Name: 手术小鼠模型中骨关节炎的标准化形态学评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学习骨关节炎手术小鼠模型中的标准化形态学评价方法，通过定量分析关节软骨和骨组织变化来监测疾病进展并评估治疗效果。该方案为肌肉骨骼研究提供了可重复的分析框架。

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我们感谢宾夕法尼亚州立大学米尔顿·S·赫尔希医学中心比较医学部工作人员以及分子与组织病理学核心实验室提供的帮助。资助来源：美国国立卫生研究院国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所 1RO1AR071968-01A1（F.K.），美国关节炎国家研究基金会关节炎研究基金（F.K.）。

十二周龄雄性C57BL/6小鼠购自Jax Labs。所有小鼠以每笼3–5只的密度饲养于微隔离笼中，饲养环境维持12小时光照/12小时黑暗循环。所有动物实验操作均依照美国国立卫生研究院（NIH）规定进行 实验动物护理和使用指南 并经宾夕法尼亚州立大学动物护理与使用委员会批准。
1. 创伤后骨关节炎（PTOA）手术模型
<ol>
	<li>通过腹腔注射使用氯胺酮（100 mg/kg）/赛拉嗪（10 mg/kg）组合麻醉小鼠，通过腹腔注射给予布托啡诺（1 mg/kg）以缓解疼痛，并剃除膝关节区域的毛发。在开始手术前检查小鼠是否缺乏足底反射。</li>
	<li>按照先前描述的方法进行内侧半月板失稳（DMM）手术22,23。 
	注：有关更详细的手术方案信息，请参阅 Glasson 等人和 Singh 等人的参考文献22,23。
	<ol>
		<li>从右侧膝关节髌骨远端至胫骨平台近端做一条3 mm的纵向切口。使用缝线将髌腱移位。</li>
		<li>在肌腱内侧切开关节囊，并移动髌下脂肪垫，以暴露髁间区域、内侧半月板及半月板胫骨韧带23。</li>
		<li>切断内侧半月板胫骨韧带以完成DMM并使关节失稳22,23。使用钉书针或缝线关闭切口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>假手术组采用类似操作步骤，但不切断内侧半月板胫骨韧带。 
	注：小鼠被随机分配接受DMM手术或假手术。根据已发表的文献，小鼠在DMM手术后12周会发展出显著的创伤后骨关节炎（PTOA）22,23,24。</li>
</ol>
2. 小鼠安乐死与样本采集
<ol>
	<li>小鼠安乐死
	<ol>
		<li>在DMM手术后12周，通过腹腔注射使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）组合对小鼠进行麻醉。</li>
		<li>沿胸廓正中线切开皮肤，牵开肋骨以暴露心脏，进行灌注固定27。 
		注：有关啮齿类动物正确固定的方案以及设备组装和操作流程的视频演示，请参阅Gage等人的参考文献27。</li>
		<li>根据制造商的说明设置灌注装置。</li>
		<li>通过左心室灌注肝素化生理盐水，直至血液完全清除、肝脏变为苍白色，随后灌注10%中性缓冲福尔马林，直至小鼠全身完全固定。 
		注：成功完成灌注的小鼠身体会变得僵硬。使用自动泵系统的平均灌注时间为5–7分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本采集与制备
	<ol>
		<li>在股骨和胫骨中段处切断骨骼，分离周围肌肉组织，以分离膝关节。</li>
		<li>将膝关节置于室温下的10%中性缓冲福尔马林中继续固定24小时，随后在4 ˚C下固定6天。</li>
		<li>将样本置于EDTA脱钙缓冲液中，在室温下轻微震荡孵育1周进行脱钙28。每3天更换一次脱钙缓冲液。 
		注：脱钙缓冲液的配制方法为将140 g超纯EDTA四钠溶解于850 mL蒸馏水与15 mL冰醋酸的混合液中，逐滴加入冰醋酸调节pH至7.6。当pH达到7.6后，用蒸馏水定容至1 L。脱钙缓冲液需新鲜配制，并在配制后1周内使用。</li>
		<li>依次用50%乙醇和70%乙醇各洗涤膝关节15分钟，然后进行包埋前处理。 
		注：液体转移处理由宾夕法尼亚州立大学米尔顿·S·赫尔希医学中心分子与组织病理学核心实验室完成。有关最佳样本处理建议，请咨询所在机构的组织学核心实验室。</li>
		<li>将小鼠膝关节包埋于石蜡中，使关节内侧面向石蜡块底面。包埋过程中对胫骨侧关节施加轻微压力，以确保胫骨和股骨表面尽可能处于同一平面。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 切片机切片与玻片选择
<ol>
	<li>切片机切片
	<ol>
