 × g再次离心，此次离心3分钟。弃去上清液，向沉淀中加入2毫升胰蛋白酶-EDTA。将离心管在37 °C下孵育15分钟。孵育期间，每隔三分钟吹打混匀一次，以获得单细胞悬液。为终止胰蛋白酶反应，加入八毫升 EB 分化培养基。用新鲜 EB 培养基重悬细胞后，加入多聚甲醛至终浓度为 1%。将细胞在室温下旋转孵育 10 分钟。通过加入甘氨酸至终浓度为 0.125 摩尔，淬灭甲醛。按照文中的描述完成固定过程，然后将细胞沉淀物在液氮中迅速冷冻。用新配制的预冷裂解缓冲液轻轻重悬细胞沉淀物，并将试管置于冰上。孵育15分钟后，在4摄氏度条件下以1,000 × g离心5分钟。弃去上清液，并用500 µL冷裂解缓冲液洗涤沉淀。将沉淀重悬于1.5 mL离心管中，加入50 µL含0.5% SDS的1×缓冲液二，然后将离心管置于62摄氏度的加热金属块中。 10 分钟后，将试管从加热块中取出，加入消化缓冲液。用移液器轻轻吹打充分混匀，避免产生过多气泡，然后将试管在 37 摄氏度下孵育。为了确保限制性内切酶的有效消化，本方案中包含了一个重复的消化步骤。因此，将细胞核充分重悬于消化缓冲液中也非常重要。加入另外25 µL消化缓冲液，通过倒置混匀，取8 µL作为未消化对照样品。将未消化对照样品储存在-20 °C条件下。接下来，您将分多次加入限制性内切酶 Mbol 的等分试样，每次加入后在 37 摄氏度下旋转孵育。取 8 µL 作为已消化的对照样品。为解除两个对照样品的交联，向 10 µL 蛋白酶 K 中加入 80 µL TE 缓冲液，在 65 摄氏度孵育一小时。为检测消化效率，在0.6%凝胶上电泳20微升等分试样。成功的消化产物片段大小主要分布在3.0至5.0千碱基对范围内。按照文中的描述，制备用于剪切的DNA。使用超声波破碎仪将DNA剪切至150到700个碱基对的大小。将剪切后的DNA转移至一个新的普通安全锁管中，并合并来自同一样本的多次超声处理产物。加入预热的DNA纯化磁珠，磁珠体积为现有液体体积的1.8倍，通过重悬充分混匀。孵育5分钟后，使用磁力架收集磁珠。将离心管保持在磁力架上，用1毫升新配制的80%乙醇洗涤磁珠两次。室温下空气干燥磁珠2至3分钟后，通过将磁珠重悬于1× Tris缓冲液中洗脱DNA。采用悬滴法，在诱导胚胎干细胞分化六天后获得了均一的拟胚体群体。在整个实验过程中通过凝胶电泳进行质量控制。MboI 酶高效消化可产生小于三千碱基对的片段。连接反应后的电泳显示，大多数片段大于三千碱基对。超声处理后预期片段大小为400至500碱基对。经去磷酸化及单端接头连接后，进行两轮PCR以扩增目标片段。每个靶标分别使用两对不同的引物进行扩增，Pou5f1 位点使用引物 A 和 B，T 位点使用引物 C 和 D。结果产生一条大小约为 400 个碱基对的 DNA 弥散条带。 alternatively，采用多重 PCR 同时扩增靶标 A 和 C，纯化后得到大小相似的片段。在这些 4C 图谱中，浅蓝色方框表示在分化过程中发生动态变化的增强子位置。在 EB 分化过程中，染色质区域与 Pou5f1 和 T 基因的启动子发生互作。Pou5f1 在 EB 分化过程中表达下调。相反，T 在 EB 分化过程中表达上调。高效的限制性内切酶消化以及基因组 DNA 片段的邻近连接是确保本方案成功的关键因素。另一个要点是引物设计，用于检测每个位点的相互作用图谱。该实验步骤特别适用于研究特定基因座的染色质相互作用。若需分析全局性变化，可采用全基因组范围的方法，例如 Hi-C、启动子捕获 Hi-C 或 HiChIP。

identification-enhancer-promoter-contacts-embryoid-bodies

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

通过定量染色体形成捕获（4C）鉴定胚胎体增强剂-促进者接触

Hi-C 方法能够无偏倚地在全基因组范围内鉴定染色质相互作用（1）。Hi-C...

