Name: 血管化、扩展发育和改进显微镜成像的肾器官和器官培养的优化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: 了解利用鸡胚绒毛尿囊膜优化肾脏器官培养的方法，实现血管化并提高存活率。该技术支持高分辨率成像，为研究肾脏发育与疾病机制提供更准确的模型。

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本工作获得了芬兰科学院（Suomen Akatemia，资助号：206038、121647、250900、260056；卓越研究中心资助 2012–2017 年 251314）、Munuaissäätiö—芬兰肾脏与肝脏协会、Sigrid Juseliuksen Säätiö、Victoriastiftelsen、芬兰瑞典文化基金会、诺和诺德（Novo Nordisk）、Syöpäjärjestöt（芬兰癌症协会）、欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013；资助号 FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608）以及“地平线2020”玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里行动创新培训网络“RENALTRACT”项目（项目编号 642937）的资助。作者感谢 Paula Haipus、Johanna Kekolahti-Liias 和 Hannele Härkman 提供的技术支持。
图3、图4和视频2经《发育》（Development）许可重印。

动物护理和操作程序符合芬兰关于实验动物使用的国家立法、《欧洲实验和其他科学用途脊椎动物保护公约》（ETS 123）以及欧盟指令 86/609/EEC。
1. 在鸡胚尿囊膜上培养小鼠胚胎肾脏和肾类器官的微型储液器制备及异种移植实验的建立
<ol>
	<li>使用专为6孔板或12孔板设计的Transwell细胞培养小室。 
	注意：根据具体实验需求，可使用大号或小号微型储液槽。当移植不超过八个胚胎肾脏，或在同一鸡胚（例如，在同一鸡胚CAM上同时放置实验组和对照组样本）上放置多个微型储液槽时，建议使用小号微型储液槽。</li>
	<li>使用装有圆锯刀片的旋转多用工具或手锯，将小室侧壁切短，制成一个高2 mm、底部带有可渗透膜的塑料环。</li>
	<li>用手术刀或锋利刀片修整这些微型储液槽的边缘，使其光滑。</li>
	<li>将微型储液槽置于70%乙醇中灭菌，时间不少于1小时。</li>
	<li>用高压灭菌的双蒸水清洗微型储液槽，并在超净工作台中晾干。</li>
	<li>用PBS缓冲液和培养基（高糖DMEM/10% FBS/1%青霉素-链霉素）冲洗微型储液槽。</li>
	<li>将储液槽置于培养皿中，膜面朝上，放置于一滴培养基（600 µL/400 µL）之上。</li>
	<li>借助移液器或玻璃毛细管，将分离好的离体胚胎肾脏或肾类器官均匀地排列在膜上，避免肾脏周围残留过多液体。</li>
	<li>将样本在37 °C、5% CO2的细胞培养孵箱中孵育2–24小时，使其贴附于膜上。 
	注意：小号插入式储液槽上最多可放置八个E11.5期小鼠胚胎肾脏或肾类器官。若需移植较大的胚胎组织片段，或在CAM上较大区域接种细胞-水凝胶混合物，则建议使用大号储液槽。</li>
	<li>从细胞培养孵箱中取出按照已发表方法制备的8日龄卵外培养鸡胚12,13。</li>
	<li>将微型储液槽转移至CAM上，使移植物面向CAM，膜覆盖其上。将微型储液槽置于CAM的周边区域，避免覆盖鸡胚本体。 
	注意：若使用由12孔板Transwell插入物制成的小型微型储液槽，每个CAM上最多可放置三个。</li>
	<li>向微型储液槽中加入500 µL（6孔板插入物）或300 µL（12孔板插入物）培养基。</li>
	<li>在鸡胚CAM上最多培养9天，每天更换微型储液槽中的培养基。 
	注意：移植后24–48小时内即可观察到样本的血管化现象。</li>
</ol>
2. 定制设计培养板的制备及FiZD培养体系的建立
<ol>
	<li>在6孔板底部钻出直径为20 mm的孔。 
	注意：进行FiZD实验时，请使用孔深为16 mm的6孔板（见材料表中的说明）。</li>
	<li>使用电动钻配合沉头钻头、手术刀或锋利的刀片，对孔的边缘（尤其是上表面）进行打磨抛光。</li>
	<li>将6孔板在70%乙醇中灭菌至少1小时。</li>
	<li>用高压灭菌的双蒸水清洗6孔板，并在无菌条件下晾干。</li>
	<li>用70%乙醇彻底清洗22 mm × 22 mm的玻璃盖玻片，或按照Saarela等11发表的方案进行清洁处理。</li>
	<li>使用无毒组织胶将盖玻片粘附于6孔板孔的上表面。在孔周围涂抹胶水，然后轻轻放置盖玻片以覆盖孔洞，待胶水自然干燥。</li>
	<li>在体视显微镜下检查6孔板，必要时清除盖玻片表面多余的干胶。 
	注意：确保盖玻片表面无胶残留，以保证样品受压均匀。</li>
	<li>将聚苯乙烯微珠（粒径70 µm）与等体积的水凝胶混合。每孔加入50–100 µL即可满足需求。 
	注意：水凝胶与聚苯乙烯微珠的混合物应置于冰上保存。</li>
	<li>在解剖显微镜下将Transwell小室放置好，确保膜面朝上。</li>
	<li>将样品（如离体胚胎肾脏或肾类器官）均匀地排列在膜上。</li>
	<li>小心地将水凝胶/聚苯乙烯微珠混合物添加至样品旁边，避免损伤脆弱组织。</li>
	<li>翻转Transwell小室，使带有样品的膜面朝下。</li>
	<li>轻轻将小室放入经改造的6孔板的孔中，并轻压使其固定，使样品被压缩至微珠水平。 
	注意：使用显微镜观察压缩过程的进展。</li>
	<li>用一只手轻轻按住小室使其紧贴孔底，并使用电烙铁在小室边缘的三个位置加热熔化塑料，从而将小室固定在板上。</li>
	<li>小室固定后，向孔中加入2 mL培养基（DMEM/10% FBS/1%青霉素-链霉素），并以相同方式继续组装板中的其余孔。</li>
	<li>将完成组装的6孔板转移至倒置显微镜的载物台培养箱中，进行活细胞延时成像。</li>
	<li>根据适当的实验设置对样品进行延时成像。 
	注意：延时成像过程中无需更换培养基，但可通过Transwell小室侧面的孔轻松完成换液操作。</li>
</ol>

