Name: 脑切片和原细胞培养中金字塔神经元的弹道标记 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 了解大鼠脑切片中金字塔神经元的弹道标记方法，结合神经元重建软件分析树突棘形态与神经可塑性。该技术为研究神经认知功能障碍机制提供了可靠的定量分析工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 HD043680、MH106392、DA013137 和 NS100624。

所有动物实验方案均经南卡罗来纳大学动物护理与使用委员会审查并批准（联邦保证编号：D16-00028）。
1. DiI/钨珠毛细管的制备
<ol>
	<li>将100 mg聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶于10 mL去离子水（ddH2O）中，轻轻涡旋混匀PVP溶液。</li>
	<li>用PVP溶液（见材料表）填充导管，并静置20分钟。然后使用10 mL注射器从导管另一端将PVP溶液排出。</li>
	<li>将170 mg钨微载体珠与250 µL二氯甲烷混合，充分涡旋使钨珠悬浮液混匀。</li>
	<li>将6 mg脂溶性DilC18(3)染料与300 µL二氯甲烷混合，充分涡旋使DilC18(3)染料溶液混匀。 
	注意：步骤1.3–1.4需在通风橱中操作。</li>
	<li>用移液器将250 µL钨珠悬浮液转移至载玻片上，静置使其自然风干（约3分钟）。</li>
	<li>在已风干的钨珠悬浮液层上加入300 µL DilC18(3)染料溶液，用移液器枪头充分混匀DiIC18(3)染料溶液与钨珠悬浮液，随后静置风干（约3分钟）。</li>
	<li>待完全干燥后，使用剃刀片将混合物分装至两个1.5 mL离心管中，并向管中加水至充满。</li>
	<li>在水浴超声仪（Amp I，100%功率）中超声处理至均匀（约5分钟），确保超声探头直接接触装有珠悬液的离心管管壁。</li>
	<li>将两个1.5 mL均质混合物合并至一个15 mL锥形管中，再继续超声处理3分钟。</li>
	<li>使用10 mL注射器将钨珠-DilC18(3)染料混合物吸入已涂覆PVP的导管中，并将导管送入制备工作站（见材料表）。</li>
	<li>在制备工作站上旋转1分钟，随后用10 mL注射器小心抽除导管中所有水分。</li>
	<li>打开氮气，调节氮气流速至约0.5升/分钟（LPM），在制备工作站上旋转导管，并用氮气干燥30分钟。</li>
	<li>从制备工作站取下导管，使用导管切割器切成13 mm长度（与弹夹加载尺寸匹配），将13 mm长的导管段置于闪烁瓶中，避光保存。</li>
</ol>
2. 脑切片的制备
注意：成年雄性F344/N大鼠在12小时光照/12小时黑暗循环的受控环境中成对饲养，可自由获取食物和水。所有动物的饲养和管理均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中规定的原则。
<ol>
	<li>使用5%七氟烷深度麻醉大鼠。</li>
	<li>当大鼠对有害刺激无反应且反射消失时，进行下一步操作。</li>
	<li>将大鼠仰卧位固定于化学通风橱内。</li>
	<li>沿胸骨中线切开皮肤，分离膈肌并用剪刀打开胸腔，将20 G × 25 mm针头插入左心室。</li>
	<li>立即用剪刀剪开右心房，以5 mL/min流速灌注50 mL 100 mM PBS，随后灌注100 mL用100 mM PBS配制的4%多聚甲醛。</li>
	<li>灌注结束后立即取出整脑。</li>
	<li>将整脑用4%多聚甲醛后固定10分钟。 
	注意：后固定时间不得超过30分钟，否则会影响标记效果。</li>
	<li>使用大鼠脑切片模具（见材料表）切割500 µm厚的冠状切片。进行第一次切割后保持刀片位置不变，使用第二把刀片进行第二次切割，并垂直移出第一把刀片，使组织保留在刀片表面。</li>
	<li>将脑切片放入24孔板中，每孔加入1 mL 100 mM PBS。重复此过程直至所有切片完成。</li>
</ol>
3. 脑切片的弹道标记与可视化
<ol>
	<li>移除每个目标孔中的 PBS。</li>
	<li>将一段 DiI/钨珠管装入进样器中，并将其放入施加装置。</li>
	<li>在两层网筛之间放置一张滤纸。将施加装置连接至氦气管路。调节氦气输出压力至 90 磅每平方英寸（psi）。</li>
	<li>用手将施加装置垂直放置在目标孔的中心位置，样品与网筛之间的距离为 1.5 cm。发射 DiI/钨珠管。 
	注意：射击前务必完全移除目标孔中的 PBS。</li>
	<li>装入下一段 DiI/钨珠管。持续对剩余的脑片进行射击。</li>
	<li>向 24 孔板中加入 100 mM PBS 溶液。用 500 µL 新鲜的 100 mM PBS 洗涤 3 次。洗涤过程中避免脑片翻转。</li>
	<li>加入 500 µL 新鲜的 100 mM PBS，将脑片置于 4 °C 避光保存 3 小时。</li>
	<li>使用细刷将脑片转移至载玻片上。 
	注意：每张载玻片上可放置三片脑组织切片。</li>
	<li>立即在每一片脑组织上加入 1 mL 抗荧光淬灭封片剂。覆盖 22 mm × 50 mm 的盖玻片。将载玻片置于避光环境中干燥 2 天。</li>
	<li>开启共聚焦显微镜系统，并切换至 60× 物镜。</li>
	<li>设置共聚焦显微镜系统的放大倍数为 60×（A/1.4，油镜），Z 轴步进间隔为 0.15 μm（针孔大小 30 μm，后投影针孔半径 167 nm）。使用 543 nm 激光波长采集目标神经元的图像。</li>
	<li>根据脑区边界及神经元的形态学特征，获取目标神经元类型的 Z 轴层扫图像。 
	注意：每只动物至少采集三幅图像。</li>
</ol>
4.&#160;细胞培养中该方法的应用
<ol>
	<li>采用已报道的方法14，从出生后第一天的 F344/N 大鼠中分离原代皮层神经元。</li>
	<li>将原代皮层神经元培养于 35 mm 玻璃底培养皿中一周。分离后第三天，更换一半培养基为新鲜的神经元生长培养基。用 1 mL 的 100 mM PBS 洗涤玻璃底培养皿 2 次。</li>
	<li>在室温下用 4% 多聚甲醛固定 15 分钟。重复步骤 3.2–3.6，以实现细胞的弹道标记。</li>
	<li>用 1 mL 的 100 mM PBS 洗涤 3 次。加入 500 µL 新鲜的 100 mM PBS，置于 4 °C 避光保存 3 小时。</li>
	<li>加入 200 µL 抗荧光淬灭封片剂。</li>
	<li>根据步骤 3.10 中的参数，获取每个目标神经元的 Z 轴层扫图像。</li>
</ol>
5.&#160;神经元分析与树突棘定量
<ol>
	<li>使用代码编号对神经元进行盲化处理，以防止实验者产生偏倚。</li>
	<li>根据感兴趣的脑区建立神经元的选择标准。 
	注意：神经元的选择标准包括连续的树突染色、低背景信号、细胞内无染料聚集、DiI染料向细胞外空间的扩散最小化，以及锥体神经元形态正确（图1）。</li>
	<li>打开神经元重建软件（参见附带的 视频1）。</li>
	<li>点击左上角的“文件夹图标”以加载图像文件。</li>
	<li>点击“胞体”，并在图像上标记神经元的胞体。</li>
	<li>点击“树状结构”，然后选择“用户引导”模式。</li>
	<li>追踪所有感兴趣的树突分支。 
	注意：对于具有一个顶端树突和多个基底树突的锥体神经元，仅需追踪顶端树突。确保所有连接的分支彼此相连。</li>
	<li>点击“树突棘”。</li>
	<li>定义检测参数，然后点击“全部检测”。 
	注意：对于脑切片，跨脑区一致使用的参数为：2.0（外侧范围）、0.3（最小高度）、100%（检测器灵敏度）和10（最小计数）。对于细胞培养样本，需提高检测器灵敏度并降低最小计数。</li>
	<li>通过选择“全部分类”对树突棘进行分类。 
	注意：树突棘的分类由神经元重建软件内置的算法完成15。</li>
	<li>通过点击左上角的磁盘图标保存追踪结果。</li>
	<li>进行神经元及树突棘形态学分析。
	<ol>
		<li>打开神经元重建定量分析软件（参见附带的 视频2）。</li>
		<li>点击“文件”和“打开数据文件”以加载图像。</li>
		<li>点击“分析”和“分支结构分析”，以分析神经元形态和树突棘形态。</li>
