基于共聚焦显微镜的斑马鱼中间神经丘细胞激光消融与再生检测方法

采用本方案，任何配备405纳米激光器的标准共聚焦显微镜的实验室均可开展毛细胞前体细胞的激光消融并监测其再生过程。与电消融相比，该技术对周围细胞的损伤更小，且相较于高功率脉冲紫外激光系统更易于实现。消融前后可立即进行共聚焦成像。

该技术有助于我们更深入地理解感觉前体细胞的再生行为，可能为人类听力损失的治疗方案开发提供帮助。在制备样品时，首先用移液器将三到四条麻醉后的幼鱼转移到35毫米培养皿中央的一小滴E3三卡因溶液中，培养皿底部应放置一个直径14毫米的1.5号盖玻片。吸除多余溶液，使幼鱼保留在刚好足以容纳它们的一小滴溶液中。

将培养皿置于体视显微镜的载物台上。调节放大倍数和焦距，使所有幼虫均处于视野范围内，然后使用移液管将一层薄薄的农杆菌溶液加至盖玻片上。吸去多余的农杆菌溶液，直至液体刚好充满培养皿底部的孔穴，注意避免吸入任何幼虫。

使用毛刀将幼虫迅速调整至农杆菌溶液中，使幼虫的吻端朝向左侧。轻轻将幼虫按压在玻璃表面，使其侧卧，右侧朝下。约60秒后，农杆菌溶液将开始凝固，此时幼虫将无法再次调整方向。

五分钟后，使用移液管将含有1X三卡因的E3培养基加入培养皿至半满。为定位潜在目标，打开激光扫描共聚焦显微镜系统的电源，并通过集成成像软件启动激光。选择63X Plan-Apochromat油浸物镜，并在镜头上滴加浸油。

将培养皿固定在圆形载物台插板中，使幼鱼的吻部朝向左侧。使用明场或微分干涉差（DIC）照明，选择一只已固定的幼鱼进行成像，并调节聚焦旋钮，使靠近盖玻片一侧鱼体的皮肤清晰对焦。切换至GFP荧光通道的落射荧光照明，通过水平肌隔处的GFP表达定位后侧线。

荧光细胞形成的环状结构指示的是神经丘被膜细胞，而细长的细胞链则为中间神经丘细胞。从第一个迁移的原基神经丘开始，使用载物台控制操纵杆沿水平肌隔向尾部方向进行视觉扫描。沿着中间神经丘细胞链继续追踪，直至到达第三个与第四个迁移原基神经丘之间的区域。

若需对多个幼虫进行成像，请选择位置以设定第一个阶段位置。在确定L3、L4区域的细胞体后，切换至采集模式，并使用适当的激光激活GFP成像通道。如需在已激活的激光通道中添加透射光通道，请在成像设置下拉菜单中点击T-PMT框。

对ET20幼虫进行成像时，选择488纳米激光，将激光功率设为6%，针孔大小设为一个面积单位，数字增益设为750。调节增益，使细胞体达到饱和，以捕获原本较暗的突起和丝状伪足。将帧尺寸设为1,024 × 1,024像素，平均次数设为2，数字放大倍数设为0.7。

勾选Z轴堆叠框以调出Z轴位置下拉菜单。在快速扫描过程中，调节焦距直至中间神经丘细胞刚好失焦，设定第一层切片。继续沿样品聚焦，直到中间神经丘细胞再次刚好失焦，设定最后一层切片。

然后单击“停止”，再单击“开始实验”以采集消融前的Z轴层扫图像。如果已添加载物台位置，请关闭“位置”选项，以便仅对当前位置进行成像，并在采集完成后保存文件。对于目标细胞体的激光消融，在采集界面中单击“显示所有工具”，然后在成像设置菜单中选择“添加新通道”。

点击染料并选择 DAPI。在通道中，将激光设置选为 405，并将激光功率增加至 75%。在扫描待消融的候选细胞体时，取消勾选 DAPI 通道以关闭激光。点击“Live”（实时），将视野中心对准一个神经丘间细胞的细胞体，然后将扫描框放大至 20 到 22 倍。

一旦细胞体充满视野，立即停止实时扫描。勾选405纳米激光快门框以启动追踪，并设置45秒计时器。随后，启动连续扫描并开始计时。

在45秒时立即停止扫描。若要对消融后的细胞体进行成像，在“通道”菜单中取消勾选DAPI通道以关闭消融激光，并打开采集模式菜单。点击“缩放”，将缩放倍数降低至0.7。

为了评估细胞消融的效果，快速扫描视野。使用与消融前成像相同的设置，采集并保存消融后的图像。检查透射光光电倍增管通道的图像，以进一步确认细胞损伤情况。

受损的细胞会呈现颗粒状外观，细胞核常出现肿胀或形状不规则。为评估消融后细胞体的恢复情况，需启动阶段位置和时间选项以进行延时成像，并将时间参数设置为相应的实验时间点及15分钟的时间间隔。然后开始实验以获取图像，并在完成后保存生成的文件。

在此代表性实验中，确定了位于第三和第四迁移性原基感觉丘之间的侧线区域，并采集了消融前图像。消融后扫描证实，消融区域内无任何细胞体残留，仅在相邻的感觉丘间细胞的延长突起之间留下间隙。

消融后对透射光光电倍增管通道的分析显示，存在受损和正在死亡的细胞，表现为细胞核肿胀、形态不规则，并呈现颗粒状外观。还可观察到大量阿米巴样细胞的募集，这些细胞可能是巨噬细胞。

在本实验中，对双转基因幼鱼的若干细胞进行消融后，在神经丘间细胞链上形成了明显的空缺，但对侧线神经几乎没有或仅有轻微影响。激光消融后，可测量空缺的大小，其范围从几微米到100微米不等，具体取决于单个神经丘细胞的宽度以及被选中进行消融的细胞数量。

消融后，部分中间神经丘细胞在成像的最初数小时内可恢复。间隙闭合的概率与间隙大小呈负相关。即使在无法恢复的中间神经丘细胞中，也可观察到邻近中间神经丘细胞形成较长的突起，这些突起可类似于延伸的神经元生长锥。

必须彻底检查T-PMT通道中是否存在受损细胞，这些细胞表现出形态不规则的细胞核和颗粒化现象，并应给予足够时间，使这些细胞死亡的指征得以显现。对获得的时间推移显微成像数据进行进一步分析，可能揭示激光消融诱导的新型细胞行为，并为设计实验以鉴定再生调控因子提供指导。该技术为我们研究中间神经丘细胞再生的分子调控机制提供了快速且经济有效的方法，可选择性地损伤这些细胞。