Name: 特勒奥茨的嗅觉神经的细胞外多单元记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 学习使用细胞外多单元记录技术评估海洋鱼类的嗅觉敏感性。该方法通过记录嗅觉神经的初级感觉输入，独立于外部盐度，可适用于不同物种和环境条件的研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作获得阿尔加维地区运营计划——CRESC 阿尔加维 2020 的欧洲区域发展基金（FEDER）资助，以及葡萄牙科学技术基金会（FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia）通过项目 ALG-01-0145-FEDER-30262、FCT 项目 PTDC/BIA-BMA/30262/2017、UID/Multi/04326/2019 和 DL57/2016/CP1361/CT0041（授予 ZV）的国家资金支持。

动物的饲养和实验在经过认证的实验设施中进行，并遵循葡萄牙国家立法（DL 113/2013），由葡萄牙农业、农村发展和渔业部下属的兽医总署颁发的“第一类”许可证授权执行。由于本方案涉及动物操作，必须获得监管科学实验中动物福利的本地和/或国家机构的批准，此外，研究人员还需具备相应的培训资质和许可证，方可开展此类操作。
1. 刺激准备
注意：大多数鱼类具有高度敏感的嗅觉系统，因此在制备实验所用的嗅觉刺激物时必须格外小心。用于配制刺激物的玻璃器皿应使用5%漂白剂（次氯酸钠）清洗，再用自来水彻底冲洗并晾干。使用前立即用海水（与配制刺激物稀释液相同的水）对玻璃器皿进行充分冲洗。注意避免该海水接触裸露皮肤。
<ol>
	<li>配制 100 mL 的 10-2 M L-谷氨酰胺、L-亮氨酸和 L-丝氨酸溶液；每种溶液分装 1 mL 至离心管中，于 -20 °C 保存备用。</li>
	<li>实验当天，使用对照组和高 CO2 海水，将上述储存液稀释成 10-3 M 至 10-7 M 的系列浓度溶液（按 10 倍梯度稀释）。 
	注意：L-丝氨酸（10-3 M）将作为阳性对照或标准品。用于配制刺激物稀释液的海水，其处理方式与刺激物完全相同但不添加任何气味物质，作为阴性对照或空白对照。</li>
</ol>
2. 对照组和高 CO2&#160;水的制备

