Name: C. Elegans生理应激反应的测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 学习使用荧光转录报告基因在秀丽隐杆线虫中测量细胞蛋白毒性应激反应的方法。该技术可高通量检测遗传和药理学扰动对保护性细胞通路激活的影响，为发育生物学和分子生物学研究提供重要工具。

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R.BZ. 受欧洲分子生物学组织（EMBO）长期博士后奖学金和拉里·L·希尔布卢姆基金会资助。R.H.S. 受美国国家衰老研究所（NIA）资助的项目 5F32AG032023-02 及格伦医学研究基金会博士后奖学金资助。A.F. 受 NIA 资助的项目 F32AG051355 资助。H.K.G. 受美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目 DGE1752814 资助。M.G.M. 受 NIA 资助的项目 1F31AG060660-01 资助。A.D. 受托马斯与斯泰西·西贝尔基金会、霍华德·休斯医学研究所资助，并获得 NIA 项目 4R01AG042679-04 和 5R01AG055891-02 以及 NIEHS 项目 5R01ES021667-09 的支持。我们感谢 Larry Joe、Melissa Sanchez、Naame Kelet 和 Anel Esquivel 提供的重要技术支持。我们感谢 Morimoto 实验室和线虫遗传中心 CGC（由美国国立卫生研究院研究基础设施项目 P40 OD010440 资助）提供菌株。