		<li>使用切片机样品夹上的平面调节旋钮，确保样品块的切面方向正确。</li>
		<li>修整石蜡包埋块，使股骨远端、胫骨近端以及内侧半月板的前角和后角处于同一平面，以便收集切片（补充图1A）。当内侧半月板的前角与后角开始分离时，开始在载玻片上收集切片。</li>
		<li>通过比较各结构的大小，确认胫骨、股骨和半月板处于同一平面。胫骨与股骨的大小应相近，两个半月板角的大小和形状也应相似（补充图1A）。若某一结构相对于其对应结构显得过大，则表明需要进一步修面。重要的是，需确认关节腔结构保持完整。</li>
		<li>对石蜡包埋的小鼠膝关节样本，沿内侧关节腔进行5 μm厚的矢状面切片，并将切片收集于载玻片上。每个石蜡块收集约30张切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>载玻片选择
	<ol>
		<li>从第5张切片开始，每隔50 μm选取一张具有代表性的切片，每个样本共选取三张（即第5、15和25张切片）。所选载玻片将用于后续染色、OARSI评分及组织形态计量学分析。 
		注意：对于共30张切片的石蜡块，应从切片集合的起始段（第5–10张）、中段（第15–20张）和末段（第25–30张）中选取，以充分代表整个样本。不同样本之间应选择相同深度水平的切片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 苏木精、沙黄和固绿染色
<ol>
	<li>用三次更换的二甲苯对所选切片进行脱蜡。依次用两次更换的100%乙醇、两次更换的95%乙醇和一次更换的70%乙醇对切片进行水化。</li>
	<li>用苏木精染色7分钟，然后用流水冲洗10分钟。用快绿染色3分钟，再在1.0%冰醋酸中漂洗10秒。用番红O染色5分钟，随后浸入0.5%冰醋酸中快速漂洗。</li>
	<li>将切片在两次更换的蒸馏水中漂洗，然后自然晾干。</li>
	<li>用三次更换的二甲苯对切片透明处理，每次5分钟，然后使用基于二甲苯的封片介质和盖玻片封片。 
	注意：苏木精作为细胞核染料，用于识别骨髓区域。番红O用于染色软骨、蛋白聚糖、黏液和肥大细胞颗粒。快绿用作骨组织的对比染色。</li>
</ol>
5. 载玻片成像
<ol>
	<li>使用显微镜上连接的相机及基于计算机的成像软件，对番红O-固绿染色的切片进行成像。</li>
	<li>打开成像软件（参见材料表），将膝关节感兴趣区域（ROI）置于成像窗口中央。若使用可旋转的显微镜载物台，需调整切片方向，使胫骨表面沿成像区域水平轴方向展开。</li>
	<li>在开始成像一组样本前，设置相机的白平衡（补充图2）。以4倍和10倍放大倍数对关节腔进行成像，确保每个图像的感兴趣区域均包含胫骨和股骨关节面以及胫骨下软骨骨组织（补充图1A、B）。保存所选三个层面的图像，用于OARSI评分。 
	注意：相机白平衡的设置取决于所使用的软件和相机系统。通常需进入相机选项卡或主成像菜单，向下滚动至设置白平衡选项。点击设置白平衡后，屏幕上应出现一个小光标或图标（补充图2A）。使用该光标选择图像或样本中无染色的区域（如关节腔）以完成白平衡设置。</li>
</ol>
6. 国际骨关节炎研究学会（OARSI）评分15
<ol>
	<li>从所有样本中随机选取三张番红O-快绿染色切片。</li>
	<li>由三位观察者以盲法方式进行OARSI评分。简要步骤如下：按随机顺序每次显示一张图像，由三位观察者分别对每张图像进行评分，对应于每个样本所选的三个层面之一。 
	注：详细的评分标准请参考OARSI评分表15。</li>
	<li>根据每位观察者的评分结果，计算每个切片的平均得分；再通过三个代表性切片的平均得分，确定每个样本的最终平均评分。</li>
</ol>
7. 组织形态计量学分析
注意：使用显微镜摄像头在触摸屏显示器上观察膝关节的实时图像，并用触控笔手动勾画感兴趣区域（ROI）。组织形态计量学软件内置的算法将对所定义的感兴趣区域内的指定参数进行量化（见下文方案）。重要的是，用于OARSI评分的同一张番红O-快绿染色切片将用于组织形态计量学分析。
<ol>
	<li>软件设置与测量准备
	<ol>
		<li>打开显微镜、相机、计算机和触摸屏显示器。点击 软件图标 启动软件程序。将玻片放置在显微镜载物台上进行观察。</li>
		<li>将样本置于测量窗口中央。确保测量网格的放大倍数与显微镜所使用的物镜相匹配（补充图3）。</li>
		<li>点击屏幕顶部的 文件 选项卡，向下滚动至 读取设置。打开 设置 窗口，并选择与待测参数相对应的设置文件。</li>
		<li>从屏幕右侧的列表中选择待测参数（补充图3）。使用触控笔或鼠标光标，按照下文所述步骤描记图像，以测量特定组织感兴趣区域（ROI）。每次测量完成后，右键单击 结束当前测量，并继续下一参数的测量。 