<ol>
	<li>通过收集1 L经活性炭过滤的海水来制备对照组海水。
	<ol>
		<li>使用pH探针检测pH值；pH值应约为8.2。若不符合，用大气空气鼓泡直至达到该pH值。</li>
		<li>使用碱度滴定仪测定水的碱度。</li>
		<li>测量水的温度和盐度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过过滤1 L海水，然后鼓入CO2直至达到目标pH值，来制备高CO2海水。
	<ol>
		<li>使用pH探针检测pH值；pH值应约为7.7。</li>
		<li>使用碱度滴定仪测定水的碱度。</li>
		<li>测量水的温度和盐度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用专为计算水中CO2参数设计的软件（例如CO2Calc软件13），测定对照组和高CO2水中CO2分压。
	<ol>
		<li>在输入窗口中输入水的pH值、温度、盐度和总碱度（图1）。</li>
		<li>选择常数、单位和标度（参见图2中推荐的数值）。</li>
		<li>点击处理按钮以确定CO2分压。 
		注意：图3展示了一个结果表的示例。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 鱼类的准备
注意：本方案中使用体重为 200−400 g 的 seabream。
<ol>
	<li>将鱼浸入含有 MS222（乙基-3-氨基苯甲酸甲磺酸盐）的充气天然海水中进行麻醉。当尾部夹捏刺激无反应时，向侧腹肌肉注射神经肌肉阻断剂三碘季胺酚（10 mg·kg-1，溶于生理盐水中）。 
	注意：不同物种所用麻醉剂浓度有所不同；对于体重为 200−400 g 的 seabream（真鲷），使用 200 mg·L-1 的 MS222，并用 400 mg·L-1 NaHCO3 缓冲。</li>
	<li>将麻醉后的鱼放置在带软垫的支撑物上。支撑物的具体形状和大小取决于实验鱼种；对于体重为 200−400 g 的 seabream（真鲷），可使用实验室自制的带衬垫 V 形支撑架。</li>
	<li>将一根硅胶管（直径 = 10 mm）插入鱼口，连接至盛有含麻醉剂且已充气海水中潜水泵的储液槽，并以约 100 mL·min-1·kg-1 的流速将海水泵送至鳃部。 
	注意：所用硅胶管的尺寸需根据鱼体大小进行调整。</li>
	<li>将接地针插入侧腹肌肉，并连接至放大器的前置放大头段。</li>
	<li>用湿润的布（或纸巾）覆盖鱼体，仅暴露头部，确保覆盖物不会阻碍水流从鳃部流出。 
	注意：眼睛可用湿润的纸片/布料或黑色塑料片覆盖。</li>
	<li>将刺激递送系统的导管（即连接背景海水源的玻璃管）插入鼻孔。 
	注意：可使用微毛细管（长度 = 75 mm，内径 = 1.15 mm，外径 = 1.55 mm）；对于体型较小的鱼，可用电极拉制仪将其拉成更细的尖端。在手术过程中（如下所述），必须确保嗅上皮保持湿润。</li>
	<li>在解剖显微镜（置于法拉第笼内）下，借助牙科钻（理想选择）或 hobby 钻（如 Dremel）或珠宝商抛光器（配备牙科钻头），去除两眼之间颅骨的皮肤和骨骼，以暴露嗅神经（嗅神经通常在两眼之间并行走行）。
	<ol>
		<li>对于 seabream（真鲷），使用圆锯从眼睛前方稍远处至后方稍远处，切除眼睛正上方的颅骨部分；然后使用钻头去除两眼之间的骨骼，嗅神经即位于两眼之间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当足够多的骨骼被清除后，使用精细镊子小心去除覆盖在神经上的脂肪和结缔组织，注意避免损伤神经或刺破任何血管。 
	注意：操作经验有助于提高解剖精度；解剖范围越小，制备样本越稳定。然而，必须清除足够的组织；对于初学者，当嗅球刚刚可见时，应再向前稍作清理，以暴露神经与嗅球连接的部分，便于电极的准确定位。</li>
	<li>使用前需清洁电极：将电极连接至 3 V 直流电源（例如两节串联的 AA 电池）的负极，并将电极尖端浸入生理盐水（或用淡水稀释 1:3 的海水）中 20−30 秒；此时应可见尖端持续释放细小气泡。</li>
	<li>暴露嗅神经后，将记录电极（固定于显微操作器上）置于能对标准刺激物（例如 10-3 M L-丝氨酸）产生最大反应、对空白刺激产生最小反应的位置。使用聚对二甲苯涂层钨电极（材料表），并将其连接至交流（AC）前置放大器的头段。 
	注意：在 seabream（真鲷）中，通常将电极置于神经外侧、靠近其与嗅球连接处时，对氨基酸的反应最强。这一规律可能也适用于其他物种，因为不同物种间嗅球的小球状结构组织总体相似。然而，实践经验始终是最好的指导。</li>
</ol>
4. 电生理记录
注意：与大多数电生理实验一样，多通道记录需要在法拉第笼内进行。然而，细胞外记录通常不需要防震台，因为大多数震动将来自鱼类本身。尽管如此，仍需要一个坚固稳定的、带有金属表面的实验台，以便固定显微操作器支架的磁性底座。
<ol>
	<li>建立一个刺激递送系统，以实现从洁净背景水到含刺激物水的快速切换，例如使用电磁阀控制的三通阀。将公共出口连接至输送水流至嗅觉瓣膜的管道，并将一条管路置于海水储液罐中，另一条置于待测溶液中。 
	注意：当通过施加直流电流切换阀门时，水流将从背景水切换至含有气味物质的溶液。刺激持续时间应足够长，以观察到积分反应的明显峰值，随后出现适应期；本实验方案中使用的刺激时间为 4 秒，但具体时间可能需根据物种不同而适当延长。</li>
	<li>将阀门驱动器连接至模数转换器（例如 Digidata）的触发端口；当阀门从背景水切换至含刺激物管路时，将启动数据记录。配置软件在触发事件发生时开始记录，并持续预定时间（例如 10 秒）。 
	注意：10 秒通常已足够，但可根据具体实验需求适当缩短或延长。</li>
	<li>通过重复测试标准物质（本例中为 10-3 M L-丝氨酸）的反应（记录并测量积分反应的幅度），检查制备样本的稳定性，且每次刺激之间间隔 1 分钟。 
	注意：反应幅度的稳定性在一定程度上取决于物种和气味物质，但通常应保持在彼此相差不超过 10% 以内（经验法则），且反应应具有快速起始、迅速达到最大活性，并在刺激停止后迅速恢复至基线水平（图 4）。</li>
	<li>在对照海水条件下，按浓度由低至高的顺序记录嗅神经对氨基酸的反应，且每次刺激之间间隔 1 分钟。 
	注意：对于某些物种和/或某些气味物质，可能需要更长的间隔时间。但对于氨基酸和 seabream（真鲷），1 分钟已足够。</li>
	<li>记录对 10-3 M 丝氨酸及对照空白水溶液的反应。</li>
	<li>通过将背景管路插入高 CO2 海水瓶中，将背景水由对照海水更换为高 CO2 海水。 
	注意：建议在刺激管路和背景管路末端插入另一段血细胞比容管（或等效装置），以避免管口脱离液面，确保管路末端始终浸没在液体中。</li>
	<li>在测试嗅神经在高 CO2 海水中对氨基酸的反应之前，需先用高 CO2 水对嗅上皮进行预处理，即让高 CO2 水流经嗅上皮数分钟，以实现适应。 
	注意：根据经验，对于 seabream（真鲷），5 分钟的预处理时间已足够。</li>
	<li>在高 CO2 海水中，按浓度由低至高的顺序记录嗅神经对氨基酸的反应。</li>
	<li>记录对高 CO2 空白水溶液的反应。</li>
	<li>记录对 10-3 M 丝氨酸及对照空白水溶液的反应。 
	注意：原始信号（神经活动）应经过滤波处理（低通约 2,000−5,000 Hz，高通 50−300 Hz），并传送至模数转换器（材料表）。为便于神经活动的量化，原始信号还可通过漏电积分器（材料表）进行积分处理，再送入模数转换器，最终将原始信号和积分信号同时传输至运行相应软件（例如 Axoscope）的计算机中。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>从所有刺激反应的积分幅度（单位：mV）中减去空白对照反应的积分幅度。</li>
