Name: 使用接近连接测定在C.elegans Germline中对核糖蛋白复合体装配的实地检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学习使用接近连接测定技术在秀丽隐杆线虫生殖系中原位检测蛋白质相互作用，揭示其时空动态模式。该方法为研究发育调控机制提供了高灵敏度且操作简便的实验方案。

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本研究中使用的一些线虫品系由美国国立卫生研究院（NIH，资助号P40OD010440）资助的Caenorhabditis遗传中心提供。共聚焦显微镜实验在蒙大拿大学生物光谱学核心研究实验室完成，该实验室的运行得到了美国国立卫生研究院资助项目P20GM103546和S10OD021806的支持。本工作部分由NIH基金GM109053（资助E.V.）、美国心脏协会博士后奖学金18PRE34070028（资助X.W.）以及蒙大拿科学院奖项（资助X.W.）支持。资助方未参与本研究的设计或报告撰写。我们感谢M. Ellenbecker提供的讨论与建议。

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</ol>

作者无利益冲突。

研究蛋白质相互作用（PPIs）时 秀丽隐杆线虫 生殖系中，与共免疫染色相比，PLA 提供的更高分辨率可实现对生殖系内相互作用发生位置的可视化与定量分析。先前已有报道指出，DLC-1 与 OMA-1 之间存在直接相互作用，该作用通过一种 体外 GST下拉实验26；然而，体内pull down实验未能检测到这种相互作用。对3xFLAG::DLC-1与OMA-1::GFP在生殖腺中的荧光共免疫染色显示DLC-1与OMA-1的表达模式存在重叠；然而，尚无证据表明二者在生殖腺中的相互作用发生位置，且该重叠程度并不高于3xFLAG::DLC-1与未融合任何蛋白的GFP（阴性对照）之间的重叠。通过 原位 PLA结果显示，DLC-1确实在生殖系中与OMA-1发生相互作用，这表明PLA在检测蛋白质相互作用（PPIs）方面可能比其他方法更为灵敏。通过该方法，我们进一步拓展了DLC-1作为RNA结合蛋白（RBP）辅助因子的新兴功能。本研究证明了PLA在生殖系中检测蛋白质相互作用的能力，为今后研究者探索自身关注蛋白之间的相互作用提供了参考依据。
<p ...