		注：待测参数列表由一个独立的偏好文件创建，该文件需与软件公司协商设置，用于测量所述的感兴趣区域。有关完整设置的更多细节，请参见讨论部分。</li>
		<li>完成所有测量后，转至软件界面底部的 汇总数据 选项卡（补充图3）。点击屏幕窗口，按下键盘上的 Insert 键，或将数据复制粘贴至另一个电子表格中。 
		注：组织形态计量分析应以随机化和盲法方式进行。在完成所有样本的所有参数测量后，整理数据并对每个样本的三张玻片测量值取平均。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>总软骨、钙化软骨和非钙化软骨面积的测量 
	注：使用市售软件（见 材料表）执行以下步骤。有关本节中讨论的软骨区域、连接处及软骨下骨区域的说明，请参见 补充图1B、C。
	<ol>
		<li>在胫骨软骨表面的上缘处画一条线，即软骨与关节腔交界的位置。在钙化软骨与软骨下骨交界的软骨-骨交界处画第二条线（图1B）。使用软件的 面积 功能自动获取总软骨面积的测量值。</li>
		<li>沿潮线（tidemark）画一条线，该线是天然存在的钙化与非钙化软骨区域的分界线。在钙化软骨与软骨下骨交界的软骨-骨交界处画第二条线（图1B）。使用软件的 面积 功能自动获取钙化软骨面积的测量值。</li>
		<li>通过从总软骨面积中减去钙化软骨面积，计算非钙化软骨面积（图1B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>软骨细胞数量与表型的确定
	<ol>
		<li>在组织形态计量软件的设置中创建独立的计数功能，以区分产基质和非产基质的软骨细胞（图1B）。</li>
		<li>使用触控笔在表达特定表型的每个软骨细胞上方点一个小点，以确定产基质或非产基质软骨细胞的数量（图1B）。 
		注：根据细胞表型进行计数，分为产基质型（即番红O染色强阳性）和非产基质型（即番红O染色极弱或无染色）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胫骨关节面周长的测量
	<ol>
		<li>通过沿胫骨软骨表面描记一条线，仔细界定各个纤维化区域，测量胫骨关节面的绝对周长（图1C）。</li>
		<li>沿潮线画第二条线，作为各切片平面的内部对照（图1C）。</li>
		<li>通过将胫骨关节面周长除以潮线周长，计算胫骨关节面纤维化指数。 
		注：潮线周长在各样本间通常相近，因此无论使用绝对周长还是纤维化指数，假手术组与DMM组之间的关节面周长差异通常较小。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>软骨下骨与骨髓腔面积的测量
	<ol>
		<li>使用 面积 功能测量软骨下骨髓腔面积，勾勒出仅被苏木精染色（即快绿染色阴性）的软骨下区域，以确定软骨下骨内的总骨髓腔面积。围绕这些区域的边缘画线，以确定胫骨软骨下骨内所有骨髓腔的总面积（图2B）。</li>
		<li>使用面积功能测量总软骨下骨面积，勾勒出软骨-骨交界处与生长板上缘之间的区域，并向外延伸至前后骨赘区域（图2B）。</li>
		<li>通过从总软骨下骨面积中减去软骨下骨髓腔面积，计算软骨下骨面积（图2B、C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>前后骨赘面积的测量
	<ol>
		<li>使用 面积 功能描记近端胫骨的前、后骨赘，以测量骨赘面积（图2B、E、F）。 
		注：骨赘是位于关节软骨与生长板之间、软骨下区域前或后方的骨性突起。胫骨前、后侧的骨赘面积通过描记软骨下骨前或后方的区域确定。骨赘与软骨下骨之间的交界由一条从关节软骨延伸至生长板的细胞线清晰界定。骨赘与滑膜之间的交界则由骨组织与纤维组织的过渡区定义。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>滑膜厚度的测量
	<ol>
		<li>使用 面积 功能测量股骨前方滑膜厚度，从滑膜在股骨上的内侧附着点向其在半月板上的附着点画一条线（图3B）。</li>
		<li>从滑膜在股骨上的外侧附着点向其在半月板上的附着点画第二条线（图3B）。</li>
		<li>通过将总滑膜面积除以滑膜周长，计算滑膜厚度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 统计分析
<ol>
	<li>收集测量参数，并对每个样本的三个代表性区域的结果取平均值。使用非配对的 Student t 检验比较两组，或使用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较三组或更多组。</li>
	<li>以均值 ± 均值标准误的形式展示数据。 
	注意：当 p ≤ 0.05 时认为具有统计学显著性。</li>
</ol>