<ol><li>Saxen, L., Wartiovaara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+contact+and+cell+adhesion+during+tissue+organization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell contact and cell adhesion during tissue organization.</a> International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).</li>
<li>Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+%C3%BCber+die+tubulogenese+der+niere%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+F%C3%BCr+Naturforschung%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen über die tubulogenese der niere.</a> Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).</li>
<li>Saxen, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaxen%2C+L+%22Organogenesis+of+the+Kidney.+1st+ed%22">Organogenesis of the Kidney. 1st ed</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 536 (7615), 238(2016).</li>
<li>Halt, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD146%2B+cells+are+essential+for+kidney+vasculature+development%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">CD146+ cells are essential for kidney vasculature development.</a> Kidney International. 90, 311-324 (2016).</li>
<li>van den Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+Subcapsular+Transplantation+of+PSC-Derived+Kidney+Organoids+Induces+Neo-vasculogenesis+and+Significant+Glomerular+and+Tubular+Maturation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li>
<li>Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+vascularization+of+the+metanephric+kidney+grafted+on+the+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane.</a> Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).</li>
<li>Sariola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incomplete+fusion+of+the+epithelial+and+endothelial+basement+membranes+in+interspecies+hybrid+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli.</a> Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).</li>
<li>Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+glomerular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The origin of the glomerular endothelium.</a> Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).</li>
<li>Short, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Quantification+of+Tissue+Dynamics+in+the+Developing+Mouse+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney.</a> Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).</li>
<li>Saarela, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+fixed+z-direction+%28FiZD%29+kidney+primordia+and+an+organoid+culture+system+for+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging.</a> Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).</li>
<li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex-ovo+Chicken+Embryo+Culture+System+Suitable+for+Imaging+and+Microsurgery+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, e2154(2010).</li>
<li>Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+ex+ovo-cultivation+of+developing+chicken+embryos+for+human+stem+cell+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts.</a> Stem Cells International. 2013, 960958(2013).</li>
<li>Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt4+coordinates+directional+cell+migration+and+extension+of+the+M%C3%BCllerian+duct+essential+for+ontogenesis+of+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract.</a> Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).</li>
<li>Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie-1-directed+expression+of+Cre+recombinase+in+endothelial+cells+of+embryoid+bodies+and+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice.</a> Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).</li>
<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了两种详细方案，优化了经典的肾脏器官型培养方法，能够实现血管化、延长发育以及对离体胚胎肾脏和类器官进行理想的四维（即三维成像与时间）成像。本节重点阐述了方法中的关键步骤，并讨论了常见问题的解决方案。
其他CAM培养方法与这种改进的鸡胚CAM培养方法之间的显著区别在于，在将胚胎肾脏和肾类器官移植到CAM时，使用了定制的微型储液槽。改良的Transwell小室底部膜将样品紧压在鸡胚CAM上并固定其位置，小室的侧壁则作为培养基的储液槽，防止移植物干燥。强烈推荐将异种移植物接种于体外培养的鸡胚CAM，因为该方法可暴露更大面积的CAM，便于放置微型储液槽，并易于直观地观察血管化过程12，13。
鸡胚尿囊膜（CAM）培养方法的一个缺点是，进行异种移植的时间窗口仅限于鸡胚尿囊膜发挥功能的第8至9天，之后尿囊膜开始退化。因此，需要更长时间发育的移植物应通过异种移植至其他组织（例如小鼠肾包膜）来实现血管化<sup cla...