	<li>通过将各刺激反应的幅度除以标准刺激（10-3 M 丝氨酸）的反应幅度进行归一化处理，以减少个体间和个体内鱼类的变异性。</li>
	<li>根据公式 log(N + 1.5) = alog C + B，对浓度-反应曲线（半对数坐标图）进行线性回归分析，计算检测阈值，其中 C 为摩尔浓度，N 为归一化反应幅度，a 和 b 为常数7,14。 
	注意：检测阈值即为当 y = 0.1761（即 log 1.5；N = 0）时对应的 x 值，表示可引发反应的最低浓度（即鱼类能够嗅到该气味物质的浓度）。某些气味物质在半对数坐标图中呈现S型浓度-反应曲线（例如钙离子15,16）；此时，可将归一化数据拟合至三参数Hill方程，从而获得最大反应幅度和EC50值（即产生半最大反应的气味物质浓度，亦为敏感性的一种度量指标）。</li>
	<li>比较在对照水和高CO2水中测试的刺激物的检测阈值和/或最大反应幅度及EC50值。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究描述了从海鲷（S. aurata）嗅神经进行多单位（细胞外）记录的方法，海鲷是一种在水产养殖中具有重要意义的海洋鲷科鱼类。然而，该实验方法可广泛适用于其他鱼类；手术操作及电极的精确定位显然取决于嗅觉系统的解剖结构，而麻醉剂的种类和浓度则可能因研究物种的不同而有所调整。例如，金鱼（Carassius auratus）的嗅神经较短，在这种情况下，从嗅球记录脑电图（EEG）会更为方便。所选用的气味物质也可能在一定程度上依赖于物种。本研究采用了氨基酸作为刺激物。据作者所知，迄今为止研究过的所有鱼类物种均对氨基酸具有嗅觉敏感性1,18。这种敏感性已被证实参与多种生理过程，如觅食、化学通讯以及对出生水域的识别19,20,21,22,23。然而，不同物种之间的嗅觉敏感性总体上较为相似，并不依赖于其生活方式或栖息环境。此外，氨基酸是结构明确的分子，价格低廉且易于获取。这些特点使其成为研究鱼类嗅觉的理想测试刺激物，尤其是在研究人为干扰因素（如海洋酸化或污染）影响的研究中，便于在不同物种之间进行结果比较24。
根据所研究的物种不同，多单位记录的制备可维持数小时的稳定性；对内标物（本研究中为10-3 M L-丝氨酸）的反应幅度在连续测试之间不应变化超过10%。若明显偏离此经验法则，可能原因包括：(i) 鱼类移动，从而导致电极和/或鼻管发生位移；(ii) 水体污染，例如因接触实验人员的手部所致（尤其当某一气味物质的较低浓度引发的反应强于较高浓度时）；或 (iii) 制备样本的健康状况恶化。对于情况(i)，应检查鱼类是否发生移动；若已移动，则重新定位，并向水中添加更多麻醉剂和/或追加一次加拉明三碘化物剂量。静置5分钟后重新测试标准刺激。若反应仍偏低，则重新调整电极和/或鼻管位置，直至记录到足够大的反应。对于情况(ii)，只需使用洁净的玻璃器皿和水重新配制新鲜的气味物质稀释系列。对于情况(iii)，应检查流经鱼鳃的水流是否充足，确认水流确实通过鳃并从鳃盖排出（而非从口部流出），且水体充分供氧。不同鱼类物种对温度的偏好差异较大；应确保实验室温度（以及与鱼体接触的水温）尽可能接近鱼类日常饲养的温度。同时应确保鱼类未受应激，并在记录前至少一周内避免移动（即使是从一个水箱转移至另一个水箱）。电噪声当然是电生理学家的主要困扰；然而，本文并非讨论如何克服或减少电噪声的合适载体。尽管如此，制造商网站可免费下载的《Axon指南》（The Axon Guide，PDF格式）提供了有关降低噪声的实用建议。当标准刺激能够引发大而稳定的反应，且浓度梯度测试呈现出随浓度升高而反应幅度递增的趋势，同时对空白对照的反应极小，此时即可开始记录测试刺激的反应。部分研究者会对同一刺激重复给予三次，并计算算术平均值用于后续数据分析。然而，这些属于技术重复，该方法会使记录会话时间延长三倍。本文作者倾向于对特定气味物质仅测试一次，但始终将其作为浓度-反应曲线的一部分进行测试。这不仅可计算检测阈值或EC50（如前所述），还能确保测试了接近鱼类在自然环境中可能接触的浓度（这些浓度并不总是已知的）。此外，因污染等原因导致的异常反应值更容易被识别；必要时可使用新配制的样品重复测试。
对嗅神经进行多单位记录可能具有侵入性，但当在海水中记录时，其灵敏度高于EOG7，因为它不受外界盐度的影响。因此，该方法可用于评估嗅觉系统对气味物质（如钙和钠）的敏感性，这些离子浓度的变化也会影响电导率，从而影响所记录的电压15。作为对响应特定气味的嗅觉受体神经元（ORNs）数量的估计（即动作电位沿ORN轴突从嗅上皮向嗅球传导），它代表了一种原始的、未经处理的信号（嗅觉输入的初步处理始于嗅球）。因此，与EOG或EEG相比，它是评估污染物（如重金属）以及环境变化（如pH值）对嗅觉系统直接影响的更佳参数24,25。在高PCO2（因而低pH值）的海水中记录嗅球活动时，可能会受到pH值对中枢神经处理的中央效应影响；这涉及海洋酸化的“GABAA受体理论”26，即水体pH降低导致脑脊液中Cl-和HCO3-离子的重新分布，从而使GABA能激活由抑制性（超极化）转变为兴奋性（去极化）。此外，在此类研究中，使用鱼类在自然环境中可能遇到的气味物质浓度来评估酸化或污染物的影响至关重要。对于氨基酸而言，这一浓度范围为纳摩尔至微摩尔级27,28,29，接近鱼类对这些化合物的检测阈值1,18。估算特定气味物质的检测阈值，有助于了解嗅觉敏感性的生物学重要性或功能。例如，海七鳃鳗（Petromyzon marinus）对幼体释放的特定胆汁酸具有极高的嗅觉敏感性，检测阈值低至10-13 M30；这种敏感性使成年个体能够定位并识别合适的产卵场所，因而可作为远距离迁移的信息素。同样，成熟的雌性海七鳃鳗对精胺（spermine）具有高度嗅觉敏感性（阈值为10-14 M），这是一种雄性在精液中释放的多胺，可吸引雌性前往正在排精的雄性巢穴31。其他鱼类也对多胺类物质具有嗅觉敏感性32,33,34,35，但其检测阈值不够低，不足以支持类似的信息素作用；相反，推测其功能可能是帮助鱼类避开腐烂的尸体。然而，鉴于如此高的嗅觉敏感性，即使嗅觉反应幅度未显著降低，轻微的敏感性下降（即检测阈值升高）也可能给鱼类带来严重问题24。
当以半对数形式绘制时，气味物质的浓度-反应曲线可以呈指数型、线性或S型18。对于氨基酸而言，此类半对数浓度-反应曲线通常为线性（即对数关系）、S型或幂函数关系7。反应未出现饱和现象（即在浓度-反应曲线上未见平台期，即使在高于环境浓度的条件下）的原因，可能是多种受体可根据氨基酸浓度的不同而结合同一种氨基酸，而非每种氨基酸仅与特定受体结合；随着某一特定氨基酸浓度的升高，能够与其结合并产生反应的受体数量也随之增加。然而，鱼类仍可区分不同组成的氨基酸混合物36,37,38,39；这很可能归因于嗅球中产生的组合性神经活动模式12,40；所有表达相同受体蛋白的嗅觉神经元（ORN）的轴突均终止于嗅球内的相同小球结构（glomeruli）41,42，而单一种氨基酸可激活多个小球结构。
然而，某些高度特异性的气味分子（如信息素）可能会引发S形或准S形的浓度-反应曲线43,44。尽管这一推论尚未经过实证检验，但推测其原因是这些嗅觉反应依赖于高度特异性的受体，这些受体主要结合信息素分子而几乎不结合其他物质。因此，当浓度达到某一水平后，所有受体均被占据，进一步增加浓度将不会在其他嗅觉神经元（ORNs）中引发额外反应。因此，这些数据可拟合为三参数的Hill方程曲线，并可计算最大反应值、EC50以及Hill系数15,45,46。这种方法可提供线性或指数型浓度-反应曲线无法获得的重要信息，例如表观亲和力和表观受体数量。