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<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+an+osteoarthritis-like+phenotype+and+degradation+of+phosphorylated+Smad3+by+Smurf2+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Induction of an osteoarthritis-like phenotype and degradation of phosphorylated Smad3 by Smurf2 in transgenic mice.</a> Arthritis Rheumatism. 58 (10), 3132-3144 (2008).</li>
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</ol>

近年来，骨关节炎研究加深了我们对关节内不同组织之间相互作用及其在疾病发生或进展中所起作用的理解8,9,10,35,36。因此，显然骨关节炎的评估不应局限于软骨分析，还应包括对软骨下骨和滑膜的分析。尽管如此，关节软骨仍是骨关节炎半定量评分的主要关注点15,37,38。虽然计算组织形态计量学已应用于肌肉骨骼研究的多个领域39,40,41,<...

骨关节炎（OA）是美国最常见的关节疾病之一，其特征是髋关节和膝关节的关节软骨发生进行性退变，严重影响患者的活动能力和生活质量1,2,3。关节软骨是滑膜关节中一种特化的结缔组织，其功能在于减少摩擦、促进运动并承受关节压缩力4。关节软骨主要由两种成分构成：软骨细胞和细胞外基质。软骨细胞是一类特化的、代谢活跃的细胞，在细胞外基质的发育、维持和修复过程中起主要作用4。软骨细胞肥大（CH）是骨关节炎发展过程中的主要病理特征之一，表现为细胞体积增大、蛋白聚糖生成减少以及软骨基质降解酶的生成增加，最终导致软骨退变5,6,7。此外，关节软骨下骨和滑膜的病理改变在骨关节炎的发生和发展中也发挥着重要作用8,9,10,11,12。迄今为止，尚无能够抑制软骨退变的治愈性疗法1,2,3,13,14。因此，目前有大量研究致力于阐明骨关节炎的病理机制，并探索能够延缓甚至阻止疾病进展的新型治疗策略。相应地，迫切需要一种定量且可重复的方法，以准确评估关节软骨、滑膜和软骨下骨中与骨关节炎相关的病理变化。
目前，骨关节炎（OA）的严重程度和进展主要通过OARSI或Mankin评分系统进行评估15。然而，这些评分系统仅为半定量方法，且可能受到操作者主观性的影响。更重要的是，它们无法准确评估疾病过程中或在基因操作或治疗干预后关节内发生的细微变化。文献中偶有报道描述对软骨、滑膜或软骨下骨进行组织形态计量学分析16,17,18,19,20,21。然而，目前仍缺乏针对这些关节组分进行严格且可重复的组织形态计量学分析的详细操作方案，该领域尚存未满足的需求。
为了通过组织形态计量学分析研究骨关节炎（OA）的病理变化，我们采用了一种手术诱导的OA小鼠模型，通过内侧半月板失稳（DMM）来诱导OA。在已建立的小鼠OA模型中，本研究选择了DMM模型，因其造成的损伤机制创伤较小22,23,24,25,26。与半月板-韧带损伤（MLI）或前交叉韧带损伤（ACLI）手术相比，DMM诱导的OA进展更为缓慢，更类似于人类OA的发展过程22,24,25,26。在DMM手术后12周处死小鼠，以评估关节软骨、软骨下骨和滑膜的改变。
本实验方案的目标是建立一种标准化、严谨且定量的方法，用于评估伴随骨关节炎（OA）发生的关节变化。

<table><tbody><tr><td>10% 磷酸缓冲福尔马林</td><td>Fisher Chemical</td><td>SF100-20</td><td>用于收获后样本的固定</td></tr><tr><td>冰醋酸（分析纯，经认证符合 ACS 标准）</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38S-212</td><td>用于脱钙缓冲液及染色用醋酸溶液的配制</td></tr><tr><td>Cintiq 27QHD 创意数位屏</td><td>Wacom</td><td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td><td>用于组织形态计量分析与成像</td></tr><tr><td>Cintiq Ergo 