Name: 使用微流体腔系统在运动神经元培养物中有机细胞的斧头迁移 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 了解如何使用微流体腔系统研究运动神经元轴突运输机制。该方法利用PDMS微流控芯片实时追踪线粒体和酸性细胞器的动态迁移，为神经退行性疾病研究提供可靠技术平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作得到了以色列科学基金会（ISF，561/11）和欧洲研究理事会（ERC，309377）资助项目的支持。

<ol><li>Misgeld, T., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitostasis+in+Neurons%3A+Maintaining+Mitochondria+in+an+Extended+Cellular+Architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture.</a> Neuron. 96, 651-666 (2017).</li>
<li>Devine, M. J., Kittler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+at+the+neuronal+presynapse+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).</li>
<li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li>
<li>Mandal, A., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+Transport+and+Mitochondrial+Function+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373(2019).</li>
<li>Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).</li>
<li>Anderson, R. G. W., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+of+acidic+intracellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A view of acidic intracellular compartments.</a> Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).</li>
<li>Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab+GTPases+and+Membrane+Trafficking+in+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration.</a> Current Biology. 28, R471-R486 (2018).</li>
<li>Ya-Cheng Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Granules+Hitchhike+on+Lysosomes+for+Long-Distance+Transport%2C+Using+Annexin+A11+as+a+Molecular+Tether%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether.</a> Cell. 179, 147-164 (2019).</li>
<li>Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Quantum-Dot+labeled+neurotropic+factors+transport+along+primary+neuronal+axons+in+compartmental+microfluidic+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers.</a> Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).</li>
<li>Gershoni-Emek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+RNAi+Machinery+to+Axonal+Branch+Points+and+Growth+Cones+Is+Facilitated+by+Mitochondria+and+Is+Disrupted+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311(2018).</li>
<li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+Microfluidic+Platforms%3A+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li>
<li>Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmental+microfluidic+system+for+studying+muscle-neuron+communication+and+neuromuscular+junction+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance.</a> European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).</li>
<li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+co-culture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li>
<li>Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+compartmental+system+underlines+the+contribution+of+mitochondrial+immobility+to+the+ATP+supply+in+the+NMJ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ.</a> Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).</li>
<li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).</li>
<li>Ionescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Sigma-1+Receptor+via+Pridopidine+Ameliorates+Central+Features+of+ALS+Pathology+in+a+SOD1G93A+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model.</a> Cell Death & Disease. 10 (3), 210(2019).</li>
<li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+coculture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li>
<li>Maimon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mir126-5p+downregulation+facilitates+axon+degeneration+and+nmj+disruption+via+a+non-cell-autonomous+mechanism+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS.</a> Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

在本实验方案中，我们描述了一种用于追踪运动神经元中线粒体和酸性区室轴突运输的系统。这种简化的体外平台可对神经元亚细胞区室进行精确的控制、监测和操作，从而实现对运动神经元局部功能的实验分析。该方案可用于研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）等运动神经元疾病，重点关注疾病中轴突运输功能障碍的潜在机制10,16。此外，该系统还可用于研究神经营养因子9,16、microRNA10、mRNA8以及标记蛋白在健康与病变的运动神经元或其他神经元（如感觉神经元9或交感神经元轴突14）中的运输过程。类似的方法也可应用于共培养系统中的细胞器运输研究，例如将运动神经元与骨骼肌细胞共培养12，或将交感...