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了利用荧光转录报告系统和生理应激生存实验来研究 C. elegans 细胞应激反应的方法。这些报告系统均采用由参与细胞应激反应的转录因子下游靶基因启动子驱动的 GFP 表达。具体介绍了由 XBP-1s 介导的 UPRER 调控的 hsp-4p::GFP、由 ATFS-1 介导的 UPRMT 控制的 hsp-6p::GFP、由 SKN-1 介导的氧化应激反应（OxSR）调控的 gst-4p::GFP，以及由 HSF-1 介导的热休克反应调控的 hsp16.2p::GFP 和 hsp-70p::GFP。其他标准化的转录报告系统见表 3。本文所列的所有转录报告系统均具有较宽的动态范围，可通过遗传干扰或施加应激诱导化学物质来稳健地激活。此外，这些报告系统的信号均可通过敲低所用启动子上游的转录因子而受到抑制。最后，每种转录报告系统均对应一种特定的生理应激生存实验，以提供激活或抑制特定应激反应后生理效应的功能读出。
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生物体对细胞内和细胞外环境变化作出响应的能力对其生存和适应至关重要。这一过程在细胞水平上通过多种保护性通路实现，以维持细胞的完整性。尽管多种细胞组分都可能受到应激相关损伤的影响，但细胞应激反应的一个主要作用是修复并维持细胞蛋白质组的稳态。然而，蛋白质被区室化分隔到称为细胞器的特定结构中，这给细胞带来了挑战，因为细胞无法依赖单一的中心化蛋白质质量控制机制来确保细胞内所有蛋白质正确折叠并具有功能。因此，为了应对蛋白质的紊乱，细胞器进化出了专门的质量控制机制，能够识别错误折叠的蛋白质，并在该区室内激活应激反应，以缓解应激状态。例如，细胞质依赖热休克反应（HSR），而内质网（ER）和线粒体则依赖其区室特异性的未折叠蛋白反应（UPR）。氧化应激反应（OxSR）则用于缓解活性氧（ROS）的毒性作用。每种应激反应均在细胞面临挑战或环境损伤时被激活，并诱导特异性的转录反应。这些反应的特征包括合成能够将错误折叠蛋白质重新折叠的分子（如分子伴侣），并将其靶向至正确的细胞器，或者通过蛋白质降解途径清除受损蛋白质。若这些应激反应无法被正常激活，将导致受损蛋白质积累、细胞功能障碍，并进一步扩展为组织系统的功能衰竭，最终导致生物体死亡。不同应激反应的功能与调控机制已在其他文献中综述1。
关于细胞应激反应调控及其活性的许多研究进展都归功于线虫Caenorhabditis elegans，这是一种在遗传学研究中广泛使用的多细胞模式生物。线虫不仅可用于研究应激反应在细胞水平上的激活，还可用于研究其在个体水平上的表现；研究人员已利用线虫探讨基因扰动或药物和污染物暴露对其生长和存活的影响。线虫具有繁殖周期短、遗传背景一致、身体透明、遗传操作简便以及实验操作容易等优点，使其成为此类研究的理想模型。此外，线虫对应激的生理反应相对较快（数小时至数天内），且其细胞信号通路在进化上高度保守，因此线虫在应激抗性研究中是一种重要的研究工具。
通常使用两种 E. coli 菌株作为食物来源来培养 C. elegans：标准菌株 OP50（一种 B 型菌株，历史上大多数实验均使用该菌株）2 和 HT115（一种 K-12 型菌株，几乎所有的 RNAi 实验均使用该菌株）3,4。需要注意的是，OP50 与 HT115 两种细菌饮食之间存在显著差异。研究表明，以不同细菌为食会导致线虫在代谢谱、线粒体 DNA 拷贝数以及包括寿命在内的多种主要表型上产生显著差异5。其中部分差异归因于在 OP50 细菌上生长所导致的维生素 B12 缺乏，这种缺乏可引起线粒体稳态障碍，并增加对病原体和应激的敏感性。所有这些表型缺陷均被证实可通过在 HT115 细菌上培养而得到缓解，因为 HT115 细菌含有更高水平的维生素 B126。因此，建议所有关于生理应激反应的实验均应在 HT115 细菌上进行，无论是否需要 RNAi 条件。然而，由于在 OP50 上维持线虫培养较为简便，所有常规培养（即线虫的维持与扩增）均可在 OP50 上进行，只要在同步化后（即漂白后孵化，无论是否进行 L1 期阻滞）将线虫转移至 HT115 上直至实验开始，则本文所述实验范式中未观察到显著差异。
本文描述了利用两种功能性方法对细胞应激反应活性进行表征。需要注意的是，所展示的实验方案主要聚焦于细胞应激反应及其对蛋白质稳态的影响。首先，采用荧光转录报告系统，该系统由内源性基因启动子调控，这些启动子可特异性地响应不同类型的细胞应激而被激活。这些荧光转录报告系统基于应激反应中天然存在的特定基因的转录诱导。例如，HSP-4 是一种热休克蛋白，与人类分子伴侣 HSPA5/BiP 同源，在内质网（ER）应激时被激活，并定位于内质网以缓解应激状态。在内质网应激条件下（例如，暴露于衣霉素），由 hsp-4 启动子驱动的绿色荧光蛋白（GFP）会大量合成，可通过荧光显微镜观察或通过线虫的大颗粒流式细胞术进行定量检测7。类似地，线粒体分子伴侣 hsp-6（与哺乳动物 HSPA9 同源）的启动子被用于监测线粒体未折叠蛋白反应（UPRMT8）的激活；而细胞质分子伴侣 hsp-16.2（与人类晶状体蛋白 alpha 基因同源）的启动子则用于评估热休克反应（HSR）的活性9。这些报告系统可快速表征在各种干扰条件下被激活的信号通路。
通常，本文所介绍的报告基因通过显微镜成像进行检测，从而获得应激反应激活情况的定性结果。然而，尽管成像技术能够提供上述报告基因在信号强度和组织定位方面的信息，其定量分析并不总是准确或可靠。虽然可以利用图像分析工具对荧光信号进行定量，但这些方法通量相对较低，且由于成像的动物数量较少，样本量较小。由于 C. elegans 易于快速获得大量个体，因此成为利用大型颗粒流式细胞仪检测荧光应激报告基因激活的理想模式系统。大型颗粒流式细胞仪能够基于尺寸和荧光信号对大量活体动物进行记录、分析和分选。利用该方法，可对数千条线虫获得其荧光强度、体型大小以及空间（二维）信息。该系统由 FlowPilot 软件控制，可实现对测量参数的实时数据采集与分析。本文提供了利用显微成像和大型颗粒流式细胞仪进行定量分析的两种方法，用于检测应激反应的激活情况。
除了报告基因分析外，还可以通过生理应激检测来测量动物对压力的敏感性或耐受性。该方法通过将动物暴露于能够激活特定细胞应激通路的应激环境中来实现。本文提供了多种用于测定整体动物对特定类型应激源敏感性的方法。
通过使用化学试剂衣霉素（tunicamycin）对C. elegans施加内质网（ER）应激，该试剂可阻断N-连接糖基化，导致错误折叠的蛋白质在内质网中积累10。在C. elegans中，暴露于衣霉素会导致内质网功能发生显著紊乱，并显著缩短寿命11。通过测定线虫在含衣霉素培养板上的存活情况，可定量评估其对内质网应激的敏感性。例如，那些异位诱导内质网未折叠蛋白反应（UPRER）从而增强对内质网中蛋白质错误折叠应激耐受能力的线虫，相较于野生型线虫，在衣霉素处理下的存活率更高12。
通过将秀丽隐杆线虫（C. elegans）暴露于化学试剂百草枯，可对其施加氧化应激和线粒体应激。百草枯是一种常用的除草剂，可在线粒体中特异性地引发超氧阴离子的生成13。由于线粒体来源的活性氧（ROS）具有特定的定位，百草枯实验常被用作一种&#34;线粒体&#34;应激检测方法。然而，超氧阴离子可被线粒体中的超氧化物歧化酶（SODs）迅速转化为过氧化氢14。过氧化氢随后可从线粒体中扩散出来，在细胞的其他区室中引发氧化应激。因此，我们将百草枯生存实验描述为同时检测对线粒体应激和氧化应激的敏感性（其他氧化应激实验方法可参见文献15）。
通过将秀丽隐杆线虫（C. elegans）置于升高的温度下，可对其进行耐热性检测。线虫的环境适宜温度约为15–20 °C，当温度超过25 °C时即会引发热应激16,17。耐热性检测通常在30–37 °C范围内进行，因为在此温度下线虫会出现显著的细胞缺陷，且生存检测可在24小时内完成16,18。本文提供了两种进行耐热性检测的替代方法：在34 °C下培养和在37 °C下培养。结合RNA干扰介导的基因敲低或化学药物文库的标准筛选方法，本文所述的实验方案可用于开展大规模筛选研究。
该方案可分为四个主要步骤：秀丽隐杆线虫的培养及成像前准备（第1和第2节）、利用荧光显微镜对转录报告基因进行成像（第3至第5节）、使用大颗粒流式细胞仪对报告基因进行定量检测（第6节）以及用于测量应激敏感性的生理学实验（ 秀丽隐杆线虫 （第7节）

