标准化外科小鼠模型中骨关节炎的组织形态计量学评估

本方案针对骨关节炎发生与进展过程中关节变化的定量分析，提供了一种稳健且可重复的方法，填补了该领域的空白。本技术明确了骨关节炎中多个关节组织变化的定量分析所必需的具体且可重复的参数。由于该技术能够实现骨关节炎的定量分析，因此可用于比较特定治疗对多个关节组织的影响，从而评估其治疗效果。

我们的方案也可应用于其他骨关节炎模型或需要对软骨和骨组织进行定量分析的肌肉骨骼研究领域。尽管该系统操作简便且直观，但仍需进行培训，以练习重复获取测量数据，从而实现结果的可重复性。接下来，由本实验室的博士后学者 Vengadeshprabhu Karuppagounder 演示我们的操作流程。

首先打开显微镜、相机、计算机和触摸屏显示器。选择 4X 物镜，然后单击软件图标以启动软件程序。将玻片放置在显微镜载物台上，调整样本位置使其位于测量窗口中央，并确保测量网格的放大倍数与物镜匹配，使得胫骨和股骨关节面以及胫骨软骨下骨均包含在图像的兴趣区域内。

然后在“文件”菜单下，选择“读取设置”。在“设置”窗口中，选择与待测参数相对应的设置文件。要测量总软骨面积，请选择“胫骨TC”功能，并沿胫骨软骨表面与关节腔交界处的上缘，以及钙化软骨与软骨下骨交界的软骨-骨连接处进行描记。

为测量钙化软骨区域，选择“Tib CC”功能，并沿潮线（tide mark）绘制一条线，该线是软骨中钙化区与非钙化区之间的自然分界线，同时沿软骨-骨交界处（chondro-osseous junction）绘制，即钙化软骨与软骨下骨相接的区域。为确定非钙化软骨区域，用总软骨面积减去钙化软骨面积。为确定软骨细胞数量，在组织形态计量软件的设置中创建独立的计数功能，以区分产生基质和不产生基质的软骨细胞。

然后使用探针在表达特定表型的每个软骨细胞上方标记一个小点，以确定产生基质或不产生基质的软骨细胞数量。为测量胫骨关节面总参数，沿胫骨软骨表面描绘一条线，以精确定义各个纤维化区域。然后沿潮线绘制第二条线，作为每张切片平面的内部对照，并将胫骨关节面参数除以潮线参数，以计算胫骨关节面纤维化指数。

为了测量软骨下骨髓腔面积，请选择“骨髓面积”功能，然后在这些区域的边界周围画线，以确定胫骨软骨下骨内骨髓腔的总面积。为了测量总的软骨下区域面积，请选择“软骨下骨”功能，并勾勒出从生长板上缘的软骨-骨交界处开始，向外侧延伸至前部和后部骨赘区域之间的范围。

然后从总软骨下区域面积中减去软骨下骨髓腔面积，以计算软骨下骨面积。测量骨赘面积时，选择前侧骨赘功能，勾勒近端胫骨的前侧骨赘；然后选择后侧骨赘，勾勒近端胫骨的后侧骨赘。

为测量股骨前方滑膜厚度，请点击“Anterior Femur Synovium Meniscus”，从滑膜在股骨上的内侧附着点向其在半月板上的附着点画一条线，再从滑膜在股骨上的外侧附着点向其在半月板上的附着点画另一条线。然后将总滑膜面积除以滑膜参数，以计算滑膜厚度。与假手术小鼠相比，DMM诱导的骨关节炎会导致国际骨关节炎研究学会（Osteoarthritis Research Society International）评分升高。

表面侵蚀和软骨丧失特征明显。该组织形态计量学方案可用于检测多种与骨关节炎相关的改变，包括总软骨面积和未钙化软骨面积的减少、总软骨细胞数量的降低，以及尤为重要的是，基质生成性软骨细胞数量的丧失。

关节面的改变也可见，提示侵蚀程度严重，包括纤维化指数整体升高。骨关节炎还表现为DMM小鼠软骨下骨面积增加以及骨髓腔面积减少，提示软骨下骨硬化。DMM小鼠的前部和后部骨赘面积均增加，提示存在持续的软骨下骨重塑，作为应对损伤部位关节负荷改变的一种代偿机制。

对滑膜进行组织形态计量学分析显示，DMM 小鼠的滑膜厚度增加，这是骨关节炎相关滑膜炎症的典型表现，以及炎症性细胞因子扩散至关节腔的结果。此外，在国际骨关节炎研究学会评分中，对未钙化软骨区域进行组织形态计量学分析时，观察到不同使用者之间无显著差异。

组织形态计量学分析后，可利用连续切片和免疫荧光染色来检测样本间蛋白质表达的变化。