支架</td><td>Wacom</td><td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td><td>用于组织形态计量分析与成像</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸四钠盐二水合物，99%</td><td>Acros Organics</td><td>AC446080010</td><td>用于脱钙缓冲液的配制</td></tr><tr><td>快绿染液</td><td>SIGMA Life Sciences</td><td>F7258</td><td>用于样本染色</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td>用于样本切片的收集</td></tr><tr><td>HistoPrep 二甲苯</td><td>Fisherbrand</td><td>HC-700-1GAL</td><td>用于样本脱蜡和染色</td></tr><tr><td>Histosette II 组织包埋盒——组合盖与底座</td><td>Fisher</td><td>15-182-701A</td><td>用于样本处理与包埋</td></tr><tr><td>HP Z440 工作站</td><td>HP</td><td>Product number: Y5C77US#ABA</td><td>用于组织形态计量分析与成像</td></tr><tr><td>手动旋转式切片机</td><td>Leica</td><td>RM 2235</td><td>用于样本切片</td></tr><tr><td>标记笔</td><td>Leica</td><td>3801880</td><td>用于样本、包埋盒和载玻片的标记</td></tr><tr><td>OLYMPUS BX53 显微镜</td><td>OLYMPUS</td><td>https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/</td><td>用于组织形态计量分析与成像</td></tr><tr><td>OLYMPUS DP 73 显微镜相机</td><td>OLYMPUS</td><td>https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/</td><td>用于组织形态计量分析与成像（已停产）</td></tr><tr><td>ORION STAR A211 pH 计</td><td>Thermo Scientific</td><td>STARA2110</td><td>用于脱钙缓冲液的配制</td></tr><tr><td>OsteoMeasure 软件</td><td>OsteoMetrics</td><td>https://www.osteometrics.com/index.htm</td><td>用于组织形态计量测量与分析</td></tr><tr><td>Perfusion Two 自动压力灌注系统</td><td>Leica</td><td>Model # 39471005</td><td>用于小鼠膝关节的收获</td></tr><tr><td>PRISM 7 软件</td><td>GraphPad</td><td>Institutional Access Account</td><td>统计分析</td></tr><tr><td>番红O染液</td><td>SIGMA Life Sciences</td><td>S8884</td><td>用于样本染色</td></tr><tr><td>ThinkBoneStage — 旋转显微镜载物台</td><td>Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics（供应商）</td><td>http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php</td><td>用于组织形态计量分析与成像</td></tr><tr><td>Wacom Pro Pen 触控笔</td><td>Wacom</td><td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td><td>用于组织形态计量分析与成像</td></tr><tr><td>Weigert 铁苏木素 A 液</td><td>Fisher</td><td>5029713</td><td>用于苏木素染色</td></tr><tr><td>Weigert 铁苏木素 B 液</td><td>Fisher</td><td>5029714</td><td>用于苏木素染色</td></tr></tbody></table>