		<li>对于神经元形态分析，点击“树状结构总计”，并选中“树突总计”选项框。</li>
		<li>对于树突棘形态分析，点击“树突棘”，然后选中“树突棘详细信息”选项框。</li>
		<li>右键点击输出表格，选择“保存到文件”，将结果保存为文本（.txt）文件。</li>
		<li>点击“分析”和“Sholl分析”。</li>
		<li>将起始半径设为10 μm，半径增量设为10 μm。</li>
		<li>勾选“树突”选项框，然后点击“显示”。</li>
		<li>右键点击输出表格，选择“保存到文件”，将结果保存为文本（.txt）文件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6.&#160;数据分析
<ol>
	<li>分析神经元形态学数据（即树突分支复杂性）。
	<ol>
		<li>将每个分支级次的树突数量相加，再除以树突总数，乘以100，计算每个分支级次树突数量的相对频率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析Sholl分析数据，以评估神经元树突分支的复杂性及树突棘的连接情况。
	<ol>
		<li>计算每个半径处交点数量的平均值及平均值的标准误差。</li>
		<li>根据树突棘类型（即细长型、短粗型、蘑菇型）分别统计每个半径处的树突棘数量，再除以该类型树突棘的总数，乘以100，计算每个半径处各类型树突棘数量的相对频率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+%22DiOlistic%22+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li>
<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocol%22%5BJournal%5D)">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202(2009).</li>
<li>Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiOLISTIC+labeling+of+neurons+from+rodent+and+non-human+primate+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li>
<li>Spacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+Golgi+method%3A+a+time-lapse+study+of+the+early+stages+of+impregnation+in+single+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections.</a> Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Timing%3A+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Science Reports. 9 (1), 827(2019).</li>
<li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons%3A+dendritic+structure+and+synaptic+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).</li>
<li>Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+number+and+distribution+of+inhibitory+and+excitatory+synapses+on+hippocampal+CA1+pyramidal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells.</a> Neuroscience. 102, 527-540 (2001).</li>
<li>Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+pyramidal+neuron+of+the+rat+cerebral+cortex.+The+perikaryon%2C+dendrites+and+spines%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines.</a> American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).</li>
<li>Harris, K. M., Sultan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+the+number%2C+location%2C+and+size+of+synaptic+vesicles+provides+an+anatomical+basis+for+the+nonuniform+probability+of+release+at+hippocampal+CA1+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses.</a> Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).</li>
<li>Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+assessment+of+the+involvement+of+perforations%2C+spinules%2C+and+spine+branching+in+hippocampal+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation.</a> Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).</li>
<li>Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+dendritic+spine+detection%3A+from+Golgi+to+high-resolution+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging.</a> Neuroscience. 251, 129-140 (2012).</li>
<li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens%3A+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavior+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285(2018).</li>
<li>Roscoe, R. F. Jr, Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transgenic+female+rat%3A+synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Filamentous+Actin+%28F-actin%29+Puncta+in+Rat+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53697(2016).</li>
<li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Three-Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+Spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (10), 1371(2008).</li>
</ol>