据估计，超过80%的蛋白质会与其他分子发生相互作用1，这凸显了蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）在细胞内执行特定生物学功能中的重要性2。某些蛋白质作为枢纽发挥作用，促进形成细胞存活所必需的更大复合物1。这些枢纽介导多种蛋白质-蛋白质相互作用，并帮助将蛋白质组织成网络，以促进细胞内的特定功能3。蛋白质复合物的形成还受到生物学背景的影响，例如特定相互作用伙伴的存在与否4、细胞信号事件以及细胞的发育阶段。
C. elegans 常被用作多种研究的模式生物，包括发育研究。该生物结构简单，具有多个器官，如性腺、肠道和透明的角质层，这有利于对线虫发育过程的分析。位于性腺中的生殖系是研究生殖系干细胞如何成熟为配子5，并进一步发育为胚胎，最终形成下一代子代的优良工具。生殖系的远端顶端区域含有一群自我更新的干细胞（图1）。当干细胞离开干细胞微环境（niche）后，会进入减数分裂的粗线期，并最终在年轻成虫阶段发育为卵细胞（图1）。生殖系中的这一发育程序受到多种机制的严格调控，其中包括由RNA结合蛋白（RBPs）介导的转录后调控网络6。蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）在这一调控活动中至关重要，因为RNA结合蛋白需与其他辅助因子相互作用以发挥其功能。
在秀丽隐杆线虫中，有多种方法可用于检测蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），但每种方法都有其独特的局限性。体内免疫共沉淀（IP）可用于从整个线虫提取物中分离蛋白质-蛋白质复合物；然而，该方法无法指明PPI在线虫体内的具体发生位置。此外，那些短暂存在、仅在特定发育阶段或少数细胞中形成的蛋白质复合物，通过共免疫沉淀难以被有效捕获。最后，IP实验还需考虑裂解后蛋白质复合物可能发生重排，以及蛋白质非特异性结合于亲和基质等问题。
替代方法 原位 检测蛋白质相互作用（PPIs）的方法包括共免疫染色、荧光共振能量转移（FRET）和双分子荧光互补（BiFC）。共免疫染色依赖于在固定线虫组织中同时检测两种目标蛋白，并测量信号共定位的程度。使用超分辨率显微镜可获得比常规显微镜更精细的细节7有助于更严格地检验超出200-300 nm衍射极限的蛋白质共定位8然而，共免疫染色结合常规显微镜与超分辨率显微镜技术最适合用于具有明确定位模式的蛋白质。相比之下，对于呈弥散分布的相互作用蛋白伴侣，该方法提供的信息量显著减少。基于信号重叠程度来评估共定位，并不能准确反映蛋白质之间是否真正形成复合物。9,10.
此外，蛋白质-蛋白质复合物的共免疫沉淀和共免疫染色并非定量方法，因此难以判断此类相互作用是否具有显著性。FRET 和 BiFC 均为基于荧光的技术。FRET 依赖于用具有光谱重叠的荧光蛋白（FP）标记目标蛋白，使得一个荧光蛋白（供体）的能量传递给另一个荧光蛋白（受体）11。这种非辐射能量转移会导致受体荧光蛋白在其相应的发射波长处产生可检测的荧光信号。BiFC 技术基于在活体（in vivo）条件下重建荧光蛋白。该方法将 GFP 分裂为两个互补片段，例如螺旋 1-10 和螺旋 1112，并将这些片段分别与两个目标蛋白融合。当这两个蛋白发生相互作用时，GFP 的互补片段在空间上足够接近，能够折叠并组装，从而重建 GFP 荧光基团。重建后的 GFP 可直接通过荧光观察，指示蛋白质相互作用（PPI）发生的位置。