标准化外科小鼠模型中骨关节炎的组织形态计量学评估

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

骨关节炎（OA）是美国最常见的关节疾病之一，其特征是髋关节和膝关节的关节软骨发生进行性退变，严重影响患者的活动能力和生活质量。迄今为止，尚无能够减缓或抑制软骨退变的治愈性疗法。目前，大量研究正在致力于阐明骨关节炎的病理机制，并探索可有效减缓、阻止甚至逆转骨关节炎进展的新型治疗策略或药物。因此，建立一种定量且可重复的方法，以准确评估关节软骨、滑膜及软骨下骨中与骨关节炎相关的病理改变，显得尤为关键。目前，骨关节炎的严重程度和进展主要通过国际骨关节炎研究学会（OARSI）或Mankin评分系统进行评估。尽管这些评分系统具有重要意义，但它们属于半定量方法，易受操作者主观判断的影响。更重要的是，它们难以准确评估疾病早期阶段或治疗初期软骨中那些细微但重要的变化。本文所描述的方案采用一种计算机化、半自动化的组织形态计量学软件系统，建立了一套标准化、严谨且可重复的定量方法，用于评估骨关节炎中的关节改变。该方案是对现有评估体系的有力补充，能够更高效地检测关节中的病理变化。

DMM诱导的骨关节炎导致关节软骨退变和软骨细胞丢失 
与假手术小鼠相比，DMM诱导的骨关节炎（OA）导致OARSI评分显著升高，其特征表现为明显的表面糜烂和软骨丢失（图1A，D）。本文详述的组织形态测量分析方法检测到了多种与OA相关的改变，包括总软骨面积和未钙化软骨面积的减少（图1A，B，E，G）；总软骨细胞数量减少；以及关键性的基质生成型软骨细胞的丢失（图1H，I）。关节表面的改变可反映糜烂的严重程度，通过软骨纤维化指数进行评估。总体而言，DMM小鼠的纤维化指数升高（图1C，K，L）。然而，也需注意，在OA晚期阶段，由于软骨表...