所有作者均无利益冲突需要声明。

在本实验方案中，我们描述了一种适用于大鼠脑组织神经元及体外培养神经元的通用标记技术。此外，我们还介绍了如何使用神经元重建软件和神经元重建定量分析软件来评估神经元形态和树突棘的方法。对神经元形态和树突棘的评估有助于揭示树突分支复杂性、神经元树突结构复杂性、树突棘形态以及突触连接性的变化。
在实施该方案时，研究人员应特别注意以下几个步骤。首先，使用4%多聚甲醛（PFA）后固定时间过长会破坏脂溶性膜的完整性，导致染料从细胞内泄漏。其次，与脑切片中仅靶向神经元的弹道标记特异性相比，在体外对原代皮层神经元进行标记时会引入胶质细胞的非特异性标记，因为脑切片中的弹道标记并不特异于某一种神经元类型（例如锥体神经元、中等棘状神经元或颗粒细胞）。因此，应将Bregma坐标、形态学评估或特异性细胞标志物与弹道标记方法结合使用。第三，脑切片的厚度可在200–500 µm之间；为获得最佳效果，应对此进行优化。第四，标记效率和染料渗透程度受多种因素影响，包括氦气压力、弹道喷射后的孵育时间、DiI/钨珠比例、网格筛与脑切片表面之间的距离等，因此该方案应根据每项研究的具体情况进行优化。第五，在制备过程中必须避免出...

