Name: 斑马鱼原发性患者衍生肿瘤异种移植物的药物筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 了解斑马鱼异种移植药物筛选技术，用于自动化成像和定量分析人类癌细胞对药物的反应。该方法可快速测试患者来源白血病样本的已知药物反应，并筛选新型抗癌化合物，为肿瘤学研究提供高效、经济的体内筛选平台。

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本研究由 V 基金会 V 学者奖及美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 DP2CA228043、R01CA227656（授予 J.S. Blackburn），以及 NIH 培训项目 T32CA165990（授予 M.G. Haney）。

本方案中描述的所有操作均已获得肯塔基大学机构动物照护与使用委员会（协议编号 2015-2225）的批准。患者样本的采集已获得肯塔基大学机构审查委员会（协议编号 44672）的批准。所有依据本方案开展的动物实验必须事先获得使用者所在机构的动物照护与使用委员会的批准。
1. 解冻原代患者急性淋巴细胞白血病细胞
<ol>
	<li>将患者外周血单个核细胞（PBMCs）的冷冻储备样本在37 °C水浴中解冻。细胞一旦完全解冻，立即用移液器缓慢地将含冻存液（90% FBS + 10% 二甲基亚砜 [DMSO]）的细胞转移至15 mL锥形管中，避免产生气泡。向15 mL锥形管中的细胞逐滴加入10 mL预热至37 °C的解冻培养基（Iscove改良的Dulbecco培养基 [IMDM] 中含25%胎牛血清 [FBS]），滴加速度约为每毫升2−3秒。 
	注：PBMCs是在患者确诊时采集的血液样本中分离获得的。通过密度梯度离心法分离获得白膜层，并用RPMI 1640 + 10% FBS洗涤两次。细胞计数后，每支冻存管中加入1 mL冻存液，冻存107个细胞，随后于-80 °C保存。</li>
	<li>以100 × g 离心10分钟，吸除上清液。再重复一次解冻培养基的添加、离心和上清液吸除操作，以彻底去除残留的DMSO。</li>
	<li>将细胞重悬于5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，取出10 μL用于自动细胞计数仪或血细胞计数板计数。取用于计数的10 μL细胞悬液，加入10 μL台盼蓝染液。记录每毫升细胞数量，以便后续计算异种移植所需的细胞重悬体积（见步骤2.5）。 
	注：通常每条幼年斑马鱼异种移植500个细胞。例如，注射1,000条斑马鱼需要5 × 105个细胞。用于异种移植的细胞活力应&#62;85%。本实验中，经台盼蓝染色评估，细胞解冻后活力为96%。</li>
</ol>
2. 使用DiI对细胞进行荧光标记
<ol>
	<li>将所需数量的细胞在 5 mL PBS 中以 200 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。若存在细胞聚团或注射时加样困难等问题，染色细胞数应不少于 2 × 106 个。</li>
	<li>配制 1,1’-二辛基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI）染色液（每毫升 PBS 含 4 µL DiI 染料的 PBS 溶液共 5 mL，材料表），并将细胞沉淀重悬于该染色液中。 
	注意：重悬于染色液中时，细胞密度不得超过 2 × 106 个/mL。</li>
	<li>将细胞在 37 °C 避光孵育 20 分钟，轻轻涡旋混匀，然后在冰上避光孵育 15 分钟。</li>
	<li>以 200 × g 离心细胞 5 分钟，吸除上清液。用 5 mL PBS 洗涤细胞，以 200 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。再重复洗涤、离心和吸除步骤一次。</li>
	<li>将细胞重悬于每 250,000 个活细胞加 1 µL PBS 的溶液中，并转移至 1.5 mL 微量离心管。将重悬的细胞置于冰上避光保存，并立即进行显微注射。 
	注意：这可确保每次 2 nL 注射体积可向斑马鱼体内注入 500 个患者来源的细胞。</li>
</ol>
3. 斑马鱼幼鱼的显微注射
注意：为了提高细胞的存活率，显微注射应在染色后 1−3 小时内完成。
<ol>
	<li>在染色细胞和注射之前，制备用于注射的琼脂糖平板：将25 mL 3%琼脂糖（溶于1×Tris/硼酸/EDTA（TBE）缓冲液）倒入培养皿中，静置使其凝固。将平板置于4 °C保存，最多可保存2周。</li>
	<li>在对细胞进行染色和注射之前，先在体视显微镜下使用镊子去除2 dpf斑马鱼的卵膜。进行手动去膜时，用镊子从斑马鱼保护性卵膜的相对两端轻轻拉扯，直至卵膜撕裂，斑马鱼完全脱出卵膜包裹。10. 
