Name: 胶质母细胞瘤的3D球形模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学习利用三维球状培养模型研究胶质母细胞瘤侵袭健康脑组织的机制。该方法结合Fiji宏进行定量分析，可准确评估肿瘤细胞增殖、迁移及药物反应，为脑肿瘤研究提供更具生理相关性的实验平台。

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本工作得到 Transcan 2017、ARC 2017 以及法国抗癌联盟（吉伦特省和滨海夏朗德省委员会）的资助。Joris Guyon 获图卢兹大学医院（CHU Toulouse）奖学金支持。

所有患者均签署了知情同意书（根据挪威卑尔根哈肯兰医院当地伦理委员会的规定）。我们的研究方案遵循本机构人体研究伦理委员会的指导方针。&#160;
1. 生成大小均一的肿瘤球
注意：类干细胞的培养采用神经基础培养基，添加B27补充剂、肝素、FGF-2、青霉素和链霉素，具体方法如先前文献所述12。这些细胞在培养过程中可自发形成球状体。
<ol>
	<li>用 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤肿瘤细胞，并在 37 °C 下用 0.5–1 mL 解离酶（见材料表）孵育 5 分钟。</li>
	<li>用 4–4.5 mL PBS 洗涤，然后加入 10 mL 完全培养基（完全神经基础培养基，cNBM）。</li>
	<li>使用台盼蓝和细胞计数板，通过自动计数技术进行细胞计数。</li>
	<li>为生成 100 个每球含 104 个细胞的类球体（根据所需大小），将 106 个细胞与 8 mL NBM 和 2 mL 2% 甲基纤维素混合。</li>
	<li>将悬液转移至无菌系统容器中，使用多通道移液器将 100 µL/孔加入 96 孔圆底板中。</li>
	<li>将培养板置于 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度条件下孵育。3–4 天后可形成大小均一的类球体，可用于后续实验。</li>
</ol>
2. 三维实验
<ol>
	<li>增殖
	<ol>
		<li>准备
		<ol>
			<li>将抑制剂（例如图 4A 中的鱼藤酮）和化学物质溶解于 100 µL 培养基中，并加入到每孔已含 100 µL 培养基的孔中（即每孔一个类球体）。</li>
			<li>将培养板置于 37 °C、5% CO2、95% 湿度条件下孵育。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>图像采集与分析
		<ol>
			<li>使用视频显微镜在明场模式下拍照，以建立 T0 及后续预期时间点的一系列条件图像。</li>
			<li>使用 Fiji 软件手动或半自动分析图像。若手动分析，使用自由选择工具在类球体核心周围绘制圆形，并测量每个类球体的面积。若进行半自动分析，使用 补充文件 1 中所示的宏，并选择“仅核心面积”（//Core Area only）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>侵袭
	<ol>
		<li>准备
		<ol>
			<li>在冰上于离心管中配制胶原基质：终浓度为 1 mg/mL 的 I 型胶原、1× PBS、0.023×Vcollagen、1 M 氢氧化钠和无菌 H2O。将溶液在冰上孵育 30 分钟。</li>
			<li>从圆底培养板中收集类球体至 500 µL 离心管中，用 200 µL 1× PBS 洗涤两次。</li>
			<li>小心地将类球体用移液器转移至 100 µL 胶原基质中，并将其置于普通 96 孔板各孔中央。</li>
			<li>将胶原凝胶在 37 °C 孵育 30 分钟，然后在凝胶上方加入 cNBM。此时可在培养基中加入抑制剂或激活剂（例如图 4B, 4C 中所示的盐酸）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>图像采集与分析
		<ol>
			<li>在胶原包埋后 24 小时，使用视频显微镜在明场模式下连续拍摄图像。</li>
			<li>使用 Fiji 软件手动或半自动分析图像。若手动分析，使用自由选择工具分别勾勒类球体核心及总体区域，并通过总区域减去核心区域计算每个类球体的侵袭面积。若进行半自动分析，使用 补充文件 1 中所述的宏来确定侵袭面积。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>迁移
	<ol>
		<li>准备
		<ol>
			<li>在 37 °C 条件下，用 Matrigel（0.2 mg/mL）溶于 NBM 中对 6 孔板进行 30 分钟包被，随后去除 Matrigel 并加入 2 mL cNBM。</li>
			<li>将类球体从圆底培养板转移至 50 µL cNBM 中，再接种至 6 孔板。</li>
			<li>将培养板置于 37 °C 孵育，等待 30 分钟使类球体贴附。</li>
			<li>孵育 24 小时后，加入 10 ng/mL Hoechst 染色，并在 37 °C 继续孵育 30 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>图像采集与分析
		<ol>
			<li>使用视频显微镜在明场下获取图像，使用 405 nm 激光观察 Hoechst 染色情况。</li>
			<li>使用 Fiji 软件分析图像，并运行 补充文件 1 中所述的宏。 
			注意：接触孔底或完全移除上清液会损伤类球体。处理 I 型胶原凝胶时，应保持凝胶处于冰上以防止胶原聚合；避免添加酸性成分，因为 pH 变化会影响凝胶的致密性；应迅速将细胞移入胶原中，以防止细胞死亡和凝胶降解。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Fiji 宏
注意：Fiji 是一款在公共领域开发的图像分析程序，允许开发宏以加快图像分析速度。虽然也可进行手动分析，但该过程较为缓慢且可能引入偏差。图像可通过拖放方式导入软件，并使用 ROI Manager Tools 插件进行定量分析。本研究中采用的步骤如下：
<ol>
	<li>打开宏窗口：插件 | 宏 | 交互式解释器。</li>
	<li>复制并粘贴以下修改后的紫色循环代码。保留紫色句子，并添加感兴趣的绿色句子（补充文档1）。</li>
	<li>如需分析整个序列，请调整红色部分的参数以进行特定量化，并通过选择 宏 | 运行宏 或按下 Ctrl+R 来运行宏。</li>
	<li>检查并根据需要手动调整感兴趣区域（ROI）。</li>
</ol>
4. 类球体的电子显微镜观察
注意：以下大部分步骤必须在化学通风橱中进行。
<ol>
	<li>固定步骤
	<ol>
		<li>用剪去尖端的移液器吸头收集球状体，放入1.5 mL离心管中，并用0.1 M磷酸盐缓冲液（PB）洗涤1次。</li>
		<li>在4 °C条件下，用含2%戊二醛和2%多聚甲醛（PFA）的0.1 M PB溶液对球状体进行过夜固定。</li>
		<li>将固定液更换为含1% PFA的0.1 M PB溶液，随后进行样品制备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>将球状体转移至滤网中，并置于玻璃烧杯内，以避免球状体受损。</li>
		<li>用0.1 M PB小心洗涤3次。</li>
		<li>在避光条件下用锇酸孵育2小时。将锇酸用0.1 M PB缓冲液（含1%）稀释至4%。</li>
		<li>用0.1 M PB小心洗涤3次。
		<ol>
			<li>按以下步骤进行脱水：50%乙醇中浸泡10分钟，70%乙醇中浸泡10分钟，90%乙醇中浸泡两次（每次15分钟），100%乙醇中浸泡两次（每次20分钟），丙酮中浸泡两次（每次30分钟）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将样品在丙酮/树脂（50/50）混合液中孵育2小时。在此步骤期间，配制EPON树脂（Embed-812：11.25 g；DDSA：9 g；NMA：4.5 g）。</li>