2000年，Gan 等人描述了一种用于神经系统中单个神经元和胶质细胞的快速标记技术，该技术结合了多种疏水性染料，可同时以不同颜色标记大量脑细胞1,2。最近，Seabold 等人3描述了一种弹道式标记技术，可将荧光染料（Dil）导入脑切片中的神经元。作为一种多功能的染色技术，弹道式标记因其适用于多种动物物种及广泛年龄段而受到青睐。此外，该技术还可与免疫染色结合使用，以鉴定脑细胞的不同亚群3。与传统技术（如 Golgi-Cox 银浸染法、显微注射法）4相比，弹道式标记能够更清晰地分辨形态学特征，包括树突棘，这一特性对于推断神经元复杂性及突触连接性至关重要5。
兴奋性锥体神经元的特征是具有单个较大的顶树突、多个较短的基底树突以及数千个树突棘6。锥体神经元存在于多个与高级认知功能相关的脑区，包括前额叶皮层（PFC）和海马体。在前额叶皮层中，锥体神经元分布于II/III层和V层，各层神经元具有独特的形态。具体而言，前额叶皮层II/III层的锥体神经元其顶树突较短，分支较少，相较于V层的锥体神经元6。在海马体中，锥体神经元位于CA1和CA3区域，且各区域表现出不同的形态特征。具体而言，CA1区域的锥体神经元具有更为明显的顶树突，其分支点距离胞体较CA3区域更远6。
前额叶皮层（PFC）和海马体中的锥体神经元上的树突棘是兴奋性突触的主要部位7。树突棘的形态特征通常被分为三大类（即细长型、短粗型和蘑菇型8），这些特征与兴奋性突触的大小相关9。细长型树突棘具有细长的颈部、较小的球状头部以及较小的突触后密度，其结构较不稳定，形成的连接较弱。相比之下，蘑菇型树突棘具有较大的头部，因其体积较大而被认为能够形成更强的突触连接。截然不同的是，短粗型树突棘缺乏明显的棘颈，其头部与颈部的体积比大致相等8。在海马体中还可观察到分枝型树突棘，即同一树突棘颈部延伸出多个头部10。因此，树突棘的形态变化可能反映其功能特性与结构能力。此外，研究已表明树突棘的大小和形状与其结构可塑性相关，由此提出小树突棘参与学习与注意力过程，而更大、更稳定的树突棘则参与包括记忆在内的长期过程11。另外，树突棘在树突上的分布可能与突触连接性相关5,12。
因此，本方法学论文具有三个目标：1）介绍我们的弹道标记技术方案，该方案的成功率（即符合筛选标准且适合分析的神经元比例）达到83.3%5,12,13，并已应用于多个脑区（如前额叶皮层、伏隔核、海马）；2）展示该技术的可推广性及其在体外培养神经元中的应用；3）详细说明神经元重建软件中所采用的方法学，以及由此类数据可得出的推论。