鱼类在觅食、躲避天敌、评估潜在配偶以及迁徙等多个生活环节中高度依赖嗅觉功能1,2,3。因此，评估鱼类的嗅觉敏感性（它们能感知哪些气味？对这些化合物的敏感程度如何？）对于全面理解这些生理过程至关重要。此外，人类活动对环境造成的影响，例如海洋酸化和污染，可能对嗅觉系统产生深远影响，即使在亚致死浓度下也可能如此，因为嗅觉系统必然与周围水体密切接触4。在活体中进行电生理记录是评估鱼类嗅觉敏感性的首选实验方法。目前主要有三种技术：嗅觉上皮电图（EOG）、从嗅球记录的脑电图（EEG），以及嗅神经的多单位电活动记录5。
在这三种方法中，EOG 是应用最广泛的一种6。它是一种在嗅上皮上方记录到的直流（DC）场电位，被认为是由那些对特定气味物质产生反应的嗅觉感受神经元（ORNs）的发电电位总和所形成。然而，由于该信号是在水中而非鱼体内部记录的，因此其反应幅度不仅取决于鱼体产生的信号，还受周围水体导电性的影响；导电性越高（或电阻越低），记录到的幅度就越低。这意味着 EOG 在海水中的敏感性可能低于在淡水中7。
从嗅球记录的脑电图（EEG）也广泛用于鱼类嗅觉研究。然而，嗅球是嗅觉感觉输入的一级处理中枢8，其结构高度组织化，形成多个嗅小球，因此记录到的反应在很大程度上依赖于记录电极的位置。例如，检测氨基酸的嗅觉受体神经元（ORNs）输入由嗅球外侧区域的嗅小球处理，而来自同种个体释放的化学物质的输入则导向内侧区域9,10,11,12。信息素输入可能被导向嗅球内高度局限的特定嗅小球。此外，由于不同物种的解剖结构存在差异，针对特定气味分子的理想记录位置可能难以接近。
对嗅神经进行多单位记录可避免上述EOG和EEG存在的主要问题。由于该方法记录的是嗅觉感受神经元（ORNs）轴突从嗅上皮向嗅球传递的动作电位，因此属于初级感觉信号。同时，由于信号在鱼体内记录，其反应幅度不受外界盐度影响。然而，该方法当然也存在一些缺点：首先，根据物种解剖结构的不同，暴露嗅神经所需的手术操作通常比EOG更为复杂；其次，由于信号幅度较EOG更小，因此需要略为精密且成本更高的设备。John Caprio5对其他实验方法进行了概述。本文旨在以海鲷（Sparus aurata）对氨基酸类气味物质的体内嗅神经细胞外多单位反应记录为例，介绍该技术的操作流程，并说明如何识别和克服此类实验中常见的一些问题。