	注意： 去卵膜处理也可通过蛋白酶（pronase）消化法进行，具体步骤如前所述。10. 卡斯珀 (roy-/-珍珠层-/-斑马鱼被用于这些实验11任何斑马鱼幼体品系均可用于异种移植。如果色素干扰成像或观察，且无法获得光学透明的斑马鱼品系时，可使用丙硫氧嘧啶（PTU）处理以抑制黑色素的合成。12.</li>
	<li>将针头在 4 °C 或冰上预冷，以防止显微注射过程中细胞聚集。使用微量移液器吸头将 5 µL 染色细胞装入预冷的无丝硼硅酸盐玻璃针头中。 
	注意： 显微注射仪和针头的设置方法已有文献报道13.</li>
	<li>将针头装入显微注射仪的注射臂中。使用无菌剃刀片对针尖进行斜面处理。在矿物油中使用载物台测微尺测量液滴大小，全程保持液滴体积恒定为2 nL（直径约0.15 mm）。</li>
	<li>使用 350 µL 浓度为 4 mg/mL 的三卡因-S，在含有 25 mL E3 培养基的培养皿中麻醉约 30 条去壳的 2 日龄斑马鱼幼鱼。约 1 分钟后，将麻醉的幼鱼转移至平底注射板（含 3% 琼脂糖的培养皿）中，并在目标注射位点（例如卵黄或心包腔）向每条幼鱼注射一泵染色细胞；参见 图2A，B). 
	注意： 注射位点的选择应根据实验目的而定。最常见的注射位点是卵黄。若需使细胞进入血液循环，可选择心包腔、库维耶管、卵黄周腔或眶后腔作为注射位点。也可采用原位注射位点，例如脑部。</li>
	<li>将幼虫从注射板上冲洗至10 cm培养皿中2 含E3培养基的培养皿（每皿30条幼虫）14 不加亚甲蓝，在28 °C下孵育1小时以恢复。继续注射，直至完成所需数量的幼虫注射。 
	注意： 理想情况下，注射的幼虫数量应为实验所需数量的2−2.5倍。由于注射操作及升高培养温度带来的应激，部分幼虫会死亡。通常情况下，经过技术练习后，单人可在染色细胞所需的1−3小时内完成800−1,500条斑马鱼幼虫的注射。</li>
	<li>将注射后的幼鱼培养皿移至34 °C培养箱中。切勿将幼鱼的培养皿直接放置在培养箱的金属架上，以防E3水过热。例如，可在金属架与幼鱼培养皿之间放置一个空的培养皿作为隔热缓冲。在注射后24小时和48小时（hpi）时移除死亡的斑马鱼幼鱼。</li>
</ol>
4. 利用异种移植斑马鱼建立药物筛选体系
<ol>
	<li>在接种后48小时，筛选斑马鱼幼鱼的荧光/肿瘤移植情况及健康状况（图2C,D）。剔除任何死亡或形态异常的斑马鱼，并选择移植情况相似的个体（图2C,D, 1−3 和 1’−3’）。剔除未成功移植的斑马鱼（图2C,D, 5 和 5’）。
	<ol>
		<li>对于卵黄注射的鱼，若在移植细胞团周围无法清晰辨识卵黄边界（图2C, 4），则应剔除，因其会干扰定量分析。对于心包腔注射的鱼，若注射的细胞团侵入卵黄囊（图2D, 4’），则应剔除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将斑马鱼转移至96孔板中。操作时，剪去200 µL移液枪头的尖端，使其孔径略大于4日龄斑马鱼即可通过。使用P200移液器吸取含一条斑马鱼的150 µL E3培养基，加入平底96孔板的空孔中。</li>
	<li>将待测药物按每孔150 µL的量溶于E3培养基中。药物应配制成目标浓度的2倍浓度。例如，若目标终浓度为10 µM，则应先在E3中配制20 µM的药物溶液，因为每孔总体积中有一半为药物溶液。对于DMSO对照组，加入与药物组等体积的DMSO。</li>
	<li>向每孔含有斑马鱼幼鱼的150 µL E3培养基中加入150 µL 2倍稀释的药物溶液，使每孔终体积为300 µL，药物终浓度为1倍稀释液。</li>
	<li>将96孔板置于34 °C培养。每日观察并记录死亡的斑马鱼。若需要，可在2天后更换药物：从96孔板每孔中移除200 µL液体，并补充200 µL含1倍稀释药物溶液或DMSO的E3培养基。 
	注意：本实验中，药物处理3天时效果最佳；然而，药物处理时间可在2−4天之间调整，具体时长需根据实验设计或所用药物进行优化。</li>
</ol>