		<li>弃去丙酮/树脂混合液，更换为新配制的树脂，并过夜孵育。</li>
		<li>更换为新树脂，孵育2–6小时。</li>
		<li>将含球状体的树脂加入模具中，在60 °C下孵育48–72小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pelissier, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+dysfunction+in+mechanotransduction+impairs+differentiation+of+human+mammary+epithelial+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors.</a> Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).</li>
<li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+spheroids%3A+Relevance+to+cancer+stem+cells+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications.</a> Cancer Science. 108, 283-289 (2017).</li>
<li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+environment+interactions+in+tumor+microregions%3A+the+multicell+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model.</a> Science. 240, 177-184 (1988).</li>
<li>Desoize, B., Jardillier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+resistance%3A+a+paradigm+for+clinical+resistance%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance?</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).</li>
<li>Corbet, C., Feron, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+acidosis%3A+from+the+passenger+to+the+driver%27s+seat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat.</a> Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53409(2015).</li>
<li>Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Spheroid+Model+as+a+More+Physiological+System+for+Cancer-Associated+Fibroblasts+Differentiation+and+Invasion+In+Vitro+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e60122(2019).</li>
<li>Boye, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CXCR3%2FLRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571(2017).</li>
<li>Dejeans, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+control+of+glioma+cells+adhesion+and+migration+through+IRE1alpha-mediated+cleavage+of+SPARC+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA.</a> Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).</li>
<li>Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+SPARC+expression+promotes+U87+glioblastoma+invasion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146(2019).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+travel%3A+the+role+of+proteases+in+individual+and+collective+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion.</a> Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).</li>
<li>Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP+proteolytic+activity+regulates+cancer+invasiveness+by+modulating+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins.</a> Scientific Reports. 7, 14219(2017).</li>
<li>Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+migration+and+invasion+uncoupled%3A+increased+migration+is+not+an+inexorable+consequence+of+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).</li>
<li>de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Experimenter%27s+Guide+to+Glioblastoma+Invasion+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways.</a> Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+invasive+proteome+of+glioblastoma+revealed+by+laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology+Advances%22%5BJournal%5D)">The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection.</a> Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029(2019).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

