脑片及原代细胞培养中锥体神经元的弹道标记

本方案可评估可能与神经化学和行为异常相关的神经元及树突棘的潜在形态学改变。该方法具有独特性，可用于可视化大鼠不同脑区的神经元，结合先进的重建软件，有助于研究人员阐明神经认知功能障碍的潜在机制。首先根据文稿说明配制PVP溶液。

用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）填充管道，静置20分钟，然后用10毫升注射器从另一端排出。将170毫克钨微载体珠与250微升氯甲烷混合。

然后充分涡旋振荡该悬浮液。接着，将6毫克疏水性染料DilC18(3)加入300微升二氯甲烷中，并进行涡旋振荡。用移液器吸取250微升钨珠悬浮液滴加到玻片上。

等待悬液自然风干，加入 300 微升染料溶液。干燥后，用刀片将混合物均分至两个 1.5 毫升离心管中，并用水充满离心管。将混合物置于水浴中超声处理，直至形成均匀溶液。

确保超声波破碎仪的探针直接接触管子。将两种混合物加入一个15毫升的锥形管中，再超声处理三分钟，确保没有染料包被的珠子大团块残留。

超声处理后，用10毫升注射器将混合物吸入PVP包被的管路中，并将管路送入制备站。旋转管路一分钟。

使用注射器小心地将所有水去除。打开氮气，调节氮气流速至约 0.5 升/分钟。在制备站中旋转管路，并用氮气干燥 30 分钟。

从工作站上取下管路，使用管路切割器将其切成13毫米长的节段。确保大鼠对有害刺激无反应且反射消失，然后将其固定于仰卧位。

沿胸骨中线做切口。用剪刀分离膈肌并打开胸腔。然后将一根20号25毫米的针头插入左心室。

立即用剪刀剪开右心房，并以每分钟5毫米的流速灌注15毫升100毫摩尔的磷酸盐缓冲液（PBS）。随后用PBS配制的4%多聚甲醛灌注100毫升。灌注完成后，取出整个大鼠脑组织。

随后用4%PFA后固定10分钟。使用大鼠脑切片模具制备500 µm厚的冠状切面。先进行一次初步切割，并保持刀片位置不变。

然后使用第二把刀片进行第二次切割，并垂直移除第一把刀片，使组织保留在刀片表面。将脑片放入24孔板中，每孔加入1毫升PBS。重复此操作，直至所有切片完成。

移除每个目标孔中的 PBS。将带有 Dil/钨管的软骨样品装入施用器中。在两层网筛之间放置一片滤纸。

将施用器连接到氦气管上，然后将氦气的输出压力调节至每平方英寸90磅。将施用器垂直放置在目标孔的中心位置，样品与网筛之间距离为1.5厘米。

然后点燃稀释/钨管。将软骨装入下一根管中，并持续从管中向剩余的切片发射微珠。用100毫摩尔的PBS填充24孔板。

用500微升新鲜PBS清洗切片三次，确保清洗过程中切片不翻转。清洗结束后，向切片中加入500微升新鲜PBS。

在4°C避光条件下孵育三小时。孵育结束后，使用细刷将脑切片转移至载玻片上，并立即向每个切片加入1毫升抗荧光淬灭封片剂。

将 22 × 15 毫米的盖玻片覆盖在切片上，并在避光条件下干燥载玻片。打开共聚焦显微镜系统，切换至 60X 物镜。根据论文中的说明调整成像参数。

根据脑区边界和神经元的形态学特征，获取目标神经元类型的Z轴层扫图像。在出生后第一天从F344/N大鼠中分离原代皮层神经元，并将其培养在35毫米玻璃底培养皿中一周时间。在分离后的第三天更换一半培养基。

用1毫升100毫摩尔的PBS洗涤培养皿两次。在室温下用4%多聚甲醛固定细胞15分钟。按照先前所述方法进行弹道标记细胞。

用 1 毫升 PBS 再洗涤三次。向细胞中加入 500 微升 PBS，在 4 °C 避光条件下孵育 3 小时。然后加入 200 微升抗荧光淬灭封片剂。

并对每个靶向神经元获取Z轴层扫图像。利用弹道标记技术，可在大鼠脑切片的海马区鉴定出典型的锥体神经元，其特征为具有一条较大的顶端树突和围绕胞体的数条较小的基底树突。采用神经元重建定量分析软件追踪树突分支并检测树突棘。

随后，使用软件评估树突分支复杂性和神经元树突复杂性。通过长度、体积和头部直径评估树突棘的形态学变化。然后将树突棘分为细长型、短粗型和蘑菇型。

并分析了每条半径之间棘突数量的相对频率。此外，弹道标记技术在培养的原代锥体神经元中得到了验证。锥体神经元的鉴定依据是其胞体的三角形形态以及粗大的顶端树突。

然后使用神经元重建软件分析细小树突棘的分布及树突棘长度。在实施该方案时，需注意避免出现大量团聚或聚集的包被弹道染料的碳化钨微珠，以免影响起始制备。团聚物将导致无法区分单个神经元。

结合神经元重建软件，该方法可用来研究海马区锥体神经元的神经元形态及树突棘形态。神经元重建软件利用算法对树突棘进行自动辅助分类。对多种神经元参数的定量分析，有助于更深入理解神经元认知功能障碍的潜在机制。