Name: 使用纳米-牛顿分辨率力转换器从骨骼肌肉活检中隔离肌异物并确定收缩函数 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学习使用纳米牛顿分辨率光学力探针从骨骼肌中分离肌原纤维并测量其收缩特性。该方法可高精度评估肌节功能障碍与肌肉无力的关系，适用于心肌细胞研究。

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本项目由 AFM-Telethon 和 A Foundation Building Strength for Nemaline Myopathies 资助。作者谨向本文所提及产品的开发者 IONOptix Inc. 表示感谢。

<ol><li>Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcomere+Dysfunction+in+Nemaline+Myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuromuscular.+Disease%22%5BJournal%5D)">Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy.</a> J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).</li>
<li>Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+and+passive+forces+of+isolated+myofibrils+from+cardiac+and+fast+skeletal+muscle+of+the+frog%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog.</a> Journal of Physiology. 500, Pt 2 535-548 (1997).</li>
<li>Kulke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+major+source+of+myofibrillar+stiffness+in+Drosophila+indirect+flight+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle.</a> Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).</li>
<li>Stehle, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isometric+force+kinetics+upon+rapid+activation+and+relaxation+of+mouse%2C+guinea+pig+and+human+heart+muscle+studied+on+the+subcellular+myofibrillar+level%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level.</a> Basic Research in Cardiology. 97, Suppl 1 127-135 (2002).</li>
<li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).</li>
<li>Ribeiro, P. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers%3A+Effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li>
<li>Joureau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+sarcomere+contractility+contributes+to+muscle+weakness+in+ACTA1-related+nemaline+myopathy+%28NEM3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3).</a> Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).</li>
<li>de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+perfusion+shows+intersarcomere+dynamics+within+single+skeletal+muscle+myofibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).</li>
<li>Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+force+enhancement+is+regulated+by+titin+in+skeletal+and+cardiac+myofibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils.</a> Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).</li>
<li>Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+in+non-cross-bridge+forces+after+stretch+of+activated+striated+muscle+is+related+to+titin+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).</li>
<li>Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+detection+system+for+probing+cantilever+deflections+parallel+to+a+sample+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface.</a> Review of Scientific Instruments. 82, 013701(2011).</li>
<li>Chavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferrule-top+nanoindenter%3A+an+optomechanical+fiber+sensor+for+nanoindentation%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation.</a> Review of Scientific Instruments. 83, 115110(2012).</li>
<li>Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metrological+approach+for+the+calibration+of+force+transducers+with+interferometric+readout%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+Topography%3A+Metrology+and+Properties%22%5BJournal%5D)">A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout.</a> Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).</li>
<li>van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+dynamic+mechanical+analysis+for+heterogeneous+soft+matter+using+ferrule-top+indentation%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation.</a> Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).</li>
<li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KBTBD13+is+an+actin-binding+protein+that+modulates+muscle+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2019).</li>
<li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation-specific+effects+on+thin+filament+length+in+thin+filament+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy.</a> Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).</li>
<li>Ottenheijm, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleting+exon+55+from+the+nebulin+gene+induces+severe+muscle+weakness+in+a+mouse+model+for+nemaline+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy.</a> Brain. 136, 1718-1731 (2013).</li>
<li>Ribeiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers%3A+effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li>
<li>Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+Myosin-II+Inhibitor+%28N-benzyl-p-toluene+Sulphonamide%2C+BTS%29+on+Contractile+Characteristics+of+Intact+Fast-twitch+Mammalian+Muscle+Fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motililty%22%5BJournal%5D)">Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).</li>
<li>Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+kinetics+and+individual+sarcomere+dynamics+in+cardiac+myofibrils+after+rapid+Ca%282%2B%29+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes.</a> Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).</li>
<li>Najafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-diastolic+force+pre-activates+cardiomyocytes+and+determines+contractile+force%3A+role+of+titin+and+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium.</a> Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).</li>
</ol>