运动神经元（MNs）是高度极化的细胞，具有长长的轴突，在成年人体中可长达一米。这一特性给运动神经元连接性和功能的维持带来了严峻挑战。因此，运动神经元依赖于从胞体到突触再返回的轴突内信息、细胞器和物质的正常运输。多种细胞组分，如蛋白质、RNA和细胞器，会定期通过轴突进行转运。线粒体是运动神经元中常规运输的重要细胞器。线粒体对运动神经元的正常活动和功能至关重要，负责ATP供应、钙缓冲以及信号传导过程1,2。线粒体的轴突运输是一个被广泛研究的过程3,4。有趣的是，已有研究报道线粒体运输缺陷参与多种神经退行性疾病，特别是在运动神经元疾病中发挥重要作用5。酸性区室是沿运动神经元轴突移动的另一类内在细胞器。酸性区室包括溶酶体、内体、反式高尔基体以及某些分泌性囊泡6。酸性区室轴突运输的缺陷也在多种神经退行性疾病中被发现7，近期研究进一步强调了其在运动神经元疾病中的重要性8。
为了高效研究轴突运输，通常使用能够分离胞体与轴突区室的微流控装置9,10。微流控系统具备两个显著优势：区室化和轴突的分离，使其成为研究亚细胞过程的理想平台11。神经元胞体与轴突之间的空间分离可用于调控不同神经元区室（如轴突与胞体）的细胞外环境。生化分析、神经元生长/变性研究以及免疫荧光检测均可从该平台中获益。此外，通过将神经元与其他细胞类型（如骨骼肌细胞）共培养，微流控装置还可用于研究细胞间的相互作用12,13,14。
本文介绍了一种简单而精确的方案，用于监测运动神经元中线粒体和酸性区室的运输过程。我们进一步通过比较逆行和顺行运动细胞器的相对百分比，以及运输速度的分布，展示了该方法的应用。

<table><tbody><tr><td>35 mm Fluodish &amp;ndash; 玻璃底培养皿</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>50 mm Fluodish &amp;ndash; 玻璃底培养皿</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon DU-897 EMCCD 相机</td><td>安道尔</td><td></td><td></td></tr><tr><td>阿糖胞苷（Cytosine &amp;beta;-D-阿拉伯呋喃糖苷)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>2 mM 的过滤DDW储备液</td></tr><tr><td>B-27添加剂（50倍浓缩）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Alomone Labs</td><td>B-250</td><td>稀释至10 &amp;micro;g/mL，溶于含0.01% BSA的过滤ddw中</td></tr><tr><td>1.25 mm 活检穿孔器</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>504530</td><td>用于大型微生物燃料电池的制备</td></tr><tr><td>6 mm 活检穿刺针</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>504533</td><td>用于小型微生物燃料电池的制备</td></tr><tr><td>7 mm 活检穿刺针</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>504534</td><td>用于大规模微生物燃料电池的制备</td></tr><tr><td>Bitplane Imaris 软件 - 版本 8.4.1</td><td>Imaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A3311-100G</td><td>5% w/v，溶于ddw</td></tr><tr><td>氯三甲基硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#386529-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Alomone Labs</td><td>C-240</td><td>稀释至10 &amp;micro;g/mL，溶于含0.01% BSA的过滤ddw中</td></tr><tr><td>密度梯度介质 - Optiprep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶 I（DNAse）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td>神经基础培养基中储存液浓度为10 mg/mL</td></tr><tr><td>道康宁高真空硅脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554-1EA</td><td>用于环氧模具制备</td></tr><tr><td>DPBS 10X</td><td>Thermo Fisher</td><td>#14200-067</td><td>用ddw按1:10稀释</td></tr><tr><td>Dumont精细镊子#55 0.05 &amp;times; 0.02 mm</td><td>F.S.T</td><td>1125520</td><td></td></tr><tr><td>环氧树脂固化剂</td><td>Trias Chem S.R.L</td><td>IPE 743</td><td>用于环氧模具制备</td></tr><tr><td>环氧树脂</td><td>Trias Chem S.R.L</td><td>RP 026UV</td><td>用于环氧模具制备</td></tr><tr><td>FIJI 软件</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Alomone Labs</td><td>G-240</td><td>稀释至10 &amp;micro;g/mL，溶于含0.01% BSA的过滤ddw中</td></tr><tr><td>Glutamax 100X</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#35050-038</td><td></td></tr><tr><td>HB9:GFP 小鼠品系</td><td>杰克逊实验室</td><td>005029</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10X</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#14185-045</td><td>用ddw按1:10稀释，加入1% P/S，过滤</td></tr><tr><td>iQ 软件</td><td>安道尔</td><td></td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪，弯型，10 cm</td><td>AS 医疗技术公司</td><td>11-441-10</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪，直型，9 cm</td><td>AS 医疗技术</td><td>11-440-09</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Deep-Red FM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>尼康Eclipse Ti显微镜</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（P/S）溶液</td><td>生物工业公司</td><td>03-031-1</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithin (PLO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8638</td><td>在过滤的1×PBS中按1:1000比例稀释</td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒</td><td>道康宁公司</td><td>#3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>牛胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td>储存液：25 mg/mL，溶于1×PBS</td></tr><tr><td>Vannas弹簧式显微解剖剪，3 mm刀头</td><td>F.S.T</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Yokogawa CSU X-1</td><td>横河</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用微流控室系统研究运动神经元培养中细胞器的轴突运输

