Name: 子结构分析仪:用于荧光显微镜图像中细胞体快速探索和精确分析的用户友好型工作流程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: 了解基于开源软件Icy的细胞体自动分析方法，用于荧光显微镜图像的快速探索与精确分析。该工作流无需丰富图像分析经验即可实现多通道图像预处理、自动分割及ROI定量，为细胞成像研究提供高效易用的解决方案。

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G.H. 获得了法国研究与技术部研究生奖学金的资助。L.H. 获得了洛林癌症研究所（ICL）研究生奖学金的资助，而 Q.T. 获得了法国国家研究署（ANR）监管的公共资助，该资助属于第二期“未来投资计划”FIGHT-HF 项目（项目编号：ANR-15-RHU4570004）。本研究由法国国家科学研究中心（CNRS）和洛林大学（UMR 7365）提供经费支持。

<ol><li>Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolved+fluorescence+microscopy%3A+Nobel+Prize+in+Chemistry+2014+for+Eric+Betzig%2C+Stefan+Hell%2C+and+William+E.+Moerner%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner.</a> Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).</li>
<li>Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imagining+the+future+of+bioimage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Imagining the future of bioimage analysis.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).</li>
<li>Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., Münzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+free+software+tools+for+image+analysis+of+fluorescence+cell+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs.</a> Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).</li>
<li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icy%3A+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li>
<li>Girish, V., Vijayalakshmi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affordable+image+analysis+using+NIH+Image%2FImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ.</a> Indian J Cancer. 41 (1), 47(2004).</li>
<li>Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+on+image+segmentation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Procedia+Computer+Science%22%5BJournal%5D)">Survey on image segmentation techniques.</a> Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).</li>
<li>Molecular Devices. MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy">https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy</a> (2018).</li>
<li>Nikon. NIS-Elements Imaging Software. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element">https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element</a> (2014).</li>
<li>Meyer, F., Beucher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Communication+and+Image+Representation%22%5BJournal%5D)">Morphological segmentation.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).</li>
<li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+Function+in+Redox+Signaling+and+Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li>
<li>D'Autréaux, B., Toledano, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+as+signalling+molecules%3A+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis.+Nature+Reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).</li>
<li>Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS%2C+Cell+Senescence%2C+and+Novel+Molecular+Mechanisms+in+Aging+and+Age-Related+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127(2016).</li>
<li>Disher, K., Skandalis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+the+modulation+of+mRNA+splicing+fidelity+in+humans+by+oxidative+stress+and+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53.</a> Genome. 50 (10), 946-953 (2007).</li>
<li>Takeo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress-induced+alternative+splicing+of+transformer+2%CE%B2+%28SFRS10%29+and+CD44+pre-mRNAs+in+gastric+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2β (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).</li>
<li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress+Triggers+Body-Wide+Skipping+of+Multiple+Exons+of+the+Spinal+Muscular+Atrophy+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene.</a> PLOS ONE. 11 (4), 0154390(2016).</li>
<li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spliceosome+Structure+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Spliceosome Structure and Function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707(2011).</li>
<li>Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annotated+high-throughput+microscopy+image+sets+for+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Annotated high-throughput microscopy image sets for validation.</a> Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+bodies+are+linked+to+genome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cajal bodies are linked to genome conformation.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7, 100(2006).</li>
<li>McQuin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler+3.0%3A+Next-generation+image+processing+for+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005970(2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

目前有越来越多的免费软件工具可用于荧光细胞图像的分析。用户必须根据自身研究问题的复杂程度、图像处理知识水平以及愿意在分析上投入的时间，正确选择合适的软件。Icy、CellProfiler 或 ImageJ/Fiji 均为兼具易用性与功能性的强大工具3。Icy 是一款独立运行的软件，具有清晰的图形用户界面（GUI），其“Protocols”模块提供点击式操作界面，可方便地设计或调整工作流程4。该软件支持并可调用 ImageJ 插件，进一步增强了其功能，同时得益于庞大的用户社区，提供了丰富的文档资源。我们利用 Icy 软件在易用性与功能性方面的优势，开发了 Substructure Analyzer 工作流程。其主要目标是提供一种自动化解决方案，用于对多幅图像中的细胞荧光信号进行完整分析。该分析过程包括图像预处理、目标分割以及荧光信号分析。
Icy 网站上分享了多个协议，建议使用 Icy 功能来检测和分析荧光信号（如细胞焦点）。然而，其中一些协议每次运行仅处理一幅图像，未将...