5. 使用配备成像单元和自动取样单元的荧光显微镜对异种移植斑马鱼进行成像
<ol>
	<li>配制 1 L 新鲜的 4 mg/mL 三卡因溶液和 1.5 L E3 培养基。将培养基瓶 1 装入 E3 培养基，培养基瓶 2 装入三卡因溶液。</li>
	<li>在成像软件中移除所有不需要的荧光通道，并添加目标通道（本实验使用 DiI）。请勾选目标荧光通道，因为仅被勾选的通道才会被采集图像。同时，选择图像采集方式（z 轴层扫、自动成像、连续循环等）。 
	注意：本实验中，每条斑马鱼的成像均手动调节焦距，以获得最多数量的清晰对焦图像。</li>
	<li>先对 DMSO 对照组斑马鱼进行成像，再对药物处理组斑马鱼成像，以便在成像软件中设定合适的曝光时间。一旦确定曝光时间，在整个实验过程中不得更改。 
	注意：可对每条斑马鱼手动调节焦距，以确保无失焦图像；或者在全自动成像时，各条斑马鱼使用相同的焦距设置，将失焦图像剔除，或在分析前重新成像。此外，本实验也可使用任意荧光成像仪进行成像，随后利用 ImageJ 软件对荧光强度进行定量分析。</li>
</ol>
6. 使用 ImageJ 定量荧光
<ol>
	<li>打开 ImageJ 软件。</li>
	<li>依次点击 文件 | 打开，选择所需的 .czi 文件。软件将弹出导入选项窗口。
	<ol>
		<li>若需进行图像堆栈查看，请选择 多维图像，勾选 单独打开文件、自动缩放 和 拆分通道。颜色选项请选择 彩色化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击 插件 | 宏 | 记录。</li>
	<li>点击 图像 | 调整 | 阈值。在阈值窗口右侧的下拉菜单中选择图像类型为 红色。调节最低阈值，直到软件仅高亮显示具有荧光的区域（图 3A），然后点击 应用。软件将图像转换为黑白图像，所选区域显示为黑色。 
	注意：在药物筛选的所有图像中应使用相同的阈值，以确保结果标准化且具有可比性。</li>
	<li>点击 分析 | 测量。软件将弹出结果窗口，其中包含该图像的荧光区域数据。</li>
	<li>在 宏记录器 窗口中点击 创建。这将打开一个显示宏代码的新窗口。选中所有需要分析的图像，并按照步骤 6.2 的方法打开。</li>
	<li>在宏代码窗口中选择 运行。此时结果窗口将包含每张图像的测量面积。 
	注意：图像分析也可不通过记录和运行宏的方式单独进行，即对每张图像重复上述步骤。</li>
	<li>将测量得到的数据复制到电子表格中。计算所有对照组（DMSO）样本的总荧光平均值。使用以下公式计算百分比差异：–[(DMSO 平均面积 – 实验组面积) / DMSO 平均面积] × 100%（图 3B）。</li>
</ol>

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<li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li>
<li>Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Engrafted+Human+Cancer+and+Therapy+Responses+in+Immunodeficient+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish.</a> Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).</li>
<li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究中，我们展示了一种标准化的方法，用于解冻原代患者白血病细胞并将其注射到斑马鱼体内，建立异种移植模型。同时，我们还建立了一套利用配备成像单元和自动取样单元的荧光显微镜对异种移植斑马鱼进行高通量药物筛选的实验方案。此前已有使用人源细胞系进行异种移植的报道，但在该领域中，对异种移植肿瘤进行高通量定量仍是一项挑战。本方法为相关研究奠定了基础，可利用配备成像单元和自动取样单元的荧光显微镜实现异种移植斑马鱼成像的自动化，最终目标是开展高通量药物筛选，以预测特定患者的癌症可能对哪些药物产生响应，从而为实现更精准的个体化医疗提供可能。