<table><tbody><tr><td>20Gx25mm 精密针头</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>24 孔细胞培养板</td><td>Costar</td><td>3562</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿</td><td>MatTek 公司</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>B-27 添加剂</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>50X</td></tr><tr><td>枪管衬管</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2417</td><td></td></tr><tr><td>硼砂</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>弹匣架</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2426</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦成像软件</td><td>Nikon</td><td>EZ-C1</td><td>版本 3.81b</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>TE-2000E</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>DilC18(3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>F344 大鼠</td><td>(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>100X</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4641</td><td>10X</td></tr><tr><td>Helios 扩散屏</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2475</td><td></td></tr><tr><td>Helios 基因枪试剂盒</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2411</td><td></td></tr><tr><td>Helios 基因枪系统</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2431</td><td></td></tr><tr><td>氦气软管组件</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2412</td><td></td></tr><tr><td>虹膜镊</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Fisher Scientific</td><td>D150-1</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida 360 软件</td><td>mbf bioscience</td><td></td><td>树突棘分析</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>5295</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>大鼠脑切片模具，300 - 600 g，冠状位，0.5 mm</td><td>Ted Pella</td><td>15047</td><td></td></tr><tr><td>七氟烷</td><td>Merritt Veterinary Supply</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Life Technologies</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%</td><td></td></tr><tr><td>注射器套件</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2421</td><td></td></tr><tr><td>Tefzel 管路</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2441</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>管路切割器</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2422</td><td></td></tr><tr><td>管路预处理站</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2418</td><td></td></tr><tr><td>钨 M-25 微载体 1.7 &amp;micro;m</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2269</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 剪刀</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr></tbody></table>

脑片及原代细胞培养中锥体神经元的弹道标记

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

已有报道称，树突棘的大小和形状与其结构可塑性相关。为了鉴定锥体神经元及树突棘的形态结构，可采用弹道标记技术。在本实验方案中，使用DiI C18(3)染料对锥体神经元进行标记，并利用神经元重建软件分析神经元形态和树突棘。为研究神经元结构，进行树突分支分析和Sholl分析，分别用于推断树突分支复杂性和神经元树突丛的复杂性。树突棘的评估采用重建软件内置的自动辅助分类算法，将树突棘分为四类（即细长型、蘑菇型、短粗型和丝状伪足型）。此外，还选取另外三个参数（即长度、头部直径和体积）来评估树突棘形态的变化。为验证弹道标记技术广泛应用的潜力，成功标记了体外细胞培养中的锥体神经元。总体而言，弹道标记方法独特且有效，可用于可视化大鼠不同脑区的神经元，结合先进的重建软件，有助于研究人员阐明神经认知功能障碍的潜在机制。

在图2A中，通过弹道标记技术鉴定了大鼠脑切片海马区典型的锥体神经元，其特征为具有一条较大的顶端树突以及围绕胞体的数条较小的基底树突。图2B展示了在检测到胞体、追踪树突分支并识别树突棘后，神经元在神经元重建定量分析软件中的形态。随后，利用神经元重建定量分析软件对数据进行分析，从而能够评估树突分支复杂性（图2C）和神经元树突复杂性（图2D）。
在图2C中，我们采用来自“Tree Totals”输出的离心分支排序方法，统计沿每条树突所经过的节段数量，并确定分支级数。对1–15级分支的各分支级数节段的相对频率进行了分析。当各组之间观察到树突分支分布的变化时，可推断树突分支复杂性的改变。此外，进行了Sholl分析作为神经元树突结构复杂性的补充评估指标，即量化每个样本切片中从胞体起始每10 µm处树...