因此，FRET 和 BiFC 均依赖较大的荧光标签，这些标签可能会干扰被标记蛋白的功能。此外，FRET 和 BiFC 需要被标记蛋白的表达量充足且相当，才能获得准确的数据。当其中一个相互作用蛋白过量时，FRET 可能不适用，因为这会导致较高的背景信号13。在 BiFC 实验中也应避免过表达，因为这可能引起非特异性组装14，从而增加背景信号。这两种技术均需要优化被标记蛋白的表达条件和成像条件，这可能会延长实验所需的时间。
邻近连接实验（proximity ligation assay, PLA）是一种可克服上述技术局限性的替代方法。PLA 利用能够识别目标蛋白（或其标签）的一抗，随后这些一抗会与带有寡核苷酸探针的二抗结合；当两个寡核苷酸探针之间的距离在 40 nm（或更短）范围内时，它们可相互杂交15. 通过PCR反应扩增杂交后的DNA，并由与DNA互补的探针进行检测。由此产生的信号焦点可通过显微镜观察。该技术可用于检测蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs） 原位 在复杂组织（例如线虫性腺）中，这些组织以类似流水线的方式组织，包含处于不同发育和分化阶段的细胞。通过邻近连接技术（PLA），可在固定的线虫性腺中直接可视化蛋白质相互作用（PPIs），这有利于研究特定发育阶段是否发生PPIs。与基于共定位的检测方法相比，PLA具有更高的分辨率，适用于精确测量。若结合超分辨率显微镜使用，还可进一步揭示PLA信号焦点在细胞内的精确定位。另一优势在于，PLA反应产生的信号焦点可通过基于ImageJ的分析流程进行计数，使该技术具备定量能力。
动力蛋白轻链LC8家族最初被描述为动力蛋白马达复合物的一个亚基16 并被假定作为货物适配器发挥作用。自最初被发现以来，LC8除存在于动力蛋白马达复合物中外，还被发现存在于多种蛋白质复合物中17,18,19,20扫描含有 LC8 相互作用基序的蛋白质序列19 表明LC8可能与多种不同的蛋白质存在相互作用17,18,19,20,21,22因此，LC8家族蛋白现被视为促进大型蛋白质复合物组装的枢纽。19,22，例如内在无序蛋白的组装体21.
一 秀丽隐杆线虫 LC8家族蛋白、动力蛋白轻链-1（DLC-1）在多种组织中广泛表达，且未富集于特定的亚细胞结构23,24因此，鉴定具有生物学意义的 体内 DLC-1 的相互作用蛋白 秀丽隐杆线虫 由于以下几个原因，该实验具有挑战性：1）共免疫沉淀无法指明相互作用发生的具体组织来源；2）特定互作伴侣蛋白表达量有限或相互作用具有瞬时性，可能阻碍通过共免疫沉淀检测到相互作用；3）DLC-1 的弥散性分布会导致在共免疫染色中与潜在伴侣蛋白产生非特异性重叠。鉴于上述挑战，PLA 是一种理想的检测方法 体内 与DLC-1的相互作用
已有报道表明，DLC-1 可直接与 RNA 结合蛋白（RBPs）FBF-2 相互作用，并作为其辅助因子23 和 GLD-125我们的研究支持DLC-1作为枢纽蛋白的作用模型，并提示DLC-1有助于形成一个超越驱动蛋白的相互作用网络19,22. 利用GST下拉实验，鉴定出一种新的与DLC-1相互作用的RNA结合蛋白OMA-126OMA-1 对卵母细胞生长和减数分裂成熟具有重要作用27 并与多种翻译抑制因子和激活因子协同发挥作用28尽管FBF-2和GLD-1分别在干细胞和减数分裂粗线期区域表达，OMA-1则从减数分裂粗线期到卵母细胞阶段在整个生殖系中呈弥散性表达27 (图1）。这表明DLC-1在性腺的不同区域与RNA结合蛋白（RBPs）形成复合物。此外，还发现DLC-1与OMA-1之间存在直接相互作用 体外 无法通过 an 恢复 体内 IP。PLA 已被成功用作研究该相互作用的替代方法 秀丽隐杆线虫 生殖系，结果表明PLA可用于研究线虫中许多其他蛋白质相互作用。