尽管该实验方案的大部分步骤可以实现自动化，但仍存在许多不应忽视的技术挑战。首先，细胞染色后必须尽快注射到斑马鱼体内，以防止细胞聚集和细胞死亡。在进行细胞染色实验前，需要先去除胚胎的绒毛膜。玻璃微针在装载细胞前应保持低温，以减少针头堵塞。此外，使用健康成年斑马鱼（6个月至1岁）所产的胚胎对于确保异种移植幼鱼的最佳存活率至关重要。最后，应对异种移植的斑马鱼仔细筛选肿瘤植入情况，仅选择肿瘤体积相近的个体用于药物筛选，以降低最终结果的变异性。
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将原发性患者肿瘤或人类癌细胞系移植到模式生物中，是一种广泛使用的技术，用于研究肿瘤在体内的进展和行为、肿瘤对药物治疗的反应以及癌细胞与微环境的相互作用等。传统上，细胞被移植到免疫缺陷小鼠体内，这至今仍是该领域的标准方法。然而，这一模型系统存在多个局限性，例如成本高、重复数量少、难以准确量化体内肿瘤负荷，以及肿瘤移植和药物测试所需时间较长。近年来，斑马鱼作为一种替代的异种移植模型逐渐兴起，首次报道是在2005年，将表达绿色荧光蛋白（GFP）的人黑色素瘤细胞系移植到囊胚期胚胎中1,2。最近，受精后2天（dpf）的斑马鱼幼鱼被用作异种移植受体，以实现对注射解剖位置的控制，并可用于高分辨率的活体成像，以观察肿瘤与周围微环境的相互作用3,4。
斑马鱼作为异种移植模型具有诸多优势。首先，成年斑马鱼可在相对较低的成本下大规模饲养并快速繁殖。每对成年斑马鱼每周可产生数百尾幼鱼。由于体型较小，这些斑马鱼幼体可在96孔板中进行培养，适用于高通量药物筛选。在典型的异种移植实验过程中，幼鱼无需额外喂食，因其卵黄囊可为其出生后的第一周提供维持生命所需的营养。此外，斑马鱼在7天龄前尚未形成完全功能的免疫系统，这意味着在进行异种移植注射前，无需对其进行辐照或施用免疫抑制处理。最后，光学透明的斑马鱼品系可实现对肿瘤-微环境相互作用的高分辨率成像。
斑马鱼作为异种移植模型最具前景的应用之一，是能够对人类癌症样本进行高通量药物筛选，而这是其他任何模式生物都无法实现的。幼鱼可通过皮肤从水中吸收药物，从而大大简化了给药过程5。由于动物通常饲养在96孔板中，每孔水量仅为100−300 μL，因此与小鼠相比，药物筛选所需的药量更少。目前已有多种不同的方法用于标准化和量化药物对斑马鱼体内人类肿瘤负荷的影响，其中一些方法在将单药测试扩展至高通量筛选方面比其他方法更具实用性。例如，某些研究团队将鱼体组织解离为单细胞悬液，通过成像悬浮液中的单个液滴，并利用半自动化的ImageJ宏程序量化荧光标记或染色的肿瘤细胞4。另一种半自动化的全幼鱼成像方法也被开发出来，即将幼鱼固定于96孔板中，使用倒置荧光显微镜进行成像，随后对组合图像进行重新对齐，并量化肿瘤细胞灶6。然而，这两种检测方法在量化过程中均较为耗时费力，使得在斑马鱼异种移植模型中真正实现高通量药物筛选仍不切实际。
这一问题已通过脊椎动物自动化筛选技术（Vertebrate Automated Screening Technology，VAST）生物成像仪和大颗粒（LP）采样器的开发得到解决。该设备由一个配备荧光显微镜的成像单元和一个自动化采样单元组成（图1 和 材料表），是一种真正实现高通量斑马鱼幼鱼成像的自动化方法7,8,9。使用该设备时，斑马鱼幼鱼首先被麻醉，然后从96孔板中自动取样，进入毛细管后根据用户预设的偏好自动调整至指定方向，完成成像后，可选择将其转移至新的96孔板的对应孔中以供后续研究，或直接弃置。将此项成像技术与斑马鱼异种移植模型相结合，有望实现个性化医疗，即利用大规模药物化合物库对个体患者的肿瘤进行高通量药物筛选。此外，斑马鱼异种移植模型还提供了一种大规模、低成本的体内方法，用于评估新化合物的毒性和药效。在开展小鼠异种移植模型研究之前，斑马鱼可作为初步筛选的有效工具。