我们提出了一种标记和分析锥体神经元的方案，这对于评估可能介导神经化学和行为异常的神经元及树突棘形态学改变至关重要。

已有研究报道，树突棘的大小和形状与其结构可塑性相关。为鉴定……的形态结构，

本方案可评估可能与神经化学和行为异常相关的神经元及树突棘的潜在形态学改变。该方法具有独特性，可用于可视化大鼠不同脑区的神经元，结合先进的重建软件，有助于研究人员阐明神经认知功能障碍的潜在机制。首先根据文稿说明配制PVP溶液。用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）填充管道，静置20分钟，然后用10毫升注射器从另一端排出。将170毫克钨微载体珠与250微升氯甲烷混合。然后充分涡旋振荡该悬浮液。接着，将6毫克疏水性染料DilC18(3)加入300微升二氯甲烷中，并进行涡旋振荡。用移液器吸取250微升钨珠悬浮液滴加到玻片上。等待悬液自然风干，加入 300 微升染料溶液。干燥后，用刀片将混合物均分至两个 1.5 毫升离心管中，并用水充满离心管。将混合物置于水浴中超声处理，直至形成均匀溶液。确保超声波破碎仪的探针直接接触管子。将两种混合物加入一个15毫升的锥形管中，再超声处理三分钟，确保没有染料包被的珠子大团块残留。超声处理后，用10毫升注射器将混合物吸入PVP包被的管路中，并将管路送入制备站。旋转管路一分钟。使用注射器小心地将所有水去除。打开氮气，调节氮气流速至约 0.5 升/分钟。在制备站中旋转管路，并用氮气干燥 30 分钟。从工作站上取下管路，使用管路切割器将其切成13毫米长的节段。确保大鼠对有害刺激无反应且反射消失，然后将其固定于仰卧位。沿胸骨中线做切口。用剪刀分离膈肌并打开胸腔。然后将一根20号25毫米的针头插入左心室。立即用剪刀剪开右心房，并以每分钟5毫米的流速灌注15毫升100毫摩尔的磷酸盐缓冲液（PBS）。随后用PBS配制的4%多聚甲醛灌注100毫升。灌注完成后，取出整个大鼠脑组织。随后用4%PFA后固定10分钟。使用大鼠脑切片模具制备500 µm厚的冠状切面。先进行一次初步切割，并保持刀片位置不变。然后使用第二把刀片进行第二次切割，并垂直移除第一把刀片，使组织保留在刀片表面。将脑片放入24孔板中，每孔加入1毫升PBS。重复此操作，直至所有切片完成。移除每个目标孔中的 PBS。将带有 Dil/钨管的软骨样品装入施用器中。在两层网筛之间放置一片滤纸。将施用器连接到氦气管上，然后将氦气的输出压力调节至每平方英寸90磅。将施用器垂直放置在目标孔的中心位置，样品与网筛之间距离为1.5厘米。然后点燃稀释/钨管。将软骨装入下一根管中，并持续从管中向剩余的切片发射微珠。用100毫摩尔的PBS填充24孔板。用500微升新鲜PBS清洗切片三次，确保清洗过程中切片不翻转。清洗结束后，向切片中加入500微升新鲜PBS。在4°C避光条件下孵育三小时。孵育结束后，使用细刷将脑切片转移至载玻片上，并立即向每个切片加入1毫升抗荧光淬灭封片剂。将 22 × 15 毫米的盖玻片覆盖在切片上，并在避光条件下干燥载玻片。打开共聚焦显微镜系统，切换至 60X 物镜。根据论文中的说明调整成像参数。根据脑区边界和神经元的形态学特征，获取目标神经元类型的Z轴层扫图像。在出生后第一天从F344/N大鼠中分离原代皮层神经元，并将其培养在35毫米玻璃底培养皿中一周时间。在分离后的第三天更换一半培养基。用1毫升100毫摩尔的PBS洗涤培养皿两次。在室温下用4%多聚甲醛固定细胞15分钟。按照先前所述方法进行弹道标记细胞。用 1 毫升 PBS 再洗涤三次。向细胞中加入 500 微升 PBS，在 4 °C 避光条件下孵育 3 小时。然后加入 200 微升抗荧光淬灭封片剂。并对每个靶向神经元获取Z轴层扫图像。利用弹道标记技术，可在大鼠脑切片的海马区鉴定出典型的锥体神经元，其特征为具有一条较大的顶端树突和围绕胞体的数条较小的基底树突。采用神经元重建定量分析软件追踪树突分支并检测树突棘。随后，使用软件评估树突分支复杂性和神经元树突复杂性。通过长度、体积和头部直径评估树突棘的形态学变化。然后将树突棘分为细长型、短粗型和蘑菇型。并分析了每条半径之间棘突数量的相对频率。此外，弹道标记技术在培养的原代锥体神经元中得到了验证。锥体神经元的鉴定依据是其胞体的三角形形态以及粗大的顶端树突。然后使用神经元重建软件分析细小树突棘的分布及树突棘长度。在实施该方案时，需注意避免出现大量团聚或聚集的包被弹道染料的碳化钨微珠，以免影响起始制备。团聚物将导致无法区分单个神经元。结合神经元重建软件，该方法可用来研究海马区锥体神经元的神经元形态及树突棘形态。神经元重建软件利用算法对树突棘进行自动辅助分类。对多种神经元参数的定量分析，有助于更深入理解神经元认知功能障碍的潜在机制。

ballistic-labeling-pyramidal-neurons-brain-slices-primary-cell

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

脑切片和原细胞培养中金字塔神经元的弹道标记

我们展示了如何使用基因枪将荧光染料（如 DiI）导入不同年龄的啮齿类动物和非人灵长类动物脑切片中的神经元。在本实验中，我们使用成年小鼠（3-6 月龄）和成年食蟹猴（9-15 岁）。该技术最初由 Lichtman 博士实验室描述（Gan et al.,...