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

运动神经元（MNs）是具有极长轴突的高度极化细胞。轴突运输是维持运动神经元健康的关键机制，参与神经元的生长、发育和存活。本文详细介绍了一种利用微流控室（MFCs）追踪运动神经元轴突中荧光标记细胞器轴突运输的方法。该方法快速、相对经济，并可实现对细胞内信号在空间和时间上的动态监测。我们逐步阐述了以下操作流程：1）聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控室的制备；2）在微流控室内接种脊髓腹侧组织块及分离的运动神经元培养；3）线粒体和酸性区室的标记，随后进行活细胞共聚焦成像；4）手动及半自动化的轴突运输分析。最后，我们展示了HB9::GFP标记的脊髓腹侧组织块轴突中线粒体与酸性区室运输行为的差异，验证了该系统的有效性。总体而言，本实验方案为研究多种轴突组分的运输过程提供了高效工具，同时也为微流控室的使用提供了简明指南，有助于探索空间分辨的实验设计可能性。

按照所述方案，将小鼠胚胎HB9::GFP脊髓外植体培养于微流控装置中（图4A）。外植体培养7天后，轴突完全延伸至远端室。向远端和近端室分别加入Mitotracker Deep Red和Lysotracker Red染料，以标记线粒体和酸性区室（图4C）。对远端沟槽中的轴突进行成像，并按如下方式分析录像：首先，采用纤迹图（kymograph）分析比较总体运动分布（图4B,D）。该分析显示，仅在酸性区室中存在向逆向运输的偏向性（静止 = 77.1 ± 9.5%；逆向 = 16.9 ± 8.3%；顺向 = 6 ± 5%；图4E），而在线粒体运输中则无此偏向（静止 = 83.4 ± 6.8%；逆向 = 10.5 ± 6.9%；顺向 = ...