几十年前，胚胎肾脏的器官型培养已成为研究肾发生的重要模型1,2,3。肾脏类器官代表了一种先进的模型系统，可用于研究健康和病变肾脏的发育过程4。然而，这两种方法的主要缺陷在于均未能重现肾脏的核心功能：血液滤过。在肾脏类器官和器官型培养中，肾单位和肾脏脉管系统的发育过程与体内早期发育阶段相似；然而，体外形成的肾小球仍处于无血管状态5。离体胚胎肾脏和肾脏类器官的血管化此前仅在体内条件下通过移植实验得以实现。例如，将人多能干细胞来源的肾脏类器官移植至小鼠肾包膜下，可使其内的肾单位发育至具备功能的阶段6。
介于完全体外培养与体内移植方法之间的一种中间策略是将组织移植至禽类胚胎的绒毛尿囊膜（CAM）上。此前已通过该系统证实了完整的小鼠肾原基能够实现血管化7,8。然而，研究也表明，异种移植后小鼠肾脏中的血管系统来源于宿主内皮，而非移植物本身9。这一发现显著限制了嵌合型（禽-哺乳类）胚胎肾脏模型在肾血管系统发育研究中的应用潜力，因为实验条件不支持供体来源的内皮细胞存活。
本方案的第一部分介绍了一种改进的小鼠胚胎肾脏在禽类卵CAM上培养的方法，该方法结合了器官型培养和异种移植的微环境条件。相较于以往的方法，主要改进之处在于：不再将小鼠胚胎肾脏和肾类器官直接放置于CAM上，而是在移植区域覆盖充满培养基的可渗透微型储液器，为移植组织提供营养并防止其干燥。该改进显著提高了实验成功率，并改善了供体来源血管系统发育的条件。将此方法应用于异种移植培养时，可促进由供体肾脏内源性内皮细胞构成的肾小球血管系统的发育。
对细胞形态发生的详细分析是肾类器官培养模型的另一项重要应用。以往报道的肾类器官培养时间序列成像方法仅适用于胚胎肾整体形态和模式形成的分析，而无法用于单个细胞的追踪10。最近，一种新型的固定Z轴方向（Fixed Z-Direction, FiZD）方法被提出，旨在实现对肾类器官和器官型培养物进行高分辨率共聚焦三维时间序列成像11。该方法通过将类器官或胚胎器官轻柔地夹在盖玻片与定制培养板中Transwell插件的可渗透膜之间，直至样品厚度压缩至70 µm，从而为成像提供最佳的光学条件。在本方法的第二部分，详细描述了该定制培养板的制备流程以及FiZD实验的建立步骤，以实现类器官的长期成像。