肿瘤球体实验非常适合研究肿瘤的多种特性，包括增殖、侵袭和迁移，以及细胞死亡和药物反应。癌细胞会侵入三维基质，形成具有侵袭性的微肿瘤，如图4B,C所示。在侵袭过程中，基质金属蛋白酶（MMP）会降解肿瘤细胞周围的基质13，而MMP抑制剂（例如GM6001或Rebimastat）可能抑制细胞侵袭，但不影响迁移14。迁移与侵袭涉及部分重叠但不同的分子事件15，这些事件可在我们的球体实验中进行研究。为此，可从基因水平或通过药理学抑制手段靶向特定的信号通路。
胶质母细胞瘤已知可通过多种过程广泛侵袭周围组织（例如，共选择、白质束侵袭、间质性侵袭）16。我们近期描述了胶质母细胞瘤侵袭的两种新机制9,12</sup...

在大多数使用原代细胞或商业化细胞系的研究中，实验通常在塑料表面培养的单层细胞上进行。二维细胞培养存在局限性，因为它无法模拟体内真实的三维细胞环境。在二维培养中，细胞的整个表面直接与培养基接触，从而改变细胞生长特性并影响药物的可及性。此外，这种非生理性的塑料表面会诱导细胞分化1。为克服这些局限，已开发出三维细胞培养模型。该模型能够模拟肿瘤的多细胞结构和异质性2，因此可被视为更适用于实体瘤研究的模型3。类球体（spheroid）的复杂形态有助于更准确地评估药物的渗透性和耐药性4。类球体内的肿瘤异质性会影响氧气和营养物质的扩散，以及细胞对药理学试剂的反应（图1A）。当类球体直径达到300 µm时，氧气扩散受限，导致类球体中心形成缺氧环境（图1A,C）。代谢产物也难以穿透多层细胞，从而引发代偿性代谢反应5。随着类球体直径的增大，可观察到坏死核心的形成，进一步模拟了多种实体瘤（包括侵袭性脑癌胶质母细胞瘤（GBM））所具有的特征6。
文献中已报道了多种用于胶质母细胞瘤的二维或三维侵袭实验方法7,8。二维实验主要用于在薄基质层上或Boyden小室实验中研究细胞在水平平面上的侵袭行为9。已有研究采用经典胶质母细胞瘤细胞系进行三维类球体培养，建立三维侵袭实验模型10。更为复杂的模型包括肿瘤类球体与脑类器官在对置共培养体系中发生的侵袭现象11。然而，开发一种操作简便且可重复、适用于任何实验室的实验方法仍然具有重要意义。我们已建立了一种从患者样本中获取胶质母细胞瘤干细胞样细胞的实验方案。该实验的定量分析易于操作，仅需使用开放获取的在线软件即可完成。简言之，将肿瘤组织切成小块后进行酶消化处理，所得单细胞在神经基础培养基中进行培养。培养4–7天后，细胞可自发形成类球体结构。将此类球体植入小鼠颅内后，可形成具有坏死核心并被假栅栏状排列细胞包围的肿瘤，12，这与胶质母细胞瘤（GBM）患者肿瘤的病理特征高度相似。
本文中，我们描述了一种通过确定数量的细胞生成球状体的实验方案，以确保实验的可重复性。该过程可使用两种互补的基质：Matrigel 和 I 型胶原蛋白。Matrigel 富含生长因子，可模拟哺乳动物基底膜，促进细胞的黏附与迁移；而 I 型胶原蛋白是间质中的一种结构成分，也是最常见的纤维状细胞外基质，常用于细胞侵袭实验。本文通过迁移和增殖实验，展示了我们的胶质母细胞瘤（GBM）球状体模型。分析不仅在固定时间点进行，还通过活细胞成像技术对球状体的扩展及细胞运动进行实时监测。此外，还采用电子显微镜观察其形态学细节。