<table><tbody><tr><td>交流前置放大器</td><td>Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK)</td><td>NL104</td><td>专为此类记录设计的Neurolog前置放大器。</td></tr><tr><td>Digidata</td><td>Molecular Devices, LLC. (San Jose, CA, USA)</td><td>1440A</td><td>模数转换器。</td></tr><tr><td>肌电积分器</td><td>Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK)</td><td>NL703</td><td>用于积分神经原始活动的“漏电式”电子积分器。</td></tr><tr><td>法拉第笼</td><td>自制</td><td></td><td>用于减少电噪声。</td></tr><tr><td>滤波器</td><td>Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK)</td><td>NL125/6</td><td>用于电生理记录的滤波模块。</td></tr><tr><td>三碘季胺酚（Gallamine triethiodide）</td><td>Sigma-Aldrich (Portugal)</td><td>G8134</td><td>神经肌肉阻断剂</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich (Portugal)</td><td>G3126</td><td>用作气味物质的氨基酸</td></tr><tr><td>L-亮氨酸</td><td>Sigma-Aldrich (Portugal)</td><td>L80000</td><td>用作气味物质的氨基酸</td></tr><tr><td>L-丝氨酸</td><td>Sigma-Aldrich (Portugal)</td><td>S4500</td><td>用作气味物质的氨基酸</td></tr><tr><td>金属底板</td><td>任意</td><td></td><td>为显微操作器提供支撑基础。</td></tr><tr><td>微量毛细管</td><td>任意</td><td></td><td>用于将供水定位至嗅上皮。</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Narishige International Ltd (London, UK)</td><td>M-152</td><td>用于定位电极。</td></tr><tr><td>MS222（间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）</td><td>Sigma-Aldrich (Portugal)</td><td>E10505</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>pH探针</td><td>Hanna instruments (P&amp;oacute;voa de Varzim, Portugal)</td><td>HI12302</td><td>用于测量水的pH值的探针。</td></tr><tr><td>折射仪</td><td>Hanna instruments (P&amp;oacute;voa de Varzim, Portugal)</td><td>HI96822</td><td>用于测量水盐度的折射仪。</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich (Portugal)</td><td>746398</td><td>用于配制生理盐水溶液。</td></tr><tr><td>电磁阀</td><td>The Lee Co. (Essex, CT, USA)</td><td>LFAA1201618H</td><td>用于在背景水和刺激溶液之间切换（已停产）。</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Zeiss, Leica, Olympus</td><td>任何合适型号。</td><td>用于解剖和电极放置。</td></tr><tr><td>滴定仪</td><td>Hanna instruments (P&amp;oacute;voa de Varzim, Portugal)</td><td>HI84531</td><td>用于测量水的碱度、pH值和温度的滴定仪。</td></tr><tr><td>钨微电极 0.1 M&amp;Omega;</td><td>World Precision Instruments (Hitchin, UK)</td><td>TM31A10</td><td>细胞外电极。</td></tr><tr><td>电磁阀驱动器</td><td>自制</td><td></td><td>为电磁阀工作提供12 V直流电源。</td></tr><tr><td>水泵（潜水式）</td><td>任意</td><td></td><td>用于向鱼类鳃部供应含麻醉剂的水。</td></tr></tbody></table>