<table><tbody><tr><td>可调式铲形钻头</td><td>Bosch</td><td>2609255277</td><td>用于钻取直径为 20 mm 的孔</td></tr><tr><td>自动鸡蛋翻转器</td><td>OLBA B.V., 荷兰</td><td>AT-42</td><td>用于卵外培养前的鸡蛋孵化</td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>松下</td><td>13090543</td><td>温度设定为 37&amp;deg; C，湿度 90%，5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>SANYO</td><td>10070347</td><td>鸡胚 CAM 培养专用培养箱。温度设定为 37&amp;deg; C，湿度 90%，5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Cellstar 6 孔板</td><td>Greiner</td><td>M9062</td><td>孔深 16 mm，与插入物匹配</td></tr><tr><td>Dremel 旋转工具用圆形锯片</td><td>Dremel</td><td>SC690</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>蔡司</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell 多孔板，带可渗透聚碳酸酯膜插入物</td><td>Corning</td><td>10301031</td><td>适用于 6 孔板。孔径 40 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>锪孔钻头</td><td>Craftomat, Bauhaus</td><td>22377902</td><td>用于抛光（20.5 mm，1/4&quot;，高速钢）</td></tr><tr><td>一次性玻璃毛细管</td><td>Blaubrand</td><td>7087 33</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀</td><td>Swann-Morton</td><td>0501</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>钻孔机</td><td>Bosch</td><td>GSR 18 V-EC Professional</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Sigma</td><td>D777</td><td>高糖</td></tr><tr><td>紧凑型 S84 鸡蛋孵化箱</td><td>Grumbach, 德国</td><td>8012</td><td>用于卵外培养前的鸡蛋孵化。温度设定为 38&amp;deg; C，相对湿度高于 60%</td></tr><tr><td>乙醇（70%）</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>受精鸡蛋</td><td>Haaviston Siitoskanala, Panelia, 芬兰</td><td></td><td>Hy-Line White 和 Nick Chick</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>HyClone</td><td>SH3007003HI Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>DUMONT #5 镊子</td><td>Dumont</td><td>#5SF</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser</td><td>Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##</td><td>22x22 mm</td></tr><tr><td>Histoacryl 胶水</td><td>贝朗</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>载物台培养箱</td><td>Okolab</td><td></td><td>Boldline，定制</td></tr><tr><td>PBS -/-</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS +/+</td><td>Biowest</td><td>X0520-500</td><td>用于清洗微型储液槽</td></tr><tr><td>青霉素和链霉素</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯微珠</td><td>Corpuscular</td><td>1000263-10</td><td>直径 70 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>旋转多用途工具系统</td><td>Dremel</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td>电烙铁</td><td>Weller</td><td>TCP S</td><td>也可使用加热的玻璃毛细管</td></tr><tr><td>Thincert 12 孔细胞培养插入物，带 0.4 &amp;micro;m 孔径聚苯乙烯膜</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665641</td><td></td></tr><tr><td>Thincert 6 孔细胞培养插入物，带 0.4 &amp;micro;m 孔径聚苯乙烯膜</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657610</td><td></td></tr></tbody></table>

肾类器官和类器官型培养的优化：促进血管化、延长发育及改善显微成像

Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging

胚胎肾类器官培养，尤其是由多能干细胞衍生的肾类器官，是研究肾脏发育过程和模拟肾脏疾病的理想工具。然而，这些模型受限于缺乏血管化和功能性。为解决这一问题，本研究改进了将细胞和组织异种移植至禽类胚胎绒毛尿囊膜（CAM）以实现血管化并恢复血流的方法。移植组织上覆盖有定制的微型储液装置，可将样本固定在CAM上，并持续提供培养基，防止移植物干燥。改进后的培养方法可使异种移植物存活并生长长达9天。本文还描述了如何利用先前发表的固定Z轴方向（FiZD）方法，为肾类器官和类器官型培养物的长期共聚焦成像提供最佳条件。该方法通过在大量培养基中，将胚胎器官或类器官轻柔地夹在盖玻片与膜之间，从而实现长达12天的高质量成像。上述两种方法结合使用，可实现肾类器官和类器官型肾组织培养的血管化与血流重建，并显著提升共聚焦成像效果。本文所述方法对于体外研究肾脏的基础与应用功能具有重要价值。这两种方法亦可广泛应用于多种类型的组织和类器官。