轴突运输是维持运动神经元健康的关键机制。在本方案中，我们提供了一种详细的方法，利用微流控小室对运动神经元轴突中酸性区室和线粒体的轴突运输进行示踪。

运动神经元（MNs）是具有极长轴突的高度极化细胞。轴突运输是维持运动神经元健康的关键机制，对神经元的……

轴突运输对神经元的健康和存活至关重要。我们的方案描述了一种监测和分析轴突运输的精巧方法，并可适用于多种神经疾病模型。微流控腔室的应用能够实现精确的空间和时间控制，这对于研究轴突生物学至关重要。轴突运输异常与多种神经退行性疾病（如肌萎缩侧索硬化症，ALS）相关。微流控平台可用于研究基本机制，也可用于测试修复轴突运输缺陷的治疗方法。微流控腔室平台可轻松适应轴突研究的不同方面，包括各种神经亚型的轴突生长与退化。该方法较为复杂，通常需要通过实际操作进行教学。通过可视化演示，任何对研究轴突运输感兴趣的科研人员都将更易于掌握该实验技术。首先在主模具中浇铸PDMS。使用加压空气清除晶圆平台上的任何灰尘，确保晶圆表面光滑洁净后再进行下一步操作。接着，用液氮填充一个容器，并准备一支10毫升的注射器，装配23号针头。在化学通风橱中，将含有晶圆的培养皿放入可密封的容器内，并用注射器向每个含有晶圆的培养皿中注入两毫升液氮。打开氯三甲基硅烷试剂瓶，将注射器刺穿橡胶瓶塞，将氮气注入瓶中。无需拔出针头，将瓶子倒置，并为每个含有晶圆的培养皿回抽两毫升三甲基氯硅烷。将三甲基氯硅烷分散在容器内，但不要直接接触含有晶圆的培养皿。盖上容器。每片晶圆孵育5分钟。接下来，在50毫升离心管中称取47.05克PDMS基底，并按16:1的基底与固化剂比例加入PDMS固化剂，总质量为50克。将PDMS在低速旋转器上混合10分钟，然后倒入各含有晶圆的培养皿中，至所需高度。将培养皿放入真空干燥器中放置两小时，以去除PDMS内 trapped 的空气，形成透明且均匀的模具。随后将培养皿置于70 °C的烘箱中孵育三小时或过夜。为制备微流控腔室（MFC），使用手术刀切割并从培养板上取下PDMS模具，注意不要用力过猛，因为模具较为脆弱。根据实验设置，按照文稿中的说明对腔室进行打孔和切割。进行脊髓组织块培养时，在大型MFC的远端侧打两个直径七毫米的孔，确保它们与通道边缘重叠。在近端侧，于通道中间打一个直径七毫米的孔，使其重叠部分尽可能小，以便为组织块留出足够的空间。在近端通道的两侧边缘再打两个直径一毫米的小孔。将PDMS切割成单个腔室。然后将微流控芯片（MFC）翻转至朝上，使用20号针头在打孔的7毫米孔上刻出三个小型组织块培养凹槽。对于解离的运动神经元培养，在小型MFC两个通道的边缘处打四个6毫米的孔，并将PDMS切割成单个腔室。为对MFC进行灭菌，将50厘米长的胶带平铺在实验台上。然后将培养室的两面按压在胶带上并轻轻揭下。将清洁后的培养室放入新的培养皿中，并在70%的分析纯乙醇中，于旋转摇床上37°C孵育10分钟。弃去乙醇，并在组织培养罩内或70摄氏度的烘箱中干燥腔室。然后将腔室置于组织培养级玻璃底共聚焦培养皿的中央，轻轻按压边缘使PDMS与培养皿底部粘合。将培养皿在70摄氏度孵育10分钟。然后按压腔室以增强粘附性。将培养皿置于紫外线下孵育10分钟，随后进行MFC编码。向两个腔室中均加入1.5 纳克/毫升的PLO。确保PLO溶液流经通道，可通过将包被培养基直接移液至通道入口处实现。在光学显微镜下观察MFC，检查是否存在气泡。如果气泡阻塞了微沟槽，将微流控芯片（MFC）置于真空干燥器中处理两分钟，以去除MFC通道中的多余空气，随后用PLO孵育过夜。用层粘连蛋白替代多聚赖氨酸（PLO），并将MFC再培养过夜。接种前，用培养基洗涤层粘连蛋白。解剖一只ICR品系妊娠12.5天的小鼠，从羊膜囊中分离出胚胎。将胚胎置于HBSS硅胶培养皿中。去除头部和尾部，并将其翻转至腹部朝下。轻轻剥离胚胎背部的表层皮肤，暴露脊髓。使用温和的镊子从头部到尾部将脊髓与身体分离。去除脑膜，然后去除背角，并将脊髓切成厚度为1毫米的横截面。弃去微流控装置近端室中的所有培养基。用移液器吸取一个脊髓外植体，总体积为四微升，将其尽可能靠近洞穴处注射。通过侧边出口从近端孔中吸出多余的液体。重复上述步骤两次，确保外植体嵌入近端通道中。在接种后一天，缓慢向近端孔中加入 150 µL SCEX 培养基。更换近端区室中的 SCEX 培养基，并向远端区室添加富含营养的 SCEX 培养基。保持远端与近端孔之间至少每孔 15 微升的体积梯度。经过四到六天后，轴突应已延伸至远端区室，可进行轴突运输成像。为了标记线粒体和酸性区室，需配制含100纳摩尔MitoTracker Deep Red FM和100纳摩尔LysoTracker Red的新鲜SCEX培养基，并将其加入微流控腔室中。在37摄氏度下孵育30至60分钟。然后用预热的 SCEX 培养基洗涤三次。接着进行轴突运输的活体成像，以三秒为间隔连续采集100帧时间序列图像。每次成像持续五分钟。在微流控芯片中培养七天后的小鼠胚胎HB9 GFP脊髓外植体。我们使用MitoTracker Deep Red和LysoTracker Red染料对线粒体和酸性区室进行标记。对远端沟槽中的轴突进行成像，并通过Kymograph分析确定其总体运动分布。结果显示，在酸性细胞区室中仅存在逆向运输的偏向性，而在线粒体运输中则未观察到该现象。颗粒密度也被定量分析，揭示出在HB9 GFP脊髓外植体轴突中，线粒体颗粒的数量高于酸性区室。接下来，采用半自动软件结合自主编写的代码进行了单颗粒运输分析。该分析显示，酸性组分与线粒体具有相似的颗粒运动速度，但只有酸性区室表现出向逆向运动的偏向性。初次分离胚胎脊髓可能较为困难。多次练习此操作，确保使用正确胚胎年龄的样本和适当的解剖工具。微流控小室的应用改变了我们研究轴突生物学的方式，使我们能够观察到局部的轴突过程，而这些过程曾被认为仅发生在胞体中。