Hi-C：一种研究基因组三维结构的方法

本研究描述了一种生成高分辨率图像的实验方案 原位 紧密分期的原肠胚形成前Hi-C文库 黑腹果蝇...

从精确分期的早期Drosophila胚胎中构建全基因组染色质构象捕获文库

DNA 调控元件（如增强子）通过与靶基因启动子发生物理接触来调控基因表达，这种接触通常通过跨越较大基因组距离的长距离染色体相互作用实现。启动子捕获...

启动子捕获Hi-C：启动子相互作用的高分辨率全基因组分析

鉴定基因与调控元件之间的物理相互作用具有挑战性，但染色体构象捕获技术为此提供了便利。该4C-seq方案的改进通过减少PCR模板的过度扩增，减轻了PCR偏好性，同时通过增加限制性内切酶消化步骤，提高了测序读段的可比对性。...

利用下一代测序技术对染色体构象捕获环化文库（4C-seq）进行基因调控序列的高通量鉴定

CRISPR/sgRNA 文库已应用于研究蛋白质编码基因。然而，sgRNA 文库在揭示 CTCF 边界在基因调控中功能方面的可行性仍尚未探索。本文中，我们描述了一种针对 HOX 位点的特异性 sgRNA 文库，以阐明 CTCF 边界在 HOX...

HOX 基因座靶向的CRISPR/sgRNA文库筛选鉴定关键CTCF边界

基因组在细胞核空间内以不同的结构形式组织，这些结构可通过染色体构象捕获技术揭示。细胞核内Hi-C方法可获得果蝇细胞系中全基因组范围的染色质相互作用数据，从而生成可在限制性酶切片段水平上以兆碱基分辨率进行分析的接触图谱。...

果蝇细胞核内Hi-C技术

本方案描述了染色质捕获结合高通量测序（Capture...

通过捕获式 Hi-C 解析高分辨率 3D 染色质结构 via Capture Hi-C

本文详细介绍了染色体构象捕获（3C）技术的一种改进方法，重点强调本科生的参与和学习过程。...

通过3C获得A：面向本科生的染色体构象捕获技术

基因表达受到基因启动子与远端调控元件相互作用的调控。本文介绍了低起始量的捕获染色体构象捕获技术（liCHi-C）如何实现对稀有细胞类型中这些相互作用的鉴定，而这些细胞类型在此前是无法测量的。...

一种用于在稀有细胞群体中研究以启动子为中心的时空基因组结构的整合工作流程

我们提供一种无需编程的生物学家工作流程，仅使用基于浏览器的工具即可识别组织特异性基因增强子。本方案利用公共的H3K4me1/H3K27ac组蛋白修饰标记和Hi-C数据，使不具备编程经验的研究人员也能够获取、分析并识别与其目标基因相关的潜在调控元件。...

一种用于筛选基因和组织特异性增强子的基于网络的分析流程

本方案提供了一条简化的计算流程，用于定量新生增强子转录本。通过整合染色质可及性、染色质特征和转录数据，该方法能够在复杂的基因内区域实现对增强子活性的准确检测和链特异性分析，同时适用于不具备深入生物信息学训练背景的研究人员。...

小鼠胚胎干细胞中基因间/基因内增强子RNA定量的计算分析流程

了解定量染色体构象捕获技术，用于分析胚胎体中增强子与启动子区域的染色质相互作用频率。该方法结合高通量测序，为研究分化过程中的基因调控机制提供重要工具。

通过定量染色体构象捕获技术（4C）鉴定类胚体中的增强子-启动子相互作用

探索更多视频