本研究中展示的鸡胚尿囊膜（CAM）培养方案通过将肾类器官和胚胎肾异种移植到鸡胚CAM上，实现了高效的血管化（图1，视频1）。含有培养基的微型储液装置为供体组织提供营养，并在充分血管化前的阶段防止其干燥。该方法为供体来源的内皮细胞生长提供了适宜条件。因此，移植后肾脏和类器官中的肾血管系统主要（但并非完全）由供体特异性细胞构成（图2B、C、F）。与肾组织培养相比，移植至CAM的肾脏和肾类器官中获得了更为成熟的肾小球血管结构（图2D、E）。
FiZD-方案是一种用于对离体胚胎肾脏和肾类器官进行长期延时成像的方法，适用于高分辨率共聚焦显微镜。在Trowell设计的经典器官型培养方案14中，样品被放置在由金属网格支撑的多孔滤膜上，并维...

本研究描述了两种用于研究器官发育的方法：一种是改进的禽类胚胎绒毛尿囊膜（CAM）异种移植体系，可实现培养的胚胎器官和类器官的血管化；另一种是新型的固定z轴方向器官培养方法，通过优化实验条件，可实现高分辨率的共聚焦显微镜延时成像。

胚胎肾类器官培养，尤其是多能干细胞衍生的肾类器官，是研究发育过程的优良工具……

由程序化干细胞衍生的肾脏器官培养物及细胞器为研究肾脏发育和疾病机制提供了极佳的途径。然而，目前的器官培养系统无法为肾脏提供血流。因此，现有模型尚不完整，无法重现肾脏的主要功能，即血液过滤。本文介绍了一种在鸡胚尿囊绒毛膜上培养和观察胚胎肾脏及类器官的改进方案。在本研究建立的新实验体系中，我们将移植到尿囊绒毛膜（CAM）上的肾脏原基覆盖以可渗透的微型储液装置，并注入培养基。该方案显著提高了肾脏原基及其内在内皮细胞的存活率。该方法可实现血流灌注至发育中的肾小球。近期，我们还发表了一种新型的固定方向器官培养方法，可实现高分辨率的共聚焦三维时间序列成像。该方法为类器官和器官原基的长期共聚焦成像提供了最佳条件。在该方法中，我们将组织轻轻夹在玻璃盖玻片和多孔膜之间进行压缩。本文将展示如何制备定制培养板以及如何建立培养实验。因此，本出版物介绍了一种改进的肾类器官管状结构培养技术。该方法为模拟细胞器发生以及对外植的胚胎肾脏和肾类器官进行高分辨率成像提供了更优的途径。根据实验需求，选用适用于六孔板或十二孔板的转移细胞插件。使用Dremel工具将插件侧壁切短，制成一个高两毫米、带有可渗透膜的塑料环。使用手术刀或锋利的刀片去除环形物边缘的切屑。将微型储液槽置于70%乙醇中灭菌至少一小时。然后用蒸馏水在高压灭菌器中清洗微型储液槽，并在超净工作台中干燥。用 PBS 和培养基冲洗微型储液槽。将储液槽放置在培养皿上，使其膜面朝上，并置于一滴培养基液滴上方。将分离的离体胚胎肾脏或肾类器官放置在膜上。避免在样品周围残留过多液体，并将其置于细胞培养孵育箱中孵育2至24小时。将外源移植物移植到体外培养的8日龄鸡胚的尿囊绒毛膜上。转移微型储液器，使膜覆盖移植物。将它们置于 CAM 的周边区域，避免覆盖胚胎。然后向微型储液池中加入培养基。将样品在鸡胚 CAM 上培养，最长培养 9 天。每天更换微型储液槽中的培养基。移植后 24 至 48 小时即可观察到样本的血管化情况。用于固定培养的定制六孔板制作方法如下。首先，使用带有合适钻头的钻孔机在平板底部钻出20毫米的孔。接着，打磨平板上表面孔洞的边缘。最后，将平板在70%乙醇中灭菌至少一小时。然后用蒸馏水在高压灭菌器中清洗培养板，并在超净工作台中干燥。用70%乙醇清洗22×22毫米的盖玻片，并使其完全干燥。使用组织胶将盖玻片粘附在孔底部的孔洞上方。干燥后，在无菌显微镜下检查板片并去除多余的胶水。