<table><tbody><tr><td>16% 多聚甲醛溶液</td><td>电子显微镜服务</td><td>15710</td><td>用于配制 4% 工作液</td></tr><tr><td>1M KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td>配制 1M 工作储备液</td></tr><tr><td>1x M9</td><td>多种</td><td>多种</td><td>按 10x 储备液配制，使用时稀释至 1x；实验方案详见 wormbook.org</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>多种</td><td>多种</td><td>实验方案详见 wormbook.org</td></tr><tr><td>26.5 号针头</td><td>Exel International</td><td>26402</td><td>用于解剖的针头</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Lampire</td><td>7500802</td><td></td></tr><tr><td>离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>05-529C</td><td>50 ml Oak Ridge 离心管，用于同步化处理</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>880</td><td></td></tr><tr><td>柯普林瓶（Coplin Jar）</td><td>PolyLab</td><td>62101</td><td></td></tr><tr><td>用于冷冻样品的盖玻片</td><td>Globe Scientific</td><td>1411-10</td><td>22x40 mm，No. 1</td></tr><tr><td>用于封片的盖玻片</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-15</td><td>22x22 mm，No. 1.5</td></tr><tr><td>免疫荧光用 DAPI 封片剂</td><td>Vector</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>连接酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82029</td><td>Duolink 1x 连接酶，包含于 Duolink In Situ 检测试剂红套装 DUO92008 中</td></tr><tr><td>扩增红缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82011</td><td>Duolink 5x 扩增红缓冲液，包含于 Duolink In Situ 检测试剂红套装 DUO92008 中</td></tr><tr><td>连接缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82009</td><td>Duolink 5x 连接缓冲液，包含于 Duolink In Situ 检测试剂红套装 DUO92008 中</td></tr><tr><td>抗体稀释液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82008</td><td>Duolink 抗体稀释液，随 DUO92004 和 DUO92002 提供；注意：也可使用 1x PBS/1% BSA 溶液替代稀释抗体</td></tr><tr><td>封闭液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82007</td><td>Duolink 封闭液，随 DUO92004 和 DUO92002 提供</td></tr><tr><td>PLA 封片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td>含 DAPI 的 Duolink In Situ 封片剂</td></tr><tr><td>MINUS 探针</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td>Duolink In Situ 抗小鼠 MINUS 探针</td></tr><tr><td>PLUS 探针</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>Duolink In Situ 抗兔 PLUS 探针</td></tr><tr><td>洗涤缓冲液 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82046</td><td>Duolink In Situ 洗涤缓冲液 A</td></tr><tr><td>洗涤缓冲液 B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82048</td><td>Duolink In Situ 洗涤缓冲液 B</td></tr><tr><td>聚合酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82030</td><td>Duolink 聚合酶，包含于 Duolink In Situ 检测试剂红套装 DUO92008 中</td></tr><tr><td>落射荧光显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>配备 DFC300G 相机的 DM5500B 显微镜</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 Alexa 594</td><td>JacksonImmuno</td><td>115-585-146</td><td>使用稀释比为 1:500</td></tr><tr><td>山羊抗兔 Alexa 488</td><td>JacksonImmuno</td><td>111-545-144</td><td>使用稀释比为 1:200</td></tr><tr><td>图像处理软件</td><td>Adobe</td><td></td><td>Adobe Photoshop + Illustrator CS3</td></tr><tr><td>玻璃移液管</td><td>Corning</td><td>7095B-5X</td><td></td></tr><tr><td>左旋咪唑（Levamisole）</td><td>ACROS Organics</td><td>187870100</td><td>配制 250 mM 工作储备液</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 FLAG 抗体</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>免疫荧光和 PLA 实验中使用稀释比为 1:1000，建议用正常山羊血清预先封闭</td></tr><tr><td>指甲油</td><td>L.A. colors</td><td>CNP195</td><td></td></tr><tr><td>线虫生长培养基（NGM）</td><td>多种</td><td></td><td>实验方案详见 wormbook.org</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>JacksonImmuno</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯巴斯德移液管</td><td>Globe Scientific</td><td>135030</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td>以水配制成 0.1% 储备液，-20°C 保存，使用时以水 1:100 稀释后用于包被载玻片</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Tritech</td><td>PD7060</td><td>直径 60 mm</td></tr><tr><td>兔抗 GFP 抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>G10362</td><td>免疫荧光实验中使用稀释比为 1:200，PLA 实验中为 1:4000</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Thermo Fisher</td><td>30-2066A-Brown</td><td>定制订购的三格 14x14 mm 可高压灭菌载玻片（带条形标记），通过 Fisher Scientific 购买；实验室内添加聚-L-赖氨酸进行包被</td></tr><tr><td>次氯酸钠溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS290-1</td><td></td></tr><tr><td>擦拭巾</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td>尺寸为 4.4x8.4 英寸的擦拭巾</td></tr><tr><td>托盘（242x241x20 mm）</td><td>Thermo Fisher</td><td>240845</td><td>用于制作湿盒</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>ACROS Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>超纯水</td><td>Milli-Q</td><td></td><td>来自 Milli-Q Integral 水纯化系统的超纯水</td></tr><tr><td>表面皿</td><td>Carolina Biological</td><td>742300</td><td></td></tr><tr><td>-20 &amp;deg;C 冰箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;C 冰箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 菌株 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;本研究中使用的线虫品系（均可申请获取）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]&lt;/em&gt;</td><td></td><td>UMT 376</td><td>&lt;em&gt;dlc-1 启动子::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR；oma-1 启动子::oma-1::GFP&lt;/em&gt;；参考文献 24</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III&lt;/em&gt;</td><td></td><td>UMT 422</td><td>&lt;em&gt;dlc-1 启动子::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR；gld-1 启动子::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+)&lt;/em&gt;；参考文献：本研究</td></tr></tbody></table>

