从骨骼肌活检样本中分离肌原纤维并利用纳牛顿分辨率力传感器测定其收缩功能

评估从横纹肌中分离出的肌原纤维的收缩特性，可用于确定肌节功能障碍是否为肌节蛋白突变所致肌肉无力的主要原因。该技术可获得信噪比极高、分辨率达到纳牛顿级别的数据。本方案也适用于测量透化心肌细胞的收缩力。

请注意，力传感器非常脆弱。因此，在从固定针上清除胶水或粘贴肌原纤维时，需要手部稳定、大量练习和极大耐心。在安装组织之前，将匀浆器棒放入含有肌肉组织的试管中。

保持离心管置于冰上，在5档速度下旋转转子15秒。匀浆结束后，取50微升所得的肌原纤维悬液和250微升松弛液，转移至组织浴槽中经聚-HEMA包被的载玻片上。用盖子盖住浴槽，防止灰尘污染混合液，静置5至10分钟，使肌原纤维沉降至液滴底部。

在肌原纤维下沉过程中，将虫胶乙醇胶水在65摄氏度下加热30至60秒，然后在未包被的玻璃载片上加入约六微升胶水。反复将每个固定针的尖端浸入胶水中，直至可见一层胶水附着。随后使用显微操作器垂直移动探针和压电元件，为显微镜载物台上的组织浴槽腾出空间，并移除含有胶水的玻璃载片。

安装肌原纤维后，为测量肌节长度，移动压电装置和/或力探针，将肌原纤维的初始肌节长度设定为 2.5 µm。使用系统控制软件中的容器功能，测量肌原纤维的长度和宽度。利用显微镜载物台将肌原纤维置于视频图像中央，并从肌原纤维一侧向另一侧拉出一个矩形框，注意包含胶滴的深色边缘。

要开始记录数据，请点击“开始”。五秒后，点击“暂停”。此时长度数据将已被记录。

为测量宽度，将相机旋转90度以观察肌原纤维边缘的对比度。调整矩形区域后，点击“开始”以启动数据记录。五秒后，点击“暂停”。

宽度将已被记录。为定位theta玻璃管，请使用目镜和操纵器小心地将theta玻璃管移向肌原纤维。将theta玻璃管的上通道与肌原纤维对齐，并执行快速步进来检查位置。

打开背景松弛流以检查theta玻璃的对齐情况，并使用Luer阀杆打开流动室的流入。然后，为启动流动室的排出并防止其溢出，将流出泵阀设置为浴阀二，微步模式设置为微，柱塞目标设置为48,000，柱塞速度设置为38至40。为测量张力重建速率，计算使肌原纤维松弛15%所需的压电移动量，并将该值输入信号发生器。

单击“继续”以恢复数据记录，并打开阀门一和六，分别使松弛液和不同钙浓度溶液流经θ玻璃管。在干涉仪上选择“重置范围”，以重置干涉仪的范围，使基线力为零伏。当力信号稳定后，使用100微米的步长对θ玻璃管执行快速步进操作。

当达到力的平台期时，使用压电陶瓷进行缩短-重拉伸操作。将记录一次激活-松弛轨迹。点击暂停。

进行分步拉伸时，先点击“开始”并重置干涉仪的范围，使基线力为零伏。使用信号发生器执行分步拉伸。拉伸完成后，利用压电陶瓷将肌原纤维缩短至松弛长度。

然后按暂停、停止并保存数据。此处显示的是从健康人体股四头肌分离出的肌原纤维在活性力实验中的力-时间曲线。该肌原纤维使用不同钙离子浓度的溶液共激活五次，所有肌原纤维的平均最大力约为 123 毫牛顿每平方毫米。

通过五个钙曲线上每次激活所达到的平台期力值构建力-钙浓度曲线，可计算出产生最大力值50%时的钙浓度。如本代表性分析所示，可在单次实验中用多种化合物处理肌原纤维，以进一步探究肌原纤维类型相关问题。还可测量主动收缩力和肌节长度，从而计算力的重新发展速率、激活速率和舒张速率。

虚线红框中显示的陡峭上升是由黏性和弹性共同引起的。平台阶段仅类似于弹性组分。由于黏性对应变呈线性抵抗，因此在应变移除后力随之下降。

放置theta玻璃管时，务必将其与肌原纤维正确对齐。否则，激活溶液可能会进入光纤与力探针悬臂之间，导致数据中出现伪迹。此外，肌原纤维也可能无法正常激活。

这种灌注方法也适用于确定肌原纤维的肌纤维类型。例如，可先用正常的钙溶液对肌原纤维进行灌注，随后使用相同的溶液再次灌注，但此时加入针对特定肌纤维类型的增强收缩力的化合物。