首先，取一份聚苯乙烯微球与等体积的氢气混合。将透填插件置于解剖显微镜下，膜面朝上，并将肾脏放置在膜上。在肾脏旁边小心地加入一滴水凝胶珠混合物。翻转穿膜插入物，使膜和肾脏朝下。然后小心地将插入物放入我们定制的六孔板的孔中。非常轻柔地将插入物推入孔中。在显微镜下观察其扁平程度，直至肾脏与微珠处于同一水平。用一只手轻轻将插入物压在孔中，然后用烙铁在插入物边缘的三个位置加热熔化塑料，将其固定在板上。通过侧边的开口向孔中加入两毫升培养基。开始延时成像时，将培养板转移至倒置显微镜的载台式培养箱中。我们改进的CAM捕获方案可实现肾类器官和胚胎肾脏的高效血管化。许多含有培养基的储液槽可为供体组织提供营养，并在血管化初期阶段防止其干燥。本视频展示了移植到鸡胚尿囊膜（CAM）并培养七天后，小鼠胚胎肾脏中心区域中鸡血细胞的流动情况。该图示表明，我们改进的CAM培养方法为肾脏来源的内皮细胞提供了适宜的生长条件。图A和图B显示，胚胎肾脏在间隔培养条件下生长五天后，被移植到鸡胚尿囊膜（CAM）中心位置并继续培养五天。使用小鼠特异性CD-31抗体染色显示，移植至CAM的肾脏中心区域的内皮细胞网络比左侧对照组更为广泛。在图C中可见，小鼠血管通过小鼠特异性CD-31抗体染色显示，且与鸡的血管共存。图D和图E显示了在转运培养基或鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）上培养五天的小鼠胚胎肾脏的冷冻切片，经CD-31和Hoechst染色。与对照组培养相比，在鸡胚CAM上培养的肾脏肾小球血管更为成熟。图F显示了在转基因GFP鸡的CAM上培养七天的小鼠胚胎肾脏。小鼠内皮细胞经CD-31抗体染色后显示，异种移植小鼠肾脏中的血管系统主要但并非完全来源于小鼠。这种新型的固定方向培养方法可实现胚胎肾脏和类器官在限定距离内的培养。在传统的摇动培养中，培养的器官被放置在滤膜上，由金属网格将其固定于气液交界处。该方法为器官的发育和生长提供了良好条件，但并不适用于成像。在固定式定向培养中，培养的器官被压在培养皿的玻璃底面与一层膜之间，其厚度由作为间隔物的聚苯乙烯微珠控制。发育中的器官可直接通过盖玻片进行成像，从而获得更清晰的器官观察视野。该图显示，胚胎肾脏和肾脏类器官可通过固定方向培养法进行培养。第7天的胚胎肾脏和肾脏类器官的明场图像显示其发育正常。图C显示，在肾脏类器官发育中的肾单位已激活GFB表达；图D显示经尿路芽染色的创伤性肾脏，以及标记肾单位前体细胞的六二染色结果。图 E 和 F 展示了培养 12 天的小鼠肾脏。创伤一和肾单位染色显示了输尿管芽和足细胞。视频还展示了一个来源于台湾 creek 的 MTMG 胚胎肾脏，其中台湾 creek 能够诱导内皮细胞中 GFB 的表达。我们可以观察到，肾内皮细胞存在于发育中的胚胎肾脏中，且内皮网络也可在培养方法中发育。在右侧图示中，您可以看到内皮细胞如何迁移至S形阶段肾单位的血管裂隙中。本文介绍了将肾类器官和胚胎肾脏异种移植至鸡绒毛尿囊膜（CAM）的改进方案。该方案显著提高了肾原基及其内在内皮细胞的存活率。该方法能够实现血流进入发育中的肾小球。本文介绍的另一种方案是固定方向器官培养法，可提高成像质量，有助于在单细胞水平上研究细胞器的形成。高分辨率图像适用于对肾类器官和肾细胞培养物中的细胞行为进行自动细胞分割及基于计算机的研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