我们开发了一种简化的流程，用于将原代患者白血病细胞移植到斑马鱼体内，并通过自动化成像和定量进行高通量药物筛选，该流程可推广应用于其他任何原代患者肿瘤细胞或癌细胞系。该流程采用配备成像单元和自动取样单元的荧光显微镜，改进了现有的标准化和定量方法，为以往更为耗时费力的体内肿瘤负荷定量方法提供了自动化的替代方案。&#160;

<table><tbody><tr><td>10x TBE 液体浓缩液</td><td>VWR</td><td>0658-5L</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板，平底</td><td>CELLTREAT</td><td>229195</td><td>VAST 可兼容多种标准或深孔 24、48 或 96 孔板</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>无细丝硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-EI126-0001</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>D2438-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>E3 培养基</td><td></td><td>N/A</td><td>5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl₂、0.33 mM MgSO₄</td></tr><tr><td>Femtotips 微量加样尖端</td><td>艾本德</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（优质，热灭活）</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>FIJI</td><td>N/A</td><td>https://imagej.net/Fiji</td></tr><tr><td>伊氏改良杜尔贝科培养基（IMDM）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36150</td><td></td></tr><tr><td>大颗粒（LP）采样器</td><td>Union Biometrica</td><td>N/A</td><td>自动化采样装置 http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8</td></tr><tr><td>甲氨蝶呤</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>A6770-10MG</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP26291</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（1x）</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL06-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>显微镜测微尺（400-Stage）</td><td>Hausser Scientific</td><td>400-S</td><td></td></tr><tr><td>三卡因-S</td><td>Pentair Aquatic</td><td>TRS1</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>VAST 生物成像仪</td><td>Union Biometrica</td><td>N/A</td><td>配备荧光功能的显微成像装置 