光学显微镜，尤其是荧光显微镜，是生物科学中常用的强大且多用途的技术。通过特异性的荧光标记，这些技术能够实现对蛋白质或RNA等多种生物分子的精确定位。过去十年间，显微镜与成像技术迅速发展，2014年诺贝尔化学奖授予埃里克·贝齐格（Eric Betzig）、斯特凡·W·赫尔（Stefan W. Hell）和威廉·E·莫纳（William E. Moerner），以表彰他们在超分辨荧光显微镜（SRFM）1发展中的贡献。超分辨荧光显微镜突破了传统光学显微镜的衍射极限，使其达到纳米尺度。此外，活体成像和高通量筛选等技术的进步也显著增加了每次实验所需处理的数据量和复杂性。大多数情况下，研究人员面对的是高度异质性的细胞群体，并希望在单细胞水平上分析表型特征。
最初，诸如焦点计数之类的分析是通过肉眼进行的，一些研究人员认为这种方法更优，因为它能够对计数过程实现完全的视觉控制。然而，此类数据的手动分析耗时过长，不同观察者之间易产生差异，并且无法获取更复杂的特征信息，因此基于计算机辅助的分析方法正被广泛采用并几乎成为必然选择2。生物图像信息学方法显著提高了数据分析效率，且避免了人工计数分析中不可避免的操作者主观性和潜在偏差。该领域日益增长的需求以及计算机性能的提升，促使大量图像分析平台得以开发。其中一些工具可免费获取，使用户能够利用个人计算机进行多种分析操作。近期已建立了一种针对开放获取工具的分类体系3，其中将 Icy4 列为兼具易用性与功能性的强大软件。此外，Icy 还具备与 ImageJ 互通的优势。
对于不具备图像分析专业知识的用户而言，主要障碍是&#160;根据问题选择合适的工具并进行正确调整&#160;参数通常难以充分理解，且设置时间往往较长。Icy 提出了一种名为“Protocols”的用户友好型点击式界面，通过组合其全面库中提供的若干插件来构建工作流程。4灵活的模块化设计和点选式界面使得非编程人员也能轻松完成分析设置。本文介绍了一种名为 亚结构分析器在Icy界面中开发的该工作流程，旨在分析特定细胞区室中的荧光信号，并测量亮度、焦点数量、焦点大小及空间分布等多种特征。该流程可解决多个问题，包括信号转位的定量分析、表达荧光报告分子的转染细胞分析，或对单个细胞中不同细胞亚结构来源的焦点进行分析。它支持多幅图像的同步处理，输出结果将导出为制表符分隔的工作表文件，可在常用电子表格程序中打开。
亚结构分析器（Substructure Analyzer）流程如图1所示。首先，对指定文件夹中的所有图像进行预处理，以提高其信噪比。此步骤可提高后续步骤的效率，并缩短运行时间。接着，识别并分割感兴趣区域（ROIs），即应检测荧光信号的图像区域。最后，对荧光信号进行分析，并将结果导出至制表符分隔的工作表中。
对象分割（边界的检测）是图像分析中最具挑战性的步骤，其效率决定了最终细胞测量结果的准确性。在图像中首先识别出的对象（称为初级对象）通常是DNA染色图像中的细胞核（如DAPI或Hoechst染色），但初级对象也可以是整个细胞、微珠、斑点、肿瘤，或任何被染色的结构。在大多数生物图像中，细胞或细胞核相互接触或重叠，导致简单且快速的算法失效。迄今为止，尚无一种通用算法能够对所有对象实现完美的分割，主要原因在于对象的特征（如大小、形状或纹理）会影响分割的效率5。显微镜软件通常附带的分割工具（如Molecular Devices公司的MetaMorph成像软件6，或Nikon公司的NIS-Elements Advanced Research软件7）一般基于相关匹配、阈值分割或形态学操作等标准技术。尽管这些方法在基础系统中有效，但在更具挑战性和特定的实验条件下，其局限性迅速显现。事实上，分割结果对细胞类型、细胞密度或生物标志物等实验参数高度敏感，通常需要针对大规模数据集进行反复调整。Substructure Analyzer工作流程整合了从简单到更复杂的多种算法，可根据图像复杂程度和用户需求提供不同的分割方案。该流程特别引入了基于标记的分水岭算法8，用于处理高度聚集的对象。该分割方法的有效性依赖于在每个对象上选择独立的标记点。这些标记点通常需要手动选取，以获得准确的全图分割参数，但当面对大量对象时，这一过程极为耗时。Substructure Analyzer提供了一种自动检测标记点的方法，从而实现了高效的分割过程。在大多数情况下，分割是图像分析的瓶颈步骤，其耗时会因图像分辨率、每幅图像中对象的数量以及对象的聚集程度而显著变化。在标准台式计算机上，典型的分析流程每幅图像需要几秒至5分钟。对于更复杂的图像分析，可能需要更高性能的计算机以及一定的图像分析基础知识。
代表性结果中的多个示例展示了该工作流程的灵活性和功能性。该工作流程的优势在氧化应激（OS）条件下对细胞核亚结构的研究中尤为突出。OS是指氧化还原稳态失衡，偏向于氧化剂的一侧，通常伴随着高水平的活性氧（ROS）。由于ROS可作为信号分子发挥作用，其浓度和亚细胞定位的变化会正向或负向影响众多调控生理功能的通路与网络，包括信号转导、修复机制、基因表达、细胞死亡和增殖9,10。因此，OS直接参与多种病理过程（如神经退行性疾病、心血管疾病、癌症、糖尿病等），同时也与细胞衰老密切相关。因此，解析OS对人类细胞结构与功能的影响，是理解OS在人类疾病发生与发展过程中所起作用的关键步骤。已有研究表明，OS可通过调控多种转录因子（如p53、Nrf2、FOXO3A）来调节转录过程，从而影响基因表达11，同时也可通过影响多个共转录和转录后过程（如前体RNA的可变剪接（AS））来实现调控12,13,14。初级编码和非编码转录本的可变剪接是一种关键机制，通过生成不同的转录本异构体来提高基因组的编码能力。AS由一个称为剪接体的大型核糖核蛋白复合物完成，该复合物包含近300种蛋白质和5种富含U的小核RNA（UsnRNAs）15。剪接体的组装和AS过程在细胞内受到严密调控，其中部分剪接体成熟步骤发生在一类无膜的核内区室——卡哈尔体（Cajal Bodies）中。这些核亚结构的结构和组成具有高度动态性，主要由其RNA和蛋白质组分与coilin蛋白之间的多价相互作用所驱动。利用Substructure Analyzer工作流程对数千个细胞进行分析，成功表征了OS对卡哈尔体此前从未被描述过的影响。实验数据表明，OS会改变卡哈尔体的成核过程，导致coilin蛋白在核质中重新分布，形成大量更小的核内焦点。这种卡哈尔体结构的改变可能影响剪接体的成熟过程，并参与OS对可变剪接的调控作用。