<table><tbody><tr><td>96孔圆底板</td><td>Falcon</td><td>08-772-212</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td>4 &amp;deg;C保存，用于类球体解离的酶</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587</td><td>-20 &amp;deg;C保存，使用前解冻</td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>-20 &amp;deg;C保存，使用前解冻</td></tr><tr><td>Countess细胞计数板</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 10X</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53-500</td><td>4 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>Fiji软件</td><td>ImageJ</td><td></td><td>用于图像分析</td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;培养瓶</td><td>Falcon</td><td>10497302</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>-20 &amp;deg;C保存，用冷NBM稀释至终浓度0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td>用NBM稀释至终浓度2%</td></tr><tr><td>NBM</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>4 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>Neurobasal培养基</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>4 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>4 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>0.4%台盼蓝</td><td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>I型胶原蛋白</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>4 &amp;deg;C保存</td></tr></tbody></table>

一种用于胶质母细胞瘤的三维球状模型

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

二维（2D）细胞培养无法充分模拟体内肿瘤的生长情况。因此，人们开发了三维（3D）类球体培养模型。这些模型在神经肿瘤学领域可能尤为重要。事实上，脑肿瘤具有侵袭健康脑组织环境的倾向。本文介绍了一种我们开发的理想的基于3D胶质母细胞瘤类球体的实验方法，用于研究肿瘤侵袭。我们提供了成功实施该实验所需的全部技术细节和分析工具。

类球体的制备方法如方案部分所述，并对迁移、侵袭、增殖及显微成像进行了观察。为测量球形结构不同区域的缺氧情况，采用碳酸酐酶IX染色来确定缺氧活性（图1A-C）。在类球体中心观察到更多的CAIX阳性细胞（图1A-C）。位于类球体核心的缺氧细胞相较于周围细胞表现出更强的糖酵解活性。线粒体可进一步通过透射电子显微镜成像进行分析（图1Ba-1Bb）。由2.5 × 103、5 × 103、104或2 × 104个细胞组成的类球体，其直径分别约为350、400、500或650 µm（图2A）。实验开始后4天内可使用类球体进行实验（...

