C. Elegans生理应激反应的测量

在这里，我们通过测量荧光转录机的激活和对生理应激的敏感性来描述线虫C.elegan的细胞蛋白毒性应激反应。

这些方法可用于描述C.elegans的应激反应，并确定遗传或药理扰动是否影响保护性细胞通路的激活。这些方法允许在分子和生理水平上快速和高通量测试数百个扰动，如基因敲击。为确保正确执行检测，包括阳性和阴性控制。

将健康、喂养良好的动物同步到适当的阶段，并使用新鲜的盘子进行实验。使用拾取器对蠕虫进行微管理可视化可以帮助新用户了解如何对蠕虫进行排列和评估，以了解其可行性。展示这些程序的将是菲尔·弗兰科诺、霍莉·吉尔迪娅和梅丽莎·梅特卡夫，他们是我们实验室的研究生。

使用动物表达GP下热休克蛋白四的启动，激活内质性电散展开蛋白质反应，生长同步记者动物在20摄氏度，直到L4阶段，并洗涤蠕虫从板使用M9介质转移到管。通过离心收集蠕虫后，在控制动物管中用M9中M9或二甲基硫化物中感兴趣的药物每毫升25毫微克替换M9。然后在20摄氏度的旋转平台上放置蠕虫3至4小时。

在孵育结束时，将蠕虫离心，然后单独用15毫升M9代替处理溶液。洗涤后，将动物转移到NGM板或NGM RNA干扰板，让蠕虫在20摄氏度下过夜恢复。当蠕虫恢复后，在标准NGM板上加入5至10微升100毫摩尔酸钠，并将一盘蠕虫放在解剖显微镜下。

将10至20只动物从盘子里转移到阿齐德钠的斑点。动物在降落在盐溶液中后不久，就应该抓住运动。一旦亚兹德钠蒸发，将动物与前部和后部在相同的方向上与动物进行排队，并立即将动物板置于立体显微镜下。

启动立体显微镜成像软件，在"采集"选项卡下，单击打开项目和文件夹以打开新项目。右键单击并选择重命名以重命名文件夹。将蠕虫样本置于显微镜目标下，并使用"亮场"设置定位蠕虫的正确焦点，以最大限度地减少荧光漂白。

样本的中心将是鸡蛋线清晰可见且不模糊的点。设置曝光时间以确保像素未饱和，并确保信号超过检测限制。将曝光时间、缩放、对焦和亮场冷凝器设置为适当的设置后，单击捕获图像按钮即可获取图像。

对于使用复合宽场显微镜进行成像，将基线控制处理板放在复合广场显微镜阶段，并使用触摸板启动控制程序。创建新专辑和文件名，将板放在客观透镜下。使用基线控制和正控制板设置曝光时间和荧光强度，以便信号可见但未饱和。

然后保存布莱特菲尔德和 GFP FITC 图像。要通过大颗粒流式细胞仪量化记者的感应，首先打开细胞仪激光器，打开圆度计软件。单击"开始"打开软件窗口中的激光，然后单击"运行"以启动 argon 激光控制弹出窗口中的激光。

当激光达到约 12 毫瓦，488 光源电平达到 12 左右时，单击完成并检查四个压力值。如果这些值看起来与原始设置中观察到的值相似，请检查压力"确定"框。接下来，要确保没有气泡或碎屑阻挡护套的流动，并通过流单元取样，请单击清洁几次。

然后关闭排序和护套以重新启动流。要检查流速，请收集护套 60 秒。将护套收集到15毫升管中60秒。

流速应为每分钟 9 到 10 毫升。要运行样品，请将激光光电倍增器功率调整到足够高的水平，使信号高于检测限制，但不超过饱和度限制。执行尺寸浇注以排除气泡、碎屑、鸡蛋和其他不需要的小颗粒，并仅包括感兴趣的动物（如成人）。

设置筛选参数后，将准备好的蠕虫添加到杯子中，然后单击"获取"。注意确保所有液体不会进入机器，因为这会使流动细胞计进入空气并在探测器内产生气泡。当样本低且/或收集到足够的动物时，单击"停止"。

若要仅根据大小约束存储封闭数据，请单击设置、数据存储、仅封闭和存储封闭数据以保存数据。然后用去维水冲洗收集杯，用真空洗涤三次，然后用下一个样品重复分析。为了测量线粒体和氧化应激敏感性，在M9中，每个平底96孔板的条件下，每口50至75微升百草枯，每个条件将8至10个蠕虫转移到百草枯的每口井。

每两个小时，轻轻敲打一下盘子，使活的动物跳动或弯曲，以便对每井的死动物数量进行评分。为了测量动物的温度敏感性，在20摄氏度下孵育蠕虫3至4天，然后每盘电镀10至15只动物，总共4至6个板。然后将板放入34或37摄氏度的孵化器中，并像刚才证明的，每两小时对蠕虫进行评分。

hsp-4 记者在没有压力的情况下给人的印象最少，但当动物使用药物 Tunicamycin 暴露于内质性压力时，这种表达却表现出稳健的 GFP 表达。这些差异也可以使用大型粒子流细胞计进行量化。此外，通过RNA干扰敲打XBP-1，可以完全抑制在内质性电内压的转基因。

类似的测定可以测量线粒体应激、氧化应激和热应激。整个动物对压力的生理反应也可以用几种生存分析来测量。例如，接触图尼卡霉素用于测量内质性内质性内质应激敏感性。

XBP-1基因的降低导致对Tunicamycin的敏感性显著增加。此外，接触化学剂百草枯用于测量氧化和线粒体应激敏感性。DAF-2基因的敲击导致对百草枯的耐药性显著增加。

可以通过确定动物在高温下的生存来测量温度，并可以绘制成生存曲线。这些测定应至少进行四到六次，并且所有复制应相互绘制，因为与其他应力测定相比，热耐症显示出令人难以置信的高变异性。成像动物时，必须设置参数，使信号没有过饱和或饱和，并确保在整个实验中使用相同的参数。

此处描述的成像方案适用于大规模筛选，包括全基因组筛选，非常适合探索性研究，然后可以进行以下生理分析。