<table><tbody><tr><td>16% 甲醛溶液（w/v），无甲醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>用于固定细胞</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>荧光二抗</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 标记的山羊抗小鼠抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21425</td><td>荧光二抗</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 标记的鬼笔环肽</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A34055</td><td>荧光二抗</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白标准品（BSA）</td><td>euromedex</td><td>04-100-812-E</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796-500ml</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>Duolink In Situ DAPI 封片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040-5ML</td><td>封片剂</td></tr><tr><td>人：HeLa S3 细胞</td><td>IGBMC, Strasbourg, France</td><td></td><td>用于实验的细胞系</td></tr><tr><td>30% 过氧化氢溶液（H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ml</td><td>用作应激刺激剂</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 转染试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668-019</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗coilin抗体</td><td>abcam</td><td>ab11822</td><td>coilin特异性抗体</td></tr><tr><td>Nikon Optiphot-2 荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>落射荧光显微镜</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>转染培养基</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (10x)</td><td>gibco</td><td>70011-036</td><td>用于洗涤细胞</td></tr><tr><td>兔多克隆抗53BP1抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA1-16565</td><td>53BP1特异性抗体</td></tr><tr><td>兔多克隆抗EDC4抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4200114</td><td>EDC4特异性抗体</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>6683</td><td>用于细胞通透处理</td></tr></tbody></table>