本文介绍了一种易于使用的胶质母细胞瘤侵袭实验方法。该实验适用于胶质母细胞瘤干细胞样细胞。同时介绍了一种用于便捷定量分析侵袭、迁移和增殖的Fiji宏工具。

二维（2D）细胞培养不能充分模拟体内肿瘤生长。因此，三维（3D）培养类球体模型被……

二维细胞培养无法充分模拟体内肿瘤的生长。为了改进这一局限，已开发出使用球状体的三维方法。我们基于三维胶质母细胞瘤球状体的检测方法特别适用于研究脑肿瘤向健康脑组织环境的侵袭过程。三维培养模型可用于模拟肿瘤的多细胞结构、异质性及代谢状态，从而更严格地评估药物效应。操作时务必避免触碰孔板底部，不要完全去除上清液，保持凝胶处于冰上，并迅速将细胞加入凝胶中。为生成大小均一的肿瘤类球体，首先用五毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤目标肿瘤细胞培养物，然后用0.5至1毫升解离酶处理细胞。在37摄氏度下孵育5分钟后，加入4至4.5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）终止反应，并将脱落的细胞转移至含有10毫升完全培养基的15毫升锥形管中。计数后，将细胞重悬于8毫升完全培养基中，使细胞密度为每8毫升含1×10⁶个细胞，并加入2毫升浓度为2%的甲基纤维素，混匀后将细胞悬液转移至无菌体系容器中。随后，向96孔圆底培养板的每孔中加入100微升细胞悬液，将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养3至4天。进行侵袭实验时，当肿瘤细胞已形成大小均一的球状体后，将每个细胞结构转移至500微升离心管中，并用200微升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤球状体一次。第二次洗涤后，小心地将球状体转移至100微升新配制的胶原基质中，并将每份球状体悬液加入平底96孔板每个孔的中央。在37摄氏度孵育30分钟后，向每孔凝胶上方加入100微升完全培养基。为获得最佳的肿瘤细胞侵袭成像效果，请务必将所有类球体置于每个孔的中央。进行迁移实验时，待肿瘤细胞形成大小均一的类球体后，用含有0.2毫克/毫升Matrigel的生长培养基在37摄氏度条件下孵育6孔板30分钟。孵育结束后，移除Matrigel，并向每孔加入2毫升完全生长培养基。将球状体从圆底板中以50微升体积转移至六孔板的各个孔中，并将该板放入细胞培养孵育箱中培养24小时。次日，在37摄氏度条件下，用10纳克/毫升的Hoechst染色30分钟。在侵袭或迁移实验后进行成像时，将六孔板置于配备摄像机的明场共聚焦显微镜载物台上，并在适当的实验时间段内获取图像。为了以半自动化方式分析图像，将图像导入 Fiji，然后点击 Plugins（插件）、Macros（宏）、Interactive Interpreter（交互式解释器）。复制并粘贴修改后的紫色循环代码。保留紫色语句，并根据需要添加感兴趣的绿色语句。然后，为测量每个球状体的面积，点击“分析”并选择“测量”。为了检测球状结构不同区域的缺氧情况，可使用碳酸酐酶IX染色来确定缺氧活性。在此代表性分析中，球状体中心区域观察到更多的碳酸酐酶IX阳性细胞。位于类球体核心的缺氧细胞通常比围绕核心的细胞具有更强的糖酵解活性。线粒体可通过电子显微镜成像以进行进一步分析。类球体的直径与构成该三维细胞结构的细胞密度直接相关，可使用 Fiji 宏来定量分析每个类球体内部细胞的增殖、侵袭或迁移能力。类球体核心的增大反映了细胞增殖的增强。当线粒体呼吸链复合体 I 受到抑制时，线粒体内绝大多数 ATP 的生成受到损害，导致 72 小时后增殖率降低 20%。盐酸处理在 24 小时内增强了 I 型胶原的侵袭能力，但与未经处理的对照类球体相比，其迁移面积减少了 1.5 倍。通过活体成像评估，这些球状体表现出高度的内部动态性，并快速移动。球状体的大小应相对均匀，在操作时需注意将其移至孔板的中央位置，以获得最佳成像效果。该方法还可用于研究肿瘤细胞的增殖、迁移与死亡，以及细胞外基质、细胞受体或目标胞内蛋白的表达情况。类球体也可被包封，通过去除包封胶囊来研究细胞表面张力增加的影响。

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癌症研究

胶质母细胞瘤的3D球形模型

本视频展示了如何将来源于脑肿瘤的胶质瘤球分离为单个细胞，并将其包封在基于透明质酸的水凝胶中。该过程促进细胞间的相互作用，形成结构化的三维胶质母细胞瘤模型。...