本方案建立了一种严格且可重复的方法，用于量化伴随骨关节炎发生的关节形态学变化。该方案的应用在监测骨关节炎疾病进展和评估治疗干预效果方面具有重要价值。

在美国最常见的关节疾病之一，骨关节炎（OA）的特征是关节软骨进行性退变，……

本方案针对骨关节炎发生与进展过程中关节变化的定量分析，提供了一种稳健且可重复的方法，填补了该领域的空白。本技术明确了骨关节炎中多个关节组织变化的定量分析所必需的具体且可重复的参数。由于该技术能够实现骨关节炎的定量分析，因此可用于比较特定治疗对多个关节组织的影响，从而评估其治疗效果。我们的方案也可应用于其他骨关节炎模型或需要对软骨和骨组织进行定量分析的肌肉骨骼研究领域。尽管该系统操作简便且直观，但仍需进行培训，以练习重复获取测量数据，从而实现结果的可重复性。接下来，由本实验室的博士后学者 Vengadeshprabhu Karuppagounder 演示我们的操作流程。首先打开显微镜、相机、计算机和触摸屏显示器。选择 4X 物镜，然后单击软件图标以启动软件程序。将玻片放置在显微镜载物台上，调整样本位置使其位于测量窗口中央，并确保测量网格的放大倍数与物镜匹配，使得胫骨和股骨关节面以及胫骨软骨下骨均包含在图像的兴趣区域内。然后在“文件”菜单下，选择“读取设置”。在“设置”窗口中，选择与待测参数相对应的设置文件。要测量总软骨面积，请选择“胫骨TC”功能，并沿胫骨软骨表面与关节腔交界处的上缘，以及钙化软骨与软骨下骨交界的软骨-骨连接处进行描记。为测量钙化软骨区域，选择“Tib CC”功能，并沿潮线（tide mark）绘制一条线，该线是软骨中钙化区与非钙化区之间的自然分界线，同时沿软骨-骨交界处（chondro-osseous junction）绘制，即钙化软骨与软骨下骨相接的区域。为确定非钙化软骨区域，用总软骨面积减去钙化软骨面积。为确定软骨细胞数量，在组织形态计量软件的设置中创建独立的计数功能，以区分产生基质和不产生基质的软骨细胞。然后使用探针在表达特定表型的每个软骨细胞上方标记一个小点，以确定产生基质或不产生基质的软骨细胞数量。为测量胫骨关节面总参数，沿胫骨软骨表面描绘一条线，以精确定义各个纤维化区域。然后沿潮线绘制第二条线，作为每张切片平面的内部对照，并将胫骨关节面参数除以潮线参数，以计算胫骨关节面纤维化指数。为了测量软骨下骨髓腔面积，请选择“骨髓面积”功能，然后在这些区域的边界周围画线，以确定胫骨软骨下骨内骨髓腔的总面积。为了测量总的软骨下区域面积，请选择“软骨下骨”功能，并勾勒出从生长板上缘的软骨-骨交界处开始，向外侧延伸至前部和后部骨赘区域之间的范围。然后从总软骨下区域面积中减去软骨下骨髓腔面积，以计算软骨下骨面积。测量骨赘面积时，选择前侧骨赘功能，勾勒近端胫骨的前侧骨赘；然后选择后侧骨赘，勾勒近端胫骨的后侧骨赘。为测量股骨前方滑膜厚度，请点击“Anterior Femur Synovium Meniscus”，从滑膜在股骨上的内侧附着点向其在半月板上的附着点画一条线，再从滑膜在股骨上的外侧附着点向其在半月板上的附着点画另一条线。然后将总滑膜面积除以滑膜参数，以计算滑膜厚度。与假手术小鼠相比，DMM诱导的骨关节炎会导致国际骨关节炎研究学会（Osteoarthritis Research Society International）评分升高。表面侵蚀和软骨丧失特征明显。该组织形态计量学方案可用于检测多种与骨关节炎相关的改变，包括总软骨面积和未钙化软骨面积的减少、总软骨细胞数量的降低，以及尤为重要的是，基质生成性软骨细胞数量的丧失。关节面的改变也可见，提示侵蚀程度严重，包括纤维化指数整体升高。骨关节炎还表现为DMM小鼠软骨下骨面积增加以及骨髓腔面积减少，提示软骨下骨硬化。DMM小鼠的前部和后部骨赘面积均增加，提示存在持续的软骨下骨重塑，作为应对损伤部位关节负荷改变的一种代偿机制。对滑膜进行组织形态计量学分析显示，DMM 小鼠的滑膜厚度增加，这是骨关节炎相关滑膜炎症的典型表现，以及炎症性细胞因子扩散至关节腔的结果。此外，在国际骨关节炎研究学会评分中，对未钙化软骨区域进行组织形态计量学分析时，观察到不同使用者之间无显著差异。组织形态计量学分析后，可利用连续切片和免疫荧光染色来检测样本间蛋白质表达的变化。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

手术小鼠模型中骨关节炎的标准化形态学评价

我们描述了一种在小鼠中建立内侧半月板失稳（DMM）模型的实验方案，该模型是骨关节炎（OA）研究的有效工具。此外，我们通过该模型证实，颗粒蛋白前体缺乏会加剧OA的发展和进展，表明颗粒蛋白前体在OA的发病机制中具有保护作用。...