利用邻位连接实验在 c. elegans 生殖系中检测核糖核蛋白复合物的原位组装

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

了解蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）发生的时间和位置，对于理解蛋白质在细胞内的功能以及发育等更广泛的生命过程如何受到影响至关重要。Caenorhabditis elegans 的生殖系是研究与干细胞调控、减数分裂及发育相关PPI的优良模型系统。该系统具备多种成熟的蛋白质标记技术，可使目标蛋白被常规抗体识别，因而特别适用于邻近连接实验（PLA）反应。因此，相较于其他方法，PLA能够更有效地以时空特异性的方式展示PPI在生殖系中的发生位置。本文介绍了一种应用于C. elegans生殖系中PPI检测与定量分析的技术方案。

使用 FLAG 和 GFP 抗体对 3xFLAG::DLC-1; GFP 以及 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP 两种品系的生殖腺进行共免疫染色，揭示了它们在生殖腺中的表达模式（图 3Aii-iii, 3Bii-iii）。GFP 在整个生殖腺中均有表达（图 3Aiii），而 OMA-1::GFP 的表达则局限于晚期粗线期和卵母细胞（图 3Biii）27。FLAG 免疫染色结果显示，在两种品系中，3xFLAG::DLC-1 均在整个生殖腺中表达（图 3Aii, 3Bii）。通过共免疫染色发现，3xFLAG::DLC-1 与 OMA-1::G...

本方案演示了使用邻近连接技术检测蛋白质-蛋白质相互作用 原位 在 秀丽隐杆线虫 生殖系

利用邻位连接实验在 C. elegans 生殖系中检测核糖核蛋白复合物的原位组装

了解蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）发生的时间和位置，对于理解蛋白质在细胞内的功能以及更广泛的生物学过程至关重要……