<table><tbody><tr><td>抗霉素A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>用于线粒体应激</td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118072</td><td>用于NGM平板</td></tr><tr><td>BD Difco颗粒琼脂</td><td>VWR</td><td>90000-782</td><td>用于NGM平板</td></tr><tr><td>二水氯化钙</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>用于NGM平板</td></tr><tr><td>羧苄青霉素</td><td>BioPioneer</td><td>C0051-25</td><td>用于RNAi</td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td>用于NGM平板</td></tr><tr><td>COPAS Biosorter</td><td>Union Biometrica</td><td>350-5000-000</td><td>配备488 nm光源</td></tr><tr><td>COPAS清洗液</td><td>Union Biometrica</td><td>300-5072-000</td><td>与COPAS配合使用</td></tr><tr><td>COPAS鞘液</td><td>Union Biometrica</td><td>300-5070-100</td><td>与COPAS配合使用</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>药物溶剂</td></tr><tr><td>无二噁烷IPTG</td><td>Denville Scientific</td><td>CI8280-4</td><td>用于RNAi</td></tr><tr><td>LB肉汤（Miller培养基）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426500</td><td>用于LB培养基</td></tr><tr><td>M205FA体视显微镜</td><td>Leica</td><td>10450040</td><td>配备Leica DFC3000G单色CCD相机、标准Leica GFP滤光片（激发波长395-455，发射波长480 LP）和LAS X软件</td></tr><tr><td>七水硫酸镁</td><td>VWR</td><td>EM-MX0070-3</td><td>用于NGM平板和M9培养基</td></tr><tr><td>百草枯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>36541</td><td>用于氧化应激/线粒体应激</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>用于漂白溶液</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>VWR</td><td>EM-PX1570-2</td><td>用于NGM平板</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>VWR</td><td>EM-PX1565-5</td><td>用于M9培养基</td></tr><tr><td>Revolve</td><td>ECHO</td><td>75990-514</td><td>配备奥林巴斯4倍平场荧光物镜（NA 0.13）、标准奥林巴斯FITC滤光片（激发波长470/40；发射波长525/50；分光镜560）以及iPad Pro用于成像和运行ECHO软件</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289-50G</td><td>用于成像</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0420-5</td><td>用于NGM平板和M9培养基</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>VWR</td><td>71003-472</td><td>用于M9培养基</td></tr><tr><td>叔丁基过氧化氢</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>458139</td><td>用于氧化应激</td></tr><tr><td>盐酸四环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660-5G</td><td>用于RNAi</td></tr><tr><td>衣霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7765-50MG</td><td>用于内质网应激</td></tr></tbody></table>

生理应激反应的测量 秀丽隐杆线虫

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

生物体常常暴露于不断变化的环境以及细胞内稳态的改变中，这些因素可能对其蛋白质组和生理状态产生有害影响。因此，生物体进化出了特异性的应激反应机制，以修复损伤并维持稳态。这些机制包括内质网未折叠蛋白反应（UPRER）、线粒体未折叠蛋白反应（UPRMT）、热休克反应（HSR）以及氧化应激反应（OxSR）。本文所介绍的实验方案描述了在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中检测和表征这些信号通路激活及其生理后果的方法。首先，介绍了使用通路特异性的荧光转录报告基因进行快速的细胞水平表征、药物筛选或大规模遗传筛选（如RNAi或突变体文库筛选）。此外，还描述了若干互补性强且可靠的生理学检测方法，可用于直接评估动物对特定应激源的敏感性，从而对转录报告基因的结果进行功能性验证。综合来看，这些方法可实现对内外源性蛋白毒性干扰所引起的细胞和生理效应的快速表征。