一种基于透明质酸的水凝胶用于胶质母细胞瘤细胞的三维培养

来源：Guyon, J.，等．用于胶质母细胞瘤的三维球体模型．J. Vis. Exp.

肿瘤细胞侵袭的三维球体模型构建

采用无血清神经球培养基对分离的高级别胶质瘤手术标本进行传代培养，以富集具有肿瘤干细胞表型的细胞。对于无法形成神经球的标本，提供了一种替代性实验方案。同时介绍了保持神经球三维结构的石蜡包埋技术，用于免疫细胞化学分析。...

优化高级别胶质瘤手术标本的细胞培养，用于临床相关动物模型及三维免疫化学分析

侵袭周围正常组织是恶性肿瘤的一个显著特征。本文提供了一种简单且半自动化的微孔板检测方法，用于检测细胞对天然三维生物基质的侵袭能力，该方法已成功应用于多种人类晚期癌症模型。...

三维（3D）肿瘤球体侵袭实验

在此，我们描述了一种用于胶质母细胞瘤（GBM）的临床前原位小鼠模型，该模型通过将来源于基因工程小鼠模型肿瘤的细胞进行颅内注射而建立。该模型呈现出人类GBM疾病的典型特征。在转化研究中，小鼠脑肿瘤可通过影像学手段进行追踪 体内 MRI 与组织病理学...

多形性胶质母细胞瘤的转化性原位模型

鸡胚被用于研究人类胶质母细胞瘤（GBM）脑肿瘤 在卵内 以及在 离体 脑片共培养。通过延时显微成像可记录胶质母细胞瘤细胞的行为， 离体 共培养，且两种制备物均可在实验终点通过详细的三维共聚焦分析进行检测。...

利用鸡胚脑作为模型 在体 内 和 离体 人类胶质母细胞瘤细胞行为分析

在此，我们介绍一种可实现肿瘤类球体快速、稳定且低成本制备并进行水凝胶包封的实验方案。该方法无需特殊设备，具有广泛的适用性，尤其适用于研究类球体与基质间的相互作用以及构建 体外 组织生理学或病理学模型...

肿瘤类球体的制备及其在聚乙二醇水凝胶中的包封用于研究类球体-基质相互作用

我们介绍一种用于模拟胶质瘤侵袭前沿肿瘤微环境并包含间质液流的方法。该模型采用透明质酸-胶原蛋白I水凝胶，并置于组织培养插入式装置中，可施加流体压力。该系统可用于定量分析细胞侵袭行为，并可对细胞进行分离或裂解。...

一种具有间质流的光聚合透明质酸-胶原侵袭性胶质瘤微环境模型

本研究建立了一个代谢谱分析平台，该平台整合了三维（3D）胶质瘤类球体与基于细胞外通量分析的成像标准化方法。该方法可更准确地评估肿瘤对药物治疗的代谢反应，并有助于揭示潜在的耐药机制。...

三维脑肿瘤类球体药物筛选中的代谢谱分析进展

我们介绍一种利用新诊断和复发性肿瘤患者来源的磁性胶质瘤球体构建的三维胶质母细胞瘤迁移模型。该平台可实现对患者特异性迁移动态的可视化，并可用于评估治疗效果。在迁移完成后，该检测方法还可进行多重分析，以评估蛋白质的定位和表达模式。...

可重复的缺氧条件下磁性纳米颗粒介导类球体定位的三维胶质母细胞瘤迁移实验

学习利用三维球状培养模型研究胶质母细胞瘤侵袭健康脑组织的机制。该方法结合Fiji宏进行定量分析，可准确评估肿瘤细胞增殖、迁移及药物反应，为脑肿瘤研究提供更具生理相关性的实验平台。

一种用于胶质母细胞瘤的三维球状模型

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