邻近连接实验可使研究人员在原位检测蛋白质-蛋白质相互作用，揭示这些相互作用的空间和时间分布模式。该技术有助于解答有关秀丽隐杆线虫发育调控的重要科学问题。与其他技术（如FRET和BiFC）相比，该方法在检测蛋白质-蛋白质相互作用时具有相当的灵敏度，且操作更为简便。从未解剖过线虫以释放性腺的个体可能在该步骤中遇到困难。建议先练习解剖线虫，并将其用于免疫荧光实验，以熟练掌握操作和解剖技术，再进行邻近连接实验（PLA）。开始时，挑选30至40条年轻成虫线虫，放入含有500 µL 1× M9缓冲液和左旋咪唑的表面皿中。收集线虫后，小心移除并弃去大部分培养基，以去除随线虫转移的细菌。加入新鲜的 500 µL 1× M9 缓冲液以及左旋咪唑，用移液器轻轻吸打液体以清洗线虫。随后小心移除并弃去大部分液体。重复洗涤两到三次。洗涤结束后，将线虫置于约100微升培养基中，时间不超过八分钟。使用玻璃或聚乙烯移液管，将线虫转移至经001%多聚赖氨酸包被的25毫米×75毫米显微镜载玻片上。吸除多余培养基，使载玻片上残留约15微升。去除过量缓冲液对于确保解剖后的线虫及性腺能够黏附于载玻片至关重要。在解剖显微镜下，使用两根26½号细针，将一根针置于另一根之上，使针尖端形成剪刀状结构。以这种方式放置针头，从咽部后方切割线虫，以释放生殖腺。在五分钟内解剖完所有线虫。所有线虫解剖完毕后，轻轻将一块22毫米×40毫米的盖玻片置于载玻片上，使其与载玻片垂直。盖玻片的两端应悬于载玻片之外。将载玻片置于预先冷却的铝块上，并在干冰中冷冻至少20分钟。轻轻将一支预冷的铅笔置于盖玻片上方，以防止盖玻片因冰膨胀而松动。准备固定时，用铅笔轻弹盖玻片使其脱落，立即将载玻片浸入盛有新鲜冰甲醇的容器中，固定1分钟。随后轻轻擦拭载玻片上样品周围区域的边缘，并在室温下加入150 µL甲醛固定液，固定5分钟。将载玻片以垂直90度角接触纸巾，使固定液从载玻片上流出并被纸巾吸收。在室温下，用含有50毫升PBT/BSA的考普林瓶将载玻片封闭两次，每次15分钟。然后用含有10%正常山羊血清的PBT/BSA溶液封闭载玻片。轻轻擦拭载玻片周围边缘，并在每张载玻片上加入100微升该溶液。轻轻晃动载玻片以帮助溶液均匀铺展。在湿润孵育盒中室温孵育1小时。将载玻片置于纸巾上，使溶液自然流下，并轻轻擦拭边缘。为了封闭载玻片，在14毫米×14毫米的区域内加入一滴封闭剂。将载玻片置于湿盒中，于37摄氏度孵育1小时。将载玻片放在纸巾上，使封闭剂从载玻片上流下，并轻轻擦拭边缘。使用抗体稀释液稀释一抗。每张载玻片上 14 毫米 × 14 毫米的区域加入 40 微升稀释后的一抗溶液。将载玻片置于湿盒中，在 4 摄氏度下孵育过夜。早上，将载玻片在 Coplin 染色缸中用 50 毫升 1× 洗涤缓冲液 A 于室温下洗涤两次，每次五分钟。将 Coplin 染色缸置于设定为 60 rpm 的旋转摇床上。将载玻片放在纸巾上，使洗涤缓冲液从载玻片上流下，并轻轻擦拭边缘。配制40微升含有正负探针的溶液。将该溶液加入每个14×14毫米的区域中。将载片置于湿盒中，在37摄氏度下孵育1小时。在室温下，将载玻片置于Coplin瓶中，用50毫升1×洗涤缓冲液A洗涤两次，每次5分钟。将Coplin瓶置于设定为60 rpm的旋转摇床上。用超纯水将连接缓冲液按1:5比例稀释。使用此缓冲液将连接酶按1:40稀释，以制备连接反应工作液。将玻片置于纸巾上，使洗涤缓冲液从边缘流下，并轻轻擦拭边缘。向每个14毫米×14毫米的区域加入40微升连接反应液。将载玻片置于湿盒中，37摄氏度孵育30分钟。按照前述方法洗涤并干燥载玻片后，向每个14 mm × 14 mm的区域加入40 µL新配制的扩增溶液，避光保存。将载玻片置于湿润、避光的孵育盒中，37摄氏度孵育1小时40分钟。用50毫升1×洗涤缓冲液B将载玻片洗涤两次，每次10分钟，再用50毫升0.1×洗涤缓冲液B洗涤一次，每次1分钟。待载玻片环氧涂层边缘干燥后，向每个样本加入10微升封片剂，轻轻盖上盖玻片，使封片剂均匀铺展。用指甲油沿盖玻片边缘涂抹，以密封盖玻片和载玻片。避免移动盖玻片。将指甲油在室温下避光静置至少20分钟，使其充分硬化。利用FLAG和GFP抗体对生殖腺进行共免疫染色，揭示了它们在生殖腺中的表达模式。GFP在整个生殖腺中均有表达，而OMA-1:GFP的表达则局限于晚期粗线期和卵母细胞。FLAG免疫染色显示，3xFLAG:DLC-1在两种品系的整个生殖系中均有表达。生殖系中用于PLA定量分析的目标区域包括晚期粗线期至所有卵母细胞的区域，该区域也是OMA-1的表达区域。与3xFLAG:DLC-1、GFP生殖系相比，3xFLAG:DLC-1、OMA-1:GFP生殖系在该区域内似乎具有更多的PLA信号点。确保腔室内有足量的水以提高湿度。同时，确保载玻片在腔室内保持水平，以防止试剂流失。经过邻近连接实验后，可使用共聚焦显微镜对挤出的性腺进行成像，并利用 Fiji 和 ImageJ 工作流程进行定量分析。该定量分析有助于判断相互作用是否具有统计学显著性。PLA 技术使我们能够在原位评估线虫生殖系发育关键调控因子之间的相互作用。

