一种用于胶质母细胞瘤的三维球状模型

二维细胞培养无法充分模拟体内肿瘤的生长。为了改进这一局限，已开发出使用球状体的三维方法。我们基于三维胶质母细胞瘤球状体的检测方法特别适用于研究脑肿瘤向健康脑组织环境的侵袭过程。

三维培养模型可用于模拟肿瘤的多细胞结构、异质性及代谢状态，从而更严格地评估药物效应。操作时务必避免触碰孔板底部，不要完全去除上清液，保持凝胶处于冰上，并迅速将细胞加入凝胶中。为生成大小均一的肿瘤类球体，首先用五毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤目标肿瘤细胞培养物，然后用0.5至1毫升解离酶处理细胞。

在37摄氏度下孵育5分钟后，加入4至4.5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）终止反应，并将脱落的细胞转移至含有10毫升完全培养基的15毫升锥形管中。计数后，将细胞重悬于8毫升完全培养基中，使细胞密度为每8毫升含1×10⁶个细胞，并加入2毫升浓度为2%的甲基纤维素，混匀后将细胞悬液转移至无菌体系容器中。随后，向96孔圆底培养板的每孔中加入100微升细胞悬液，将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养3至4天。

进行侵袭实验时，当肿瘤细胞已形成大小均一的球状体后，将每个细胞结构转移至500微升离心管中，并用200微升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤球状体一次。第二次洗涤后，小心地将球状体转移至100微升新配制的胶原基质中，并将每份球状体悬液加入平底96孔板每个孔的中央。在37摄氏度孵育30分钟后，向每孔凝胶上方加入100微升完全培养基。

为获得最佳的肿瘤细胞侵袭成像效果，请务必将所有类球体置于每个孔的中央。进行迁移实验时，待肿瘤细胞形成大小均一的类球体后，用含有0.2毫克/毫升Matrigel的生长培养基在37摄氏度条件下孵育6孔板30分钟。孵育结束后，移除Matrigel，并向每孔加入2毫升完全生长培养基。

将球状体从圆底板中以50微升体积转移至六孔板的各个孔中，并将该板放入细胞培养孵育箱中培养24小时。次日，在37摄氏度条件下，用10纳克/毫升的Hoechst染色30分钟。在侵袭或迁移实验后进行成像时，将六孔板置于配备摄像机的明场共聚焦显微镜载物台上，并在适当的实验时间段内获取图像。

为了以半自动化方式分析图像，将图像导入 Fiji，然后点击 Plugins（插件）、Macros（宏）、Interactive Interpreter（交互式解释器）。复制并粘贴修改后的紫色循环代码。保留紫色语句，并根据需要添加感兴趣的绿色语句。

然后，为测量每个球状体的面积，点击“分析”并选择“测量”。为了检测球状结构不同区域的缺氧情况，可使用碳酸酐酶IX染色来确定缺氧活性。在此代表性分析中，球状体中心区域观察到更多的碳酸酐酶IX阳性细胞。

位于类球体核心的缺氧细胞通常比围绕核心的细胞具有更强的糖酵解活性。线粒体可通过电子显微镜成像以进行进一步分析。类球体的直径与构成该三维细胞结构的细胞密度直接相关，可使用 Fiji 宏来定量分析每个类球体内部细胞的增殖、侵袭或迁移能力。

类球体核心的增大反映了细胞增殖的增强。当线粒体呼吸链复合体 I 受到抑制时，线粒体内绝大多数 ATP 的生成受到损害，导致 72 小时后增殖率降低 20%。盐酸处理在 24 小时内增强了 I 型胶原的侵袭能力，但与未经处理的对照类球体相比，其迁移面积减少了 1.5 倍。

通过活体成像评估，这些球状体表现出高度的内部动态性，并快速移动。球状体的大小应相对均匀，在操作时需注意将其移至孔板的中央位置，以获得最佳成像效果。该方法还可用于研究肿瘤细胞的增殖、迁移与死亡，以及细胞外基质、细胞受体或目标胞内蛋白的表达情况。

类球体也可被包封，通过去除包封胶囊来研究细胞表面张力增加的影响。