血管化、扩展发育和改进显微镜成像的肾器官和器官培养的优化

本视频介绍了一种利用禽类胚胎绒毛尿囊膜（CAM）上改进的异种移植体系来研究器官发育的方法。该方法可实现体外培养的胚胎器官和类器官的完全血管化发育。...

利用鸡胚尿囊膜进行肾脏类器官培养：一种将小鼠肾脏外植体移植至鸡胚尿囊膜以诱导肾血管结构形成的实验技术

关键词：肾脏类器官培养，鸡胚尿囊膜，小鼠肾脏外植体，肾血管结构，器官移植，血管生成，类器官系统，发育生物学，组织工程，肾单位形成

本方案所述的三维培养方法可重现小鼠胚胎胰腺前体细胞发育为分支器官的过程，包括前体细胞的大量扩增、分化及形态发生。该方法适用于对微环境进行成像观察、功能干扰及操作干预。...

体外 从小鼠胚胎前体细胞诱导胰腺器官发生

利用此处所述的单细胞分辨率三维成像方案，可完整捕获类器官的整个三维结构、细胞组成及其与原始组织的表型相似性。该方案适用于来源、大小和形状各异的多种类器官。...

单细胞分辨率下完整类器官的三维成像

本方案展示了延长患者来源异种移植瘤（PDX）体外培养时间的方法。其中一步通过简单去除无活力的单细胞，提高了多细胞簇在三维水凝胶中培养的整体存活率；另一步则展示了在灌注式微流控平台上进行PDX培养的最佳实践方法。...

灌注式微流控平台中患者来源异种移植瘤三维水凝胶体外培养的增强存活率

本文介绍了一种从人多能干细胞（hPSCs）生成肾类器官的实验方案。该方案可在两周内生成肾类器官。所获得的肾类器官可在大规模旋转烧瓶或多孔磁力搅拌板中进行培养，适用于并行药物筛选研究。...

一种从人多能干细胞生成肾类器官的简化方法

本文介绍了一种新型培养基底的制备方案，该基底每平方毫米含有数百个微容器2，其中可培养类器官并利用高分辨率显微镜进行观察。还详细描述了细胞接种和免疫染色方案。...

一种用于类器官培养与三维成像的高通量平台

本文介绍了一种将肾类器官移植到鸡胚体腔的详细方案。该方法可在8天内诱导类器官的血管化并促进其进一步成熟，可用于高效研究这些过程。...

通过鸡胚体内移植实现肾类器官的有效血管化

本方案介绍了一种利用悬浮培养条件从诱导性多能干细胞（iPSCs）高效生成肾类器官的全面方法。本研究的重点在于确定初始细胞密度和WNT激动剂浓度，从而为对肾类器官研究感兴趣的科研人员提供参考。...

从诱导性多能干细胞在悬浮培养中生成肾脏类器官

本文介绍了一种将处于不同成熟阶段的人脑类器官移植到鸡胚尿囊膜（CAM）上的实验方案。人脑类器官采用非定向标准化方案进行培养。...

早期无引导人脑类器官神经血管微环境在容许性鸡胚尿囊膜中的建模

本方案介绍了一种利用人多能干细胞生成血管类器官的方法。...

由人诱导性多能干细胞生成血管类器官

了解利用鸡胚绒毛尿囊膜优化肾脏器官培养的方法，实现血管化并提高存活率。该技术支持高分辨率成像，为研究肾脏发育与疾病机制提供更准确的模型。

肾类器官和类器官型培养的优化：促进血管化、延长发育及改善显微成像

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