in-situ-detection-ribonucleoprotein-complex-assembly-c-elegans

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

使用接近连接测定在C.elegans Germline中对核糖蛋白复合体装配的实地检测

我们描述了一种增敏方法，利用基于RNAi的基因组筛选和整合的转基因，该转基因表达一种带有荧光标签的功能性蛋白质，以鉴定秀丽隐杆线虫（C.

RNAi 筛选以鉴定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的胚后表型

本视频介绍了用于研究线虫细胞中原位蛋白质-蛋白质相互作用的邻近连接分析技术。当目标蛋白质彼此靠近时，在连接有二抗的PLA探针的帮助下，可形成环状DNA模板。随后使用扩增溶液对探针进行扩增，产生一条长的单链DNA，再通过检测探针的杂交，实现细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的定位。...

原位蛋白质-蛋白质相互作用研究的邻近连接实验

本视频展示了利用邻近连接实验（Proximity Ligation Assay,...

蛋白质-蛋白质相互作用的检测 果蝇 使用邻近连接实验检测幼虫

本方案演示了如何利用邻近连接技术检测 原位 蛋白质-蛋白质相互作用在 果蝇 幼虫神经肌肉接头。利用该技术，Discs large 和 Hu-li tai shao...

检测 原位 蛋白质-蛋白质复合物在 果蝇 利用邻近连接技术检测幼虫神经肌肉接头

我们报道了一种在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的生殖腺和胚胎中进行荧光原位杂交（FISH）的简明实验流程，用于观察和定量重复序列。...

使用PNA探针通过荧光原位杂交（FISH）在秀丽隐杆线虫中对端粒和重复序列进行观察与定量

在此，我们介绍一种高灵敏度可视化和定量固定细胞中内质网与线粒体之间内源性相互作用的方法。该方案采用了一种优化的 原位 靶向线粒体相关膜界面处的三磷酸肌醇受体/葡萄糖调节蛋白75/电压依赖性阴离子通道/亲环素D复合物的邻近连接...

内质网与线粒体相互作用的研究方法 原位 固定细胞中的邻近连接测定

我们介绍一种基于免疫荧光 成像的方法，用于在分离的 C. elegans 性腺中对活性ERK进行时空定位。此处描述的实验方案可适用于 C. elegans...

空间与时间上对 C. elegans 生殖系中活性 ERK 的分析

在此演示了如何 原位 邻近连接实验（Proximity Ligation Assay, PLA）可用于检测和可视化在基因毒性应激条件下悬浮培养细胞中ATM与p53之间的直接蛋白质-蛋白质相互作用。...

利用邻位连接技术在悬浮细胞培养物中检测和可视化DNA损伤诱导的蛋白质复合物

本文展示了如何利用邻近连接实验（PLA）以高灵敏度在固定细胞中可视化MST1/MST2异源二聚体的形成。...

利用双分子荧光互补技术检测蛋白异构体异源二聚化 原位 邻近连接实验

D-环捕获（DLC）和D-环延伸（DLE）实验利用邻近连接原理结合定量PCR，用于定量检测酿酒酵母（Saccharomyces...

同源重组中间体的检测 通过 邻近连接与定量 PCR 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

学习使用接近连接测定技术在秀丽隐杆线虫生殖系中原位检测蛋白质相互作用，揭示其时空动态模式。该方法为研究发育调控机制提供了高灵敏度且操作简便的实验方案。

利用邻位连接实验在 C. elegans 生殖系中检测核糖核蛋白复合物的原位组装

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