硬骨鱼类嗅神经的细胞外多单位记录

Extracellular Multi-Unit Recording from the Olfactory Nerve of Teleosts

近期研究表明，海洋酸化会影响鱼类依赖嗅觉的行为。这可能部分归因于在高PCO2/低pH水体中嗅觉敏感性降低。为评估海洋酸化对海洋鱼类嗅觉敏感性的影响，我们建议采用嗅神经的细胞外多单位记录作为首选方法。尽管该方法具有侵入性，但其灵敏度高、结果稳健、可重复性强，且不受外界盐度影响（例如，与嗅觉电图[EOG]不同）。此外，该方法可在任何中枢处理之前记录进入中枢神经系统（CNS）的初级感觉输入。我们展示了利用多种氨基酸构建浓度-反应曲线并计算检测阈值，该方法可揭示嗅觉敏感性的降低，且这种降低具有暂时性和气味依赖性。

阳性对照（10-3 M L-丝氨酸； 图4A）以及阴性对照（空白； 图 4B) 记录自真鲷嗅神经的信号如图所示 图 4. 在刺激出现时（黑色水平条；位于嗅腔内，与嗅上皮接触），注意活动性迅速增强（表现为整合信号向上偏转），在刺激开始后约一秒钟内达到峰值，随后进入适应期（此时刺激仍持续存在），当刺激结束后活动性恢复至基线水平。反应的绝对振幅高度依赖于电极位置；若记录到低振幅反应，可尝试调整电极位置。达到峰值活动的速度较慢，可能是由于输送含刺激物水样的管道距离嗅上皮过远所致；可尝试将鼻管移近嗅上皮（但不接触）。需注意，相比之下，空白对照几乎不引发或仅引发微弱反应。若空白对照出现显著的正向反应（即活动性增加），可能提示用于配制刺激物稀释液的水受到污染；使用洁净水（及玻璃器皿）重新配制新鲜稀释液通常可解决此问题。若问题仍存在，可能需要对供水系统（包括活性炭过滤器）进行更彻底的清洗。出现负向反应（即活动性降低）可能提示在切换阀门时流速发生轻微变化，例如阀门堵塞所致。
典型的浓度-反应曲线（半对数坐标绘制），本例中为 L-白氨酸（10-7 M 到 10-3 M），如图所示 图5A注意，随着气味剂浓度的增加，活动水平随之显著增强，因而整合反应的幅度也相应增大。归一化数据及其相应的线性回归曲线如图所示。 图5B检测限的估计值可根据该数值计算得出 x 当 y = 0.1761（即 log1.5；其中 N = 0）。在此情况下，该值为 -7.48；即该鱼类中 L-亮氨酸的计算阈值为 10-7.48 M. 指数 α 同样可以通过在双对数图上对归一化数据进行线性回归来估算；logN = αlog[气味分子] + 常数。参数γ表示使反应幅度增加一个对数单位所需增加的气味分子浓度；即，它是浓度-反应曲线陡峭程度的估计值。17在此示例中，α = 0.277 且 γ = 3.61；因此，要使反应幅度增加十倍（即一个对数单位；log10 = 1），刺激浓度需增加 103.61-倍（4,074倍）。
以半对数方式绘制的典型S形浓度-反应曲线（图6A），在此以L-谷氨酰胺为例，如图6B所示。可观察到类似的反应幅度随浓度增加而上升的现象；然而，在较高浓度下，增幅逐渐减小，最终使反应幅度达到最大值（Nmax）。因此，数据可拟合至三参数Hill方程： 
<img alt="配体结合曲线方程；N/Nmax=[odorant]^n/(EC50n+[odorant]^n)；公式示意图。" src="/files/ftp_upload/60962/60962eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程1">
这样，EC50 （引发50%最大反应的气味剂浓度）以及Hill系数（用于衡量S型曲线线性部分斜率陡峭程度的指标）均可被计算。
<img alt="CO2Calc 界面，用于碳酸盐体系计算的手动输入字段，包括 pH 和 TA 值。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：显示 CO2Calc 程序输入窗口的软件截图。 标红框部分为进行碳酸盐参数计算所需的输入字段。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="CO2 计算参数设置界面，包含以下参数：常数、pH 标度、硼、气-海通量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：软件界面截图，显示适当常数、单位和标度的输入窗口。 图中所示数值为建议值，适用于所述实验所进行的条件；这些数值可能发生变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="海洋化学输入-输出表；盐度、碳酸盐水平、CO2通量、温度分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：显示结果窗口的软件截图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="神经信号分析示意图：对10^-3 M L-丝氨酸与空白对照的综合反应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：在活体海鲷嗅觉神经中通过细胞外记录获得的对10-3 M L-丝氨酸（A）和空白对照（B）的典型多单位反应。 上方曲线显示综合反应，下方曲线显示原始（神经）信号。刺激施加于嗅觉上皮（水平条）。注意在1秒暴露期间活动迅速增加、达到峰值，随后进入适应期（此时仍持续给予气味物质），当停止给予气味物质后，活动恢复至基线水平。使用与气味物质稀释液处理方式相同的水进行刺激时，除添加任何气味物质（空白）外，几乎未见或完全未见活动增加。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经对 L-亮氨酸浓度的反应；包含神经信号图（A）和对数分析图（B）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：体内从嗅神经记录的 L-亮氨酸典型的浓度-反应曲线。（A）当施加于嗅上皮的 L-亮氨酸浓度（水平条）从 10-7 M 增加至 10-3 M 时，神经活动随之增强。上方图迹显示整合后的反应，下方图迹显示原始（神经）信号。（B）将归一化数据以半对数方式绘图并进行线性回归（R2 = 0.97），用于计算检测阈值，即当 log(N + 1.5) = 0.1761 时（即 N = 0）对应的 log[L-亮氨酸] 值。在本示例中，该值为 -7.48；因此，该鱼类对 L-亮氨酸的估计检测阈值为 10-7.48 M。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="L-谷氨酰胺剂量-反应；神经信号与浓度；整合信号，EC₅₀，图谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图6：体内从嗅神经记录的L-谷氨酰胺典型浓度-反应曲线。（A）当施加到嗅上皮的L-谷氨酰胺浓度（水平条）从10-7 M增加至10-3 M时，神经活动随之增强。上部迹线显示整合后的反应，下部迹线显示原始（神经）信号。（B）归一化数据拟合三参数Hill方程的半对数图（R2 = 0.99）。本示例中，计算得EC50 = 3.11 µM，Hill系数 = 0.565。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