亚结构分析器：一种用于快速探索与精确分析荧光显微图像中细胞结构的用户友好型工作流程

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

过去十年见证了荧光显微技术的突破性进展，不仅体现在空间分辨率的提升，还包括活细胞成像和高通量显微技术的发展。这导致单个实验所产生的显微图像数据在数量和复杂性上持续增加。由于显微图像数据的手动分析极为耗时、具有主观性，并且难以实现定量分析，因此生物图像分析的自动化正变得几乎不可避免。我们构建了一个名为 Substructure Analyzer 的信息学工作流程，用于完全自动化荧光显微图像中的信号分析。该工作流程基于用户友好的开源平台 Icy 开发，并整合了 ImageJ 的功能模块。其包括图像预处理以提高信噪比、单个细胞的分割（细胞边界的检测），以及对富集于特定细胞区室中的细胞结构的检测与定量。该工作流程的主要优势在于，通过友好的用户界面，使不具备图像分析专业知识的研究人员也能使用复杂的生物成像分析功能。此外，该流程具有高度模块化特性，可适用于多种研究需求，从核质转位的表征到不同细胞亚结构中各类细胞结构的比较分析均可适用。本工作流程的功能通过在氧化应激（OS）条件下对卡哈尔（盘绕）小体的研究得以展示。荧光显微结果显示，在人类细胞中，OS 诱导数小时后，卡哈尔小体的完整性即受到显著影响。这一效应表现为盘绕蛋白（coilin）在典型卡哈尔小体中的成核减少，同时伴随盘绕蛋白在核质中重新分布，形成数量增多但体积更小的焦点结构。鉴于盘绕蛋白在卡哈尔小体组分与周围核质之间物质交换中的核心作用，OS 所引发的盘绕蛋白重分布可能影响卡哈尔小体的组成及其功能。

所有描述的分析均在一台标准笔记本电脑（64 位，2.80 GHz 四核处理器，16 GB 随机存取存储器（RAM））上完成，该电脑运行 64 位版本的 Java。随机存取存储器是需要考虑的重要参数，具体取决于待分析图像的数量和分辨率。使用 32 位版本的 Java 会将内存限制在约 1300 MB，这可能不适用于大数据分析，而 64 位版本则允许增加分配给 Icy 的内存。图 3 显示了对不同类型图像和不同分辨率进行分割所需的时间。结果证实，高分辨率会显著增加初级目标分割所需的时间。
下文展示的数据表明，Substructure Analyzer 工作流程可用于解决细胞和分子生物学中遇到的大多数常见问题（细胞计数、焦点计数与分析、转位分析）。
在大量细胞中测量特定区室内的分子精确比例，或亚细胞区域间定位变化，可能是一项非常繁琐且易出错的任务，尤其是当手动操作时。图4展示了该工作流程快速而精确...

我们提供了一种免费的工作流程，专为快速探索和精确分析荧光显微镜图像中特定细胞区室内的细胞结构而设计。该用户友好的工作流程基于开源软件 Icy 构建，同时利用了 ImageJ 的功能。此分析流程无需图像分析专业知识即可使用。