axonal-transport-organelles-motor-neuron-cultures-using-microfluidic

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

使用微流体腔系统在运动神经元培养物中有机细胞的斧头迁移

在本视频中，我们演示了使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）进行软光刻的技术，该技术用于制备用于培养神经元的微流控装置。...

用于神经元胞体与轴突区室化培养的微流控装置的制备

本文介绍了制备和维护隔室化培养室以培养背根神经节感觉神经元的技术。...

背根神经节神经元在隔室化培养中的制备与维持

我们开发了一种新型的多区室神经元共培养微系统平台，用于体外研究中枢神经系统中轴突与胶质细胞的相互作用。该平台能够并行开展多达六项独立实验，并采用新开发的宏/微混合制造方法加工而成。...

一种多区室中枢神经系统神经元-胶质细胞共培养微流控平台

本视频展示了一种利用微流控腔室系统追踪运动神经元轴突运输的方法。该方法包括将小鼠胚胎脊髓组织培养在聚合物包被的孔中，并加入营养培养基以诱导轴突生长。通过活体成像观察荧光染料标记的细胞器的运动，可证实轴突的双向运输。...

使用微流控装置追踪运动神经元中细胞器的轴突运输

黑腹果蝇 S2细胞和培养神经元是成像研究马达驱动的细胞器运输的理想体系...

培养细胞中的细胞器运输 果蝇 细胞：S2细胞系和原代神经元

本文描述了用于单神经元微流控阵列化以及芯片内生物材料涂层等离子体图案化水掩模技术的实验方案。利用极少的细胞输入即可制备高度互连的共培养体系。...

单细胞精度神经元共培养体系的制备

囊泡或细胞器等货物的细胞内运输由分子马达蛋白沿极性微管进行。本方案描述了神经元内单个货物颗粒运输方向性与其相关马达蛋白的种类和相对含量之间的关联分析方法。...

利用“货物定位图谱”分析法表征运动性轴突运输货物上分子马达的组成

本方案提供了一种全面的流程，通过在组织培养芯片中由类球体自发组装延伸出强健的轴突束，从而构建人诱导多能干细胞来源的运动神经类器官。...

三维运动神经类器官的生成

我们描述了一种在市售微流控装置中生成人类运动单位的方法，该方法通过共培养人诱导多能干细胞来源的运动神经元与人原代中血管母细胞来源的肌管细胞，从而形成功能性活跃的神经肌肉接头。...

在微流控装置中生成具有功能性神经肌肉接头的人类运动单元

本实验方案描述了在微流控腔室中对神经元线粒体进行接种和染色的方法。这些腔室中的流体压力梯度可实现对轴突内线粒体的选择性处理，从而在不干扰胞体区室的情况下，分析其对药物干预的响应特性。...

微流控辅助选择性去极化轴突线粒体

了解如何使用微流体腔系统研究运动神经元轴突运输机制。该方法利用PDMS微流控芯片实时追踪线粒体和酸性细胞器的动态迁移，为神经退行性疾病研究提供可靠技术平台。

使用微流控室系统研究运动神经元培养中细胞器的轴突运输

探索更多视频