对嗅神经进行细胞外多单位记录是评估海洋鱼类嗅觉敏感性的敏感、可靠且可重复的方法。该方法记录初级感觉输入，且不受外界盐度的影响。

近期研究表明，海洋酸化会影响鱼类的嗅觉驱动行为。这可能部分归因于嗅觉功能的下降……

这是评估海洋鱼类嗅觉敏感性的最可靠且最敏感的方法，因为它记录的是中枢神经系统（CNS）进行任何处理之前的纯感觉信号。该技术的主要优点在于其高灵敏度，并且可以轻松地应用于来自不同环境的其他物种，而不受外界盐度的影响。制备对照用水时，收集一升经活性炭过滤的海水，并使用pH探针检测其pH值。pH 值应在 8.2 左右。如果不在该范围，需用大气空气吹扫海水，直至 pH 达到 8.2。接着，使用碱度滴定仪测定水的碱度，然后测量水温与盐度。为制备高二氧化碳海水，先将一升海水通过颗粒状失活活性炭滤器过滤，然后通入二氧化碳气体，直至达到目标 pH 值。使用 pH 探针检测 pH 值，应约为 7.7，随后使用碱度滴定仪测定水体的碱度，并测量水温与盐度。为确定对照组和高二氧化碳组水体中的二氧化碳分压，打开专用于计算水中二氧化碳参数的软件程序，并在输入窗口中输入水体的盐度、温度、压力、总碱度和 pH 值。然后选择常数、量程和单位，点击处理以确定二氧化碳压力。通过尾部夹捏无反应确认达到适当的镇静水平后，将麻醉的鱼放置在为该型号定制的垫状支撑上，并将合适尺寸的硅胶管插入鱼的口中。该管连接至一个潜水泵和含有充气海水的麻醉剂储液罐，以大约每分钟每公斤100毫升的流速将水泵过鱼鳃。接下来，将接地针插入鱼体侧肌肉，并将针连接至放大器的前置放大器。用湿润的布覆盖鱼体，仅露出头部，并将带有刺激递送系统的导管置于鼻孔内。为暴露嗅神经，使用钻头和解剖显微镜去除两眼之间颅骨的皮肤和骨骼。使用 seabream 时，用圆锯切除眼睛正上方至眼睛后方的颅骨部分，并使用钻头去除两眼之间的骨骼。当足够多的骨骼被清除后，使用精细镊子小心去除覆盖在嗅神经上的脂肪和结缔组织，避免损伤神经或血管。在使用电极前，将其连接至 3 伏直流电源的负极，并将电极尖端置于生理盐水中 20 至 30 秒，以清洁电极。应观察到有稳定的小气泡流从尖端冒出。将涂有聚对二甲苯的钨电极连接至交流预放大器的前置放大级。一旦暴露嗅神经，使用显微操作器将电极插入适当的嗅神经部位，使其对标准刺激产生最大反应，而对空白刺激产生最小反应。如果解剖过程顺利，关键步骤是将电极放置到正确的位置。这可能需要一定时间，并涉及一定程度的反复尝试。为了获得电生理信号，使用由电磁阀控制的三通阀建立刺激递送系统，以实现从洁净背景水到含刺激物水的快速切换，并将公共出口连接至输送水流至嗅觉瓣膜的管道。将一根导管置于背景海水中，另一根置于测试溶液中。将阀门驱动器连接到模拟数字转换器的触发器，并设置软件在触发事件发生时开始记录，持续记录预设的时间段。为检查制备样品的稳定性，使用标准刺激反复记录并测量积分反应的幅度，每次刺激之间间隔一分钟。接下来，记录嗅觉神经对对照海水中氨基酸的反应，每次刺激之间间隔一分钟，然后记录对照空白水溶液中 1×10⁻³ M 丝氨酸的嗅觉神经反应。随后，记录嗅觉神经对高二氧化碳海水中氨基酸的反应。记录高二氧化碳空白水溶液的反应，以及对照空白水溶液中 1×10⁻³ M 丝氨酸的反应。此处展示了从海鲷嗅神经记录到的对阳性和阴性对照刺激的典型反应。在刺激施加后约一秒钟内，可观察到神经活动迅速增加，随后在刺激持续期间出现适应期，当刺激结束时，活动恢复至基线水平。相比之下，空白刺激几乎不引发任何反应。在此典型的浓度-反应曲线中，可以观察到气味物质浓度的增加会引发活动性以及整合反应幅度的逐步增强。通过绘制归一化数据及其相应的线性回归曲线，可估算每只动物或一组动物对浓度反应的检测阈值。浓度-反应曲线呈S型，可采用半对数坐标绘图，从而计算引发50%最大反应的气味物质浓度。尽可能保持鱼类健康非常重要。例如，在记录过程中应确保鳃部得到充分灌注，并保持嗅觉上皮湿润。我们的目标之一是追踪大脑中感觉信息传递所涉及的神经通路。