过去十年的特征是荧光显微技术的突破，这不仅体现在空间分辨率的提升，也体现在……

亚结构分析器是一种用户友好的工作流程，可自动分析多种过程显微镜指标。它并非指零吨开源软件 Icy，同时也利用了机器功能。重要的是，该工作流程是一种经济可行的方案，可用于知识获取和图像分析。在工作流程中加载多通道图像，并进行预处理，以提高信噪比并去除成像伪影或缺陷。随后，图像分割将感兴趣区域（即ROIs）从背景中分离出来。根据聚类程度和感兴趣对象的性质，可选择多种分割方法。分割后的对象将使用特定描述符保存在指定文件夹中。随后在行内对力和信号进行分析，并提取多个特征，如位置、大小、形状、密度纹理等，而数量和大小等数据则导出至自动生成的电子表格中。请从 Icy 官方网站下载 Icy 软件。然后从 Icy 协议库中下载子结构分析协议。打开 Icy，点击功能区菜单中的“工具”。点击“协议”以打开协议编辑界面。单击加载并打开协议子结构分析器。协议加载可能需要几秒钟。该工作流程由13个通用模块组成，每个模块作为一个流水线，包含多个执行特定子任务的方框。每个模块或方框均标有编号，并在工作流程中具有特定的等级。单击该编号后，将所选模块尽可能分配到最靠前的位置，其余模块的位置将相应重新排列。单击左上角图标可折叠或展开该模块。该模块还可放大、缩小或删除。工作流程中的每条管道均由多个通过输入和输出相互连接的方框网络正确构成。要建立连接，请点击输出端并保持按住，直到光标对准任意输入端。可通过点击输出标签来删除连接。如有需要，请重命名文件，使待合并的序列具有相同的名称前缀，并以不同的分隔符结尾。例如，图像 A 中各个通道的序列命名为 image A_underscore_red、image A_underscore_blue，依此类推。在同一文件夹中，为每个待合并的通道创建一个新的文件夹。例如，要合并红色、绿色和蓝色通道，需创建三个文件夹，并将相应的序列分别存储在这些文件夹中。仅使用合并通道模块，移除其他模块，并将该方案另存为合并通道。通过访问各个设置框来设定参数。在通道编号 x 的设置框中，选择要提取的通道。在传统的 RGB 图像中，0 代表红色，1 代表绿色，2 代表蓝色。在文本框中，文件夹通道编号 x，反斜杠后为包含通道 x 图像的文件夹名称。在文本框中，分隔通道编号 x。用于图像名称的分隔符。在“颜色通道映射通道数 x”框中，输入一个数字，以指定在 Icy 中可视化相应通道时所使用的模型列。在“合并图像格式”框中，填写用于保存合并图像的文件扩展名。在合并通道模块的左上角，单击“文件夹”右侧的链接。在弹出的打开对话框中，双击包含已在“文件夹通道编号一”框中定义的第一个通道序列的文件夹。然后单击“打开”，运行该方案。合并后的图像将保存在与各通道文件夹相同目录下的“merged”文件夹中。目标分割是图像分析中最具有挑战性的步骤，其效率决定了最终测量结果的准确性。因此，结构分析器整合了简单和更复杂的算法，以提供针对图像复杂性和用户需求的不同方案。如果对象彼此不接触，则用户无需单独区分成簇的对象，可使用块分割 A。当对象彼此不接触但部分对象间距较近时，使用块分割 B。对于聚类程度高且呈凸形的对象，使用块分割 C。若对象具有较高的聚类程度且形状不规则，则使用块分割 D。在细胞质聚簇中使用块分割，利用已分割的细胞核作为标记，单独分割相互接触的细胞质。用于初级对象分割的块可独立运行，因此可在同一次分析中使用多个块，以比较其对特定亚结构的分割效率，或用于分割不同类型的亚结构。为了说明分割方法，我们选择了能够适应更多问题的块分割 B。要使用此博客，请首先将其链接到选定的文件夹。然后，调用通道信号以设置待分割对象的通道。例如，为与 HK 框中的 B 对应，需设置强度类别参数以及待检测对象的近似最小和最大尺寸（以像素为单位）。对于强度类别，设置值为 2 时，会将像素分为两类：背景和前景。因此，当物体与背景之间的对比度较高时，该方法适用。如果前景物体的原始强度较低，或与背景的对比度较低，则应增加类别数量。在盒装主动轮廓中，可优化物体边界的检测。在此过程中，将创建一个文件夹以保存已分割对象的图像。在文本框中为此文件夹命名，例如“分割细胞核”。