啮齿类与非人灵长类脑切片神经元的DiOLISTIC标记

本实验方案旨在建立并维持一种新皮层脑片的器官型培养体系，以便对锥体神经元进行电生理记录。...

从新皮层脑片培养标本进行全细胞记录

本视频演示了对含有生物胞素标记的中间神经元的固定大鼠脑切片进行染色的操作步骤。该实验方案包括与亲和素-生物素复合物（ABC）孵育、使用辣根过氧化物酶（HRP）及显色底物染色、用四氧化锇固定组织结构，以及将组织包埋于树脂中以用于成像。...

大鼠海马脑片中生物胞素标记的中间神经元染色可视化方法

本文描述了一种在新皮层预定义的功能微区中用荧光染料标记神经元的方法。首先，利用内在信号光学成像获取功能图谱；然后，采用双光子显微镜对图谱中特定微区内的神经元进行标记和成像。...

结合内在信号成像与双光子成像技术实现新皮层特定功能微区神经元的靶向标记

神经元膜运输动态调控质膜蛋白的可用性，并显著影响神经传递。 迄今为止，在成年神经元中测量内吞运输仍具挑战性。 本文中，我们描述了一种高效且定量的方法，可在急性脑切片中体外（ex...

脑片生物素化：一种 离体 成年神经元中区域特异性血浆膜蛋白运输的测量方法

本文介绍了一种利用前脑和小脑脑片培养系统研究NG2细胞和少突胶质细胞的技术。该方法可在保持组织细胞结构完整性的同时，通过简便地调控细胞外环境，观察少突胶质细胞谱系中细胞增殖与分化的动态过程。...

用于研究少突胶质细胞动态及髓鞘形成的器官型脑片培养技术

本方案介绍了一种通过生物胞素填充及后续免疫组织化学处理，对电生理记录过程中进行膜片钳的神经元进行形态学重建的方法。我们展示，经过染色并加盖盖玻片的较厚生物胞素填充脑片，可在数天后使用第二种一抗重新染色 或数月后。...

生物素填充并处理的脑组织切片中神经化学标记物的免疫染色

本文介绍了一种改良的滚管法，可用于对啮齿类动物脑片进行长期培养，并在光刻蚀盖玻片上实现精确复位的间歇性高分辨率成像。该方法能良好维持神经元的存活率和脑片的形态结构。文中还展示了利用该完全封闭系统，结合病毒实现细胞类型特异性表达的应用实例。...

封闭系统中长期培养脑片期间实现精确定位与重复间歇成像的改良滚筒管法

我们介绍一种制备小鼠背侧-中间海马区急性脑片的方案。我们将这种横向切片制备方法与冠状切片在记录质量以及所记录神经元形态特征的保存方面进行比较。...

成年小鼠背侧海马急性脑片制备用于全细胞记录及齿状回神经元重建

本方案展示了一种简单且可靠的用于研究的方法 原位 轴突生长与生长锥动态。该方法描述了如何制备 离体...

在体 可视化急性离体胚胎脑切片培养中轴突生长与生长锥动态

本文介绍了一种通过光遗传学工具对特定脑区进行病毒转导的实验方案，以实现对急性啮齿类动物脑切片中特定突触的电生理特性进行表征。...

离体 光遗传学探究内侧前额叶皮层至外侧内嗅皮层的长程突触传递与可塑性

了解大鼠脑切片中金字塔神经元的弹道标记方法，结合神经元重建软件分析树突棘形态与神经可塑性。该技术为研究神经认知功能障碍机制提供了可靠的定量分析工具。

脑片及原代细胞培养中锥体神经元的弹道标记

探索更多视频