https://www.unionbio.com/vast/</td></tr><tr><td>硫酸长春新碱</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T117-0005</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI 染色剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>V22885</td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼中源自患者的原代肿瘤异种移植药物筛选

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

患者来源的异种移植模型对于确定不同癌症在活体系统中对药物治疗的反应至关重要。小鼠模型是该领域的标准，但斑马鱼作为一种具有多种优势的替代模型已逐渐兴起，包括能够进行高通量、低成本的药物筛选。斑马鱼还支持在活体内进行大规模重复实验的药物筛选，而此前这种规模仅能在体外系统中实现。快速开展大规模药物筛选的能力，可能为个性化医疗开辟新途径，并实现研究结果向临床应用的快速转化。斑马鱼异种移植模型还可用于根据肿瘤对靶向治疗的反应快速筛选可干预的突变，或从大型化合物库中鉴定新的抗癌化合物。目前该领域的主要局限在于如何对筛选过程进行量化和自动化，以实现更大规模的药物筛选并降低劳动强度。我们已建立了一套工作流程，可将患者的原代样本移植到斑马鱼幼鱼中，并利用配备荧光显微镜成像单元和自动取样单元的设备进行大规模药物筛选。该方法可对大量斑马鱼幼鱼中移植肿瘤区域及其对药物治疗的反应进行标准化和定量分析。总体而言，该方法相较于传统的细胞培养药物筛选具有优势，因其可在药物处理期间使肿瘤细胞在活体环境中生长，同时在进行大规模活体药物筛选时比小鼠更实用且成本更低。

按照上述方案，将初诊时来自T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）患者的外周血单个核细胞（PBMCs）以活性冷冻样本形式保存后复苏，移植至斑马鱼卵黄囊和心包腔内进行异种移植。在移植后48小时（hpi），筛选携带荧光标记肿瘤细胞的异种移植鱼（图2C,D），并分别给予化疗药物（地塞米松或长春新碱）或DMSO处理。在药物处理3天后，即移植后7天（dpi），使用配备荧光显微成像单元和自动取样单元的荧光显微镜对鱼类进行成像分析（图3A）。
使用 ImageJ 测量每条成像鱼的荧光面积/肿瘤负荷，并在不同药物处理组与 DMSO 组之间进行比较图3B总体而言，与DMSO处理的斑马鱼相比，接受长春新碱处理的异种移植斑马鱼显示出最大且最一致的移植细胞团块减少。地塞米松处理的斑马鱼肿瘤区域的减少程度约为长春新碱处理组的一半，但仍较DMSO处理组有所减小。<strong class="xfig"...

斑马鱼异种移植模型可用于在体内微环境中对人源癌细胞进行高通量药物筛选和荧光成像。我们建立了一种工作流程，利用配备自动化荧光显微镜的成像系统，在斑马鱼中对患者来源的白血病样本进行大规模自动化药物筛选。

患者来源的异种移植模型对于确定不同癌症在体内系统中对药物治疗的反应至关重要。小鼠模型是……

我们的斑马鱼异种移植药物筛选流程可实现对人类癌细胞及其对药物治疗反应的自动化成像与定量分析。该方法可用于快速测试患者癌细胞对已知药物的反应，或用于鉴定新的抗癌化合物。利用斑马鱼异种移植模型进行药物筛选，能够获得以往仅在体外系统中才可实现的体内重复样本数量。与小鼠模型相比，该方法在筛选大量化合物文库时成本效益更高。从将癌细胞注射到斑马鱼体内，到成像观察药物反应，这一工作流程包含多个步骤，通过视觉演示学习效果最佳。首先，在5毫升PBS中，以200 × g离心至少2 × 10⁶个细胞，持续5分钟，然后吸除上清液。将细胞悬液重悬于5毫米的DiI染色液中。在避光条件下于37摄氏度孵育细胞20分钟。然后轻轻涡旋，并在避光条件下将细胞于冰上孵育15分钟。然后在200 × g条件下离心细胞5分钟，并吸除上清液。