在“已分割对象图像的格式”框中设置保存已分割对象图像的格式，然后运行该方案。文件夹将创建在包含合并图像的文件夹中。已开发出不同的模块，以适应在已分割对象中需分析的规则数量、通道数量以及细胞区室。在以下示例中，进行分析时请选择“荧光分析 P”模块——同一区室中的两个通道，并将其链接至“选择文件夹”。在执行此分析之前，应已完成分割模块的处理。请在参数设置中指定包含分割对象图像的文件夹路径，在文件夹名称前加上反斜杠。分割对象图像的输入文件夹格式，请填写用于保存分割对象图像的文件格式。在“去除边界对象”选项中，选择是否移除位于图像边界的分割对象。否则，目前必须安装更完整的 J 成像工具集才能使用此功能。在“通道斑点信号”设置框中，指定需要检测斑点的通道。在经典的 RTP 图像中，通道零为红色，通道一为绿色，通道二为蓝色。在“定位分子名称”框中，填写定位于斑点中的分子名称。需回答的字段数量取决于分子的数量。在“每检测器通道的波长”框中，为每个独立通道设置斑点检测参数。为了在房间内处理不同的模块，请使用模块选择文件夹保留所选模块的连接，并确保它们的排序位于工作流程良好处理的顺序之下。在运行工作流程之前，建议删除未使用的模块，并将新协议另存为其他名称。单击“运行”以启动工作流程。当程序打开时，会出现“eye look books”界面。双击包含护士图像的文件夹，然后单击“打开”，工作流程将自动运行。如果处理完成，右下角将显示工作流已成功执行的消息，所有模块均会标有绿色标记。若未完成，则带有箭头符号的模块及其内部框将指示需要修正的元素。重要的是，多个显示界面可用于在每次运行过程中可视化中间结果，以监控处理过程。该工作流程的快速性、灵活性和功能性将通过多个示例加以说明。在第一个示例中，我们分析了在使用不同浓度的TNF alpha刺激后，NF kappa B的核转位情况。细胞核和细胞质通过分割C和E模块进行界定。采用全局转位分析模块对NF kappa B信号增强现象进行分析。在26分钟内分析了96张图像中的超过40,000个细胞。所获得的数据用于建立该剂量反应曲线，显示TNF alpha诱导NF Kappa B核转位的效果。该工作流程还可用于检测文件大小并提取有关其特征的特定信息。此处，通过定位蛋白质的EDC来检测单个细胞中的特性。细胞质中的细胞核则通过分割A和E区块进行界定。使用荧光分析模块 C 对 EDC4 进行了分析。在此示例中，已在所分析的两种细胞中均检测到细胞质内的 EDC4 信号。每个完整边的像素大小已在电子表格中给出。在此示例中，我们利用该工作流程的灵活性，对碳水化合物在更长时间内的氧化应激动力学进行了研究。coilin 的核力信号是碳水化合物的主要结构组分，其数量和大小根据尺寸以及通过 53BP1 定位的双链断裂所评估的应激状态进行分析。细胞核通过分割代理进行界定，使用荧光分析模块 B 同时分析核力以及 coilin 和 53BP1 的信号。基于来自 2300 个单个细胞的数据，我们发现应激诱导后 Greenfield 位点的数量显著增加，同时其尺寸减小。该数据强烈表明，氧化应激会改变碳水化合物的成核能力，使核质分布转变为更多但更小的核位点，从而证明 coilin 表达的改变可能影响其定位，并改变曲线体的成核过程。过表达了一种外源性GFP-coilin融合蛋白。根据GFP-coilin的过表达水平分析了我们身体的特征。使用分割模块A界定细胞核。使用荧光分析模块B同时分析coilin和GFP-coilin的荧光信号。GFP-coilin的过表达水平通过单个细胞核中GFP信号的平均密度来反映。亚结构分析仪生成的数据表明，GFP-coilin过表达显著增加了碳水化合物的大小和数量。由于氧化应激会增加碳水化合物的数量但减小其大小，该数据可能反映出氧化应激对碳水化合物结构的影响很可能是由其成分改变所致，而非由coilin特定含量变化引起的作用。因此，结构分析器是一种高度模块化的生物图像分析工作流程。它可适用于多种场景，从简单的通道合并到对成千上万个细胞中的多个层面和信号进行量化。它还根据图像复杂性整合了简单和复杂的分割算法，并能自动提取荧光信号特征。

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