建立小鼠手术诱导模型以研究颗粒体蛋白前体在骨关节炎中的保护作用

骨关节炎（OA）或退行性关节疾病是一种致残性疾病，常伴有疼痛，而现有镇痛药物对其缓解作用有限。目前正开发动物模型以增进对骨关节炎相关疼痛机制的理解。本文描述了小鼠单碘乙酸钠骨关节炎疼痛模型的建立方法。...

小鼠骨关节炎疼痛的单碘乙酸盐模型

我们提出一种方法，用于评估在施加可控机械负荷或冲击后，完整小鼠关节关节面上细胞损伤/死亡的空间范围。该方法可用于研究骨关节炎、遗传因素和/或不同加载方案如何影响关节组织的易损性 原位...

实时可视化与分析机械负荷对完整小鼠软骨外植体中软骨细胞损伤的影响

本文介绍了一种详细且可重复的流式细胞术方案，利用已建立的小鼠骨关节炎手术模型，通过胞外和胞内染色实验，鉴定小鼠脾脏、骨髓、淋巴结及滑膜组织中的单核细胞/巨噬细胞和T细胞亚群。...

骨关节炎模型中经由流式细胞术分析小鼠脾脏、骨髓、淋巴结及滑膜组织内的免疫细胞亚群

本方法学文章介绍了一种软件辅助的定量测量方案，用于量化小鼠骨关节炎膝关节及作为对照的正常膝关节中组织学上的软骨下骨厚度。该方案对细微增厚具有高度敏感性，适用于检测早期骨关节炎相关的软骨下骨改变。...

软件辅助的骨关节炎软骨下骨厚度定量测量

本实验方案描述了在切断小鼠内侧半月板胫骨韧带以使膝关节失稳后，对关节软骨表面进行可控的微刃划伤操作。该动物模型可诱导骨关节炎（OA）的加速发展，适用于研究骨赘形成、骨硬化以及早期疼痛等病理过程。...

内侧半月板失稳与软骨划痕小鼠加速性骨关节炎模型

本方案描述了如何测量小鼠的膝关节痛觉过敏。我们展示了急性膝关节疼痛小鼠模型以及骨关节炎（OA）模型中的示例。...

使用压力应用测量法评估小鼠膝关节痛觉过敏

本文介绍了一种切断前交叉韧带（ACL）的手术方法，作为一种可靠的诱导啮齿类动物膝骨关节炎的模型，以及采集膝关节滑液、测量膝关节水肿和评估骨关节炎严重程度的方法。...

在啮齿类动物模型中通过前交叉韧带横断与关节腔灌洗研究关节炎症及创伤后骨关节炎

我们开发了一种新型手术方法，用于将生物活性物质直接注入小鼠胎儿的气管。与常用的羊膜内注射相比，该递送途径在靶向胎儿小鼠肺组织方面效率更高。迄今为止，该操作程序尚未在小鼠模型中报道过。...

一种在胎鼠模型中进行气管内给予生物活性物质的新型外科手术方法

胫神经横断模型是一种耐受性良好、经过验证且可重复的骨骼肌萎缩模型。该模型的手术方案在C57Black6小鼠中进行了描述和演示。...

胫神经横断——小鼠去神经诱导骨骼肌萎缩的标准模型

学习骨关节炎手术小鼠模型中的标准化形态学评价方法，通过定量分析关节软骨和骨组织变化来监测疾病进展并评估治疗效果。该方案为肌肉骨骼研究提供了可重复的分析框架。

标准化外科小鼠模型中骨关节炎的组织形态计量学评估

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