通过加入5 mL PBS重悬细胞，在200 × g条件下离心5分钟，吸除上清液，对细胞进行洗涤。重复此洗涤步骤一次。将细胞重悬于每25万个活细胞1微升的PBS中，并转移至1.5毫米微量离心管中。将重悬的细胞置于冰上避光保存。在染色细胞和注射前，制备用于注射的琼脂糖平板：将25毫升3%琼脂糖（溶于1×TBE）倒入培养皿中，静置使其凝固。将培养板在 4 摄氏度下保存，最长可保存两周。在染色细胞和注射前，还需使用镊子在解剖显微镜下对受精后两天的斑马鱼进行去氯处理。用镊子从斑马鱼保护性卵膜的两端向相反方向拉扯，直至卵膜撕裂，斑马鱼完全脱膜。为防止显微注射过程中细胞聚集，需提前将无纤维素的硼硅酸盐玻璃针在4°C或冰上预冷。细胞染色后，立即使用微载吸头将5 µL染色后的细胞加入预冷的玻璃针中。随后将玻璃针装入显微注射臂。使用无菌剃刀片调整针尖至水平。利用载物台测微尺测量石蜡油中液滴的大小。保持液滴体积恒定为2纳升，其直径约为1.5毫米。麻醉后一分钟，将麻醉的幼鱼转移至已准备好的含有3%琼脂糖的平表面注射板上，在目标注射部位向幼鱼注射一泵染色的细胞。所有注射应在细胞染色后一至三小时内完成，以防止针头堵塞。将幼鱼从注射板上冲洗至一个含有不含亚甲蓝的E3培养基的10厘米培养皿中，并在28°C下孵育一小时以恢复。将注射后的幼虫培养皿放入34摄氏度的培养箱中，并在架子与幼虫培养皿之间放置一个空的培养皿作为缓冲。注射后48小时，对斑马鱼幼虫进行荧光肿瘤细胞移植及健康状况的筛选。移除任何死亡或形态异常的斑马鱼，并挑选移植情况相似的斑马鱼。移除未成功移植的斑马鱼。对于卵黄注射的斑马鱼，需移除那些在移植细胞团周围无法看清卵黄边界的个体。对于心包注射的斑马鱼，移除那些注射的细胞团侵入卵黄囊的个体。将筛选出的斑马鱼转移至96孔板时，首先剪去一个200微升枪头的尖端，剪切口只需足够让一条受精后四天的斑马鱼通过即可。使用P200移液器吸取150微升E3培养基并连同一条斑马鱼从原板中移出，加入到平底96孔板的一个空孔中。向每孔含有斑马鱼幼鱼的孔中加入150微升2倍稀释的药物溶液，使每孔终体积为300微升，含1倍浓度的药物溶液。将培养板置于34摄氏度下孵育。每天检查斑马鱼的死亡情况。两天后，如需要，可通过将每孔中的 200 微升液体更换为含药物的 1X 药物溶液或含 DMSO 的 E3 培养基来更新药物。在 Zen blue 软件中，移除成像软件中所有不需要的荧光通道，并添加 Dii 通道。检查所需的荧光通道。在同一窗口中，选择图像采集方式，包括Z轴层扫、自动化、循环和序列等参数。先对DMSO对照组斑马鱼进行成像，再对药物处理组斑马鱼成像，并在成像软件中设置合适的曝光时间。为了定量荧光，打开 ImageJ 软件。依次点击文件、打开，然后选择所需的 CZI 文件。软件将弹出导入选项窗口。进行图像堆栈查看时，选择超堆栈，勾选“单独打开文件”，勾选“自动缩放”，勾选“拆分通道”。在颜色选项中，选择“彩色”。然后点击插件、宏、记录。单击图像，进行调整并设置阈值。在阈值窗口右侧的下拉菜单中，将图像类型选择为红色。调节最低阈值，直到软件仅突出显示具有荧光的区域，然后单击应用。该软件将图片转换为黑白图像，其中选定区域显示为黑色。点击“分析”和“测量”。软件将弹出一个结果窗口，显示该图像的荧光面积。单击宏记录器窗口中的“创建”按钮。这将打开一个显示宏代码的新窗口。选中所有需要分析的图像，并根据堆叠查看或颜色选项打开。在包含宏的窗口中选择运行。此时结果窗口中已包含每张图像的面积数据。在本实验方案中，在注射后48小时，对移植了肿瘤细胞的斑马鱼进行筛选，挑选出带有荧光标记肿瘤细胞的个体，并用化疗药物或DMSO进行处理。总体而言，与DMSO处理的斑马鱼相比，接受长春新碱处理的异种移植斑马鱼显示出最大且最一致的移植细胞质量减少。地塞米松处理的斑马鱼其肿瘤面积的减少约为长春新碱处理组的一半，但仍较DMSO处理组显示出肿瘤面积的减小。该实验方案可用于筛选任何癌细胞系或患者样本对不同药物或特定靶向治疗的反应，从而深入了解每位患者的肿瘤特征。

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