利用转录报告基因检测应激反应的激活 
此处使用荧光转录报告基因，其可作为有效工具用于检测秀丽隐杆线虫（C. elegans）中大多数应激反应的激活。绿色荧光蛋白（GFP）的表达由参与响应特定区室应激的关键转录调控因子的经典靶基因启动子驱动。常用转录报告基因的完整列表见表3。
通过错误折叠或未折叠蛋白以及脂质双分子层应激干扰内质网（ER）稳态，会激活内质网未折叠蛋白反应（UPRER），以恢复内质网的质量与功能。UPRER 包含三个不同的信号通路，由三种跨膜感受器定义：肌醇需求蛋白1（IRE1）、激活转录因子6（ATF6）以及RNA依赖性蛋白激酶（PKR）样内质网激酶（PERK），这些通路在 C. elegans7,<sup cla...

本文通过检测荧光转录报告基因的激活以及生物体对生理应激的敏感性，对线虫C. elegans中的细胞蛋白毒性应激反应进行表征。

生物体常常暴露于不断变化的环境中，并经历细胞内稳态的改变，这些因素可能对其蛋白质组产生不利影响，并……

这些方法可用于表征秀丽隐杆线虫（C. elegans）的应激反应，并确定遗传或药物干预是否影响保护性细胞通路的激活。这些方法可在分子和生理水平上快速、高通量地检测数百种干预措施（如基因敲低）。为确保实验正确进行，需设置阳性和阴性对照。将健康且营养充足的动物同步至合适的发育阶段，并在实验中使用新鲜的培养板。通过挑针进行线虫显微操作的过程可视化，有助于新用户理解如何排列线虫并评估其活力。本实验操作将由本实验室的研究生 Phil Frankino、Holly Gildea 和 Melissa Metcalf 演示。为了利用在热休克蛋白4启动子驱动下表达GFP以激活内质网未折叠蛋白反应的动物，将同步化的报告动物在20摄氏度下培养至L4阶段，用M9培养基将线虫从培养板上洗下，并转移至离心管中。通过离心收集线虫后，弃去M9培养基，替换为含有25纳克/毫升目标药物的M9培养基（实验组）或含二甲基亚砜的M9培养基（对照组）。随后将线虫置于20摄氏度的旋转平台上孵育3至4小时。孵育结束后，先将线虫离心沉淀，然后用15毫升M9缓冲液替换处理液。经过两次洗涤后，根据需要将线虫转移至NGM平板或NGM RNA干扰平板，并在20摄氏度下过夜恢复。当线虫恢复后，在无菌的标准NGM平板上加入5至10微升100毫摩尔的叠氮化钠溶液，并将线虫平板置于解剖显微镜下观察。将10至20只动物从培养皿转移到叠氮化钠液滴中。动物落入盐溶液后应很快停止运动。待叠氮化钠挥发后，将所有动物按前后方向一致的朝向排列在所需的成像装置中，并立即将装有动物的培养皿置于体视显微镜下。启动体视显微镜成像软件，在采集选项卡下，单击打开项目和文件夹以创建新项目。右键单击并选择重命名，以修改文件夹名称。将线虫样品置于显微镜物镜下，使用明场模式定位线虫的正确焦平面，以尽量减少荧光淬灭。样品的中心位置应为卵列清晰可见且不模糊的点。设置曝光时间，以确保像素未达到饱和，同时保证信号高于检测限。在设置好曝光时间、放大倍数、焦距和明场聚光镜至适当参数后，点击“捕获图像”按钮以获取图像。使用复合式宽场显微镜成像时，将基线对照处理板放置在复合式宽场显微镜载物台上，并使用触摸板启动控制程序。创建新的相册和文件名，将培养板置于物镜下方。利用基线对照板和阳性对照板设置曝光时间和荧光强度，使信号可见但不饱和。然后保存明场和GFP FITC图像。为了通过大颗粒流式细胞术定量报告基因的诱导，首先打开细胞仪激光器并启动细胞仪软件。在软件窗口中单击“开始”以启动激光器，然后在氩激光器控制弹出窗口中单击“运行”以启动激光器。当激光功率达到约 12 毫瓦，且 488 光源水平升至约 12 时，单击“完成”并检查四个压力值。如果这些数值与原始设置中观察到的数值相似，则勾选“压力正常”复选框。接下来，为确保鞘液和样本流经流动池时无气泡或碎屑堵塞，多次单击“清洗”。

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科研

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生物学

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