用于活、完整组织中细胞分部分析的果蝇拉瓦尔和普帕尔睾试验的制备

该协议可用于利用荧光显微镜分析活的、完整的组织背景下细胞分裂的机制。该技术的主要优点是保留了细胞的原生生理环境，同时还允许在长时间的课程内进行活体成像。这项技术最重要的部分是确保睾丸在解剖或安装过程中不会损坏。

这是一种用一点时间和实践获得的技能。此方法的视觉演示至关重要，因为它演示了如何识别和隔离睾丸，以及如何在不损害组织的情况下安装睾丸进行成像。准备手稿中描述的动物、工具和介质。

在开始解剖之前，使用充满介质的过滤注射器在玻璃滑梯的顶部、中间和底部排出三滴介质，每 50 微升。使用解剖探针，将五到十分之一的星体幼虫或早期幼虫转移到幻灯片上介质的顶部掉落。用解剖探针轻轻搅动介质中的幼虫和幼虫，以清除任何食物或碎屑。

使用解剖探针将单个幼虫或幼虫侧翻。寻找两个双边睾丸，在身体的后三分之一上显示为半透明的椭圆形结构。缺乏睾丸的动物是女性，应该丢弃。

当发现雄性幼虫或幼虫并清洁时，将它移动到第二滴介质。重复，直到三或四个雄性幼虫或幼虫被转移到第二滴介质。然后在第二滴介质中工作，抓住一只动物，在它的中区用一对钳子，就在睾丸的前部。

使用第二对钳子轻轻地将动物撕成两半。使用一对钳子，将动物的后端放在玻璃滑梯上。从钳子旁边开始，使用手术刀的边缘向下推角质层。

将手术刀移向动物的切端。这将驱逐动物的内部器官，包括肠道、脂肪身体和睾丸。睾丸是无色和几乎透明的椭圆形器官嵌入在脂肪身体的丝带。

轻轻地把睾丸与其他器官分开。要一次转移一个睾丸，请将手术刀的边缘插入脂肪体下，将组织从介质中提起，并快速将其移动到第三滴。如果没有足够的脂肪身体仍然附着在睾丸上，用手术刀抬起组织使用玻璃巴斯德移液器，已经预先洗过解剖介质。

在第三滴介质中工作，使用手术刀的尖端轻轻地将多余的脂肪体从睾丸中切开，在边缘周围留下一小块脂肪身体边缘。首先，使用过滤注射器将施耐德的一滴介质（约30微升）沉积到50毫米气体渗透培养皿的中心。使用手术刀工具或预洗的巴斯德移液器将多达五个准备好的睾丸转移到盘子上的掉落。

接下来，使用手术刀工具轻轻地将睾丸向下推至气体渗透膜上，并插入介质掉落的中心。使用一毫升注射器，将四滴卤化碳油放在介质滴周围的气体渗透膜上。掉落的位置应对应于 22 毫米类盖玻片的四个角。

然后将 22 毫米玻璃盖玻片的角与四滴卤化碳油对齐，然后轻轻地将盖玻片降至介质和机油上。让盖玻片沉淀，让包含睾丸的介质在油滴之间扩散。将培养皿放在解剖显微镜下。

要去除多余的介质，请将细腻任务一角插入盖玻片下。Wick 远离足够的介质，使玻璃盖玻片与最大的睾丸表面接触。请勿取出太多介质，请将盖玻片降低得太远。

这将对睾丸施加压力，并可能导致睾丸破裂。最后，在测试仪上方的玻璃盖玻片上放置一滴浸入油。翻盘，放在显微镜舞台上。

将 40 或 60 X 显微镜目标移入机油中，直到其位于睾丸正下方。使用透光查找单个睾丸并聚焦。将 0.5 毫升 8% 甲状甲醛放在 PBSTx 中的一个井中，放在九井解剖盘中的一个井中。

使用玻璃巴氏移液器将多达 10 个睾丸转移到井中。确保睾丸位于井底。20 分钟后，将睾丸转移到含有 0.5 毫升 PBSTx 的井中。

轻轻搅拌五分钟，清洗睾丸。用新鲜的PBSTx在新井中清洗两次。如手稿所述，在1.5毫升微离心管中准备稀释原抗体。

然后将睾丸从九井玻璃解剖盘转移到管子上。在四摄氏度下用柔和的摇动或螺母孵育管子过夜。用二次抗体染色睾丸的程序相似。

有关详细信息，请参阅手稿。首先，使用巴斯德移液器，将睾丸从九井板转移到玻璃显微镜幻灯片上。如有必要，使用手术刀的边缘将睾丸向下推至幻灯片表面。

接下来，使用精细任务擦拭的一角，将多余的液体从睾丸中清除。尽可能多地去除液体。然后将 30 至 50 微升的显微镜安装介质应用到睾丸上。

最后，在安装介质的掉落上放置一个 22 毫米的盖玻片。让盖玻片沉淀，让安装介质在盖玻片下扩散。如有必要，对盖玻片施加温和压力，以挤出多余的安装介质，让盖玻片放在睾丸表面。

当此协议成功执行时，睾丸的细胞组织将保留，并且从睾丸的一端到另一端的细胞分化进展是可见的。精子细胞即将开始美病和那些在元相可以识别。在使用本协议准备的睾丸中，实时成像分析显示内质性细胞和微管在分体精子细胞中的动态重组。

如协议所述，必须非常小心，不要施加导致睾丸爆裂的压力。精子细胞的囊肿迅速从破裂的睾丸中流出，使活时间推移成像变得困难。该协议优化了成像分裂精子细胞在活的，完整的组织。

因此，在解剖或安装过程中，睾丸不得损坏，这一点至关重要。我们的方法还应适用于超分辨率成像技术，如结构化照明显微镜，为控制细胞分裂的动态亚细胞过程提供新的见解。