extracellular-multi-unit-recording-from-olfactory-nerve

Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

特勒奥茨的嗅觉神经的细胞外多单元记录

多电极阵列（MEA）记录技术为研究大量神经元群体的电活动提供了一种方法。本文中，我们介绍了在同时刺激组织的条件下，从小鼠副嗅上皮进行记录的多电极阵列制备的详细步骤。...

犁鼻上皮的多电极阵列记录

电嗅图（EOG）记录是一种在嗅觉上皮水平评估嗅觉功能的可靠、易于实施且信息丰富的检测方法。本方案描述了记录装置的搭建、小鼠组织样本的制备、数据采集以及基本的数据分析方法。...

利用气相电嗅觉图记录分析小鼠嗅觉感觉神经元的反应

嗅觉受体神经元（ORNs）首先将气味信号转化为受体电流，进而触发动作电位，并传递至嗅球中的二级神经元。本文描述了采用吸液电极技术，同时记录小鼠嗅觉受体神经元中由气味诱导产生的受体电流和动作电位的方法。...

使用吸管技术记录嗅觉受体神经元对气味分子刺激的反应

荧光染料的逆行运输可根据解剖投射标记特定神经元亚群。标记的轴突可进行可视化靶向 体内，允许对已识别的轴突进行细胞外记录。当神经元无法通过基因操作进行标记或难以使用“盲法”分离时，该技术有助于实现记录 体内...

逆行荧光标记可实现对已鉴定神经元的靶向细胞外单单位记录 体内

本视频演示了使用穿孔膜片钳技术对小鼠嗅觉感觉神经元（OSNs）进行电生理记录的方法。从小鼠中分离出含有表达荧光标记气味受体的OSNs的嗅觉上皮组织，并将其固定在记录室中。将记录电极夹持在OSN的树突 knob...

小鼠嗅觉感觉神经元的穿孔膜片钳记录

我们展示了细胞外多单位记录技术的多种变体，用于表征无脊椎动物嗅觉通路前三个阶段中由气味诱发的神经反应。这些技术也可轻松适用于研究其他神经系统中的群体神经活动。...

用于表征蝗虫（Schistocerca americana）嗅觉回路中神经活动的多单元记录方法

在蜜蜂中建立了同时对两个不同脑神经簇或两个不同解剖通路进行的细胞外长期记录。这些记录使得能够在活体动物中，在单个神经元水平以及神经元集群水平上，研究不同脑区之间神经活动处理的时间特性。...

在行为蜜蜂中同时进行两个神经处理阶段的长期记录

我们描述了一种实验方案 体内...

嗅觉系统作为研究体内轴突生长模式与形态的模型 In Vivo

分析嗅觉感觉神经元的生理特性仍面临技术上的局限。本文通过在基因靶向小鼠的完整嗅觉上皮组织制备中采用穿孔式膜片钳技术记录这些神经元的活动。该技术可用于表征表达特定嗅觉受体的神经元的膜特性及其对特异性配体的反应。...

完整上皮组织中嗅觉感觉神经元的穿孔膜片钳记录：表达特定嗅觉受体神经元的功能分析

本文介绍了一种用于测量和分析非洲爪蟾（Xenopus...

通过监测嗅球内钙离子变化记录温度诱导的神经元活动 Xenopus laevis

Xenopus 蝌蚪为在活体条件下研究神经系统功能提供了一个独特的平台。我们描述了在正常饲养条件或损伤后，评估活体 Xenopus...

活体中嗅觉通路的功能评估 非洲爪蟾 蝌蚪

学习使用细胞外多单元记录技术评估海洋鱼类的嗅觉敏感性。该方法通过记录嗅觉神经的初级感觉输入，独立于外部盐度，可适用于不同物种和环境条件的研究。

硬骨鱼类嗅神经的细胞外多单位记录

探索更多视频