Michiel Helmes 是 IONOptix 公司的股东兼共同所有人。

本文描述了一种用于评估从人类或动物骨骼肌组织中分离的肌原纤维收缩功能的实验方案。该实验装置的力分辨率此前已由 Chavan 等人报道。12简而言之，该噪声主要由检测光纤与悬臂之间形成的法布里-珀罗腔长度的随机波动所决定，这些波动在读出信号输出端（以 V 表示）产生主导部分的噪声；将此噪声乘以偏转灵敏度（以 m/V 表示）和悬臂的弹簧常数（以 N/m 表示），即可得到力噪声。在本实验装置中，读出信号输出端在空气中的均方根（rms）噪声在每秒采集 1,000 个数据点（sample/s）的采样频率下约为 2 mV。在典型的肌原纤维测量中，使用弹簧常数约为 0.7 N/m 的插芯顶端探针（偏转灵敏度） &#8764;300 nm/V）。该均方根值对应的悬臂梁偏转分辨率为 0.6 nm，相当于约 0.37 nN 的力灵敏度。力探针通过将固定针尖抵住称重天平并同时使悬臂梁的弯曲程度等于读出激光波长的整数倍来进行校准。13该校准方法包含了悬臂和固定针的刚度，以及由于肌原纤维收缩的速度和幅度可能导致的悬臂和固定针扭矩变化。目前已有基于检测从悬臂反射的激光信...

横纹肌细胞对日常生活活动至关重要。肢体运动、呼吸功能以及心脏的泵血运动都依赖于肌细胞产生的力量。骨骼肌由肌束组成，肌束内包含成束的单根肌纤维（图1A）。这些肌纤维由肌原纤维构成，而肌原纤维则由串联排列的肌节组成（图1B,D）。肌节中含有细肌丝和粗肌丝，分别主要由肌动蛋白和肌球蛋白分子链构成（图1B）。肌动蛋白与肌球蛋白之间的相互作用是肌肉产生力量的基础。编码肌节蛋白（如nebulin、肌动蛋白和肌钙蛋白T）的基因发生突变的患者，会因收缩功能障碍而出现肌无力1。
肌肉收缩功能的质量可以在不同组织水平上进行研究，从体内完整肌肉到体外运动实验中的肌动蛋白-肌球蛋白相互作用均可作为研究对象。在过去几十年中，多个研究团队已开发出用于测定单个肌原纤维收缩功能的实验装置2,3,4,5,6,7,8,9,10。这些装置基于检测肌原纤维收缩引起悬臂激光偏转变化（即光学束偏转法）的原理（详见 Labuda 等人11）。尽管测定肌原纤维收缩功能存在一定局限性（例如，缺乏肌原纤维上游的兴奋-收缩耦联过程的动力学信息），但该方法具有多项优势：1）可在肌节几何约束存在的条件下评估肌动蛋白-肌球蛋白相互作用；2）可避免相邻肌原纤维损伤带来的潜在混杂效应（在测定单根肌纤维收缩力时，超微结构损伤和肌原纤维排列紊乱可能影响收缩功能）（图1D）；3）肌原纤维直径较小（约1 µm，图2A），且无膜结构，使得钙离子几乎可瞬时扩散至肌节内。此外，若肌原纤维存在结构损伤，通常会在分离过程或实验过程中发生断裂。因此，评估肌原纤维收缩功能是一种研究肌肉收缩基本机制的精巧方法，也有助于明确肌节蛋白突变所致肌肉疾病是否主要源于肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的异常。
本方案介绍了一种新开发的用于测定肌原纤维收缩力的装置，该装置结合了具有纳牛顿（nano-Newton）分辨率的悬臂式力探针（即Optiforce）。该力探针基于干涉测量原理。干涉测量技术使得可以使用相对刚性的悬臂，从而在悬臂几乎不发生偏转的情况下测量力，使肌原纤维的收缩状态更接近等长收缩。该探针能够以高信噪比评估单个肌原纤维产生的低水平被动和主动收缩力，这些肌原纤维可分离自不同肌肉活检样本，包括人体组织样本。本装置中集成的光学悬臂力探针基于法布里-珀罗（Fabry-Pérot）干涉仪12。该干涉仪可检测安装在套管上的镀金悬臂与一根光纤之间发生的微小位移（图3）。光纤与悬臂之间的间隙称为法布里-珀罗腔。肌原纤维通过两根涂有胶的玻璃固定纤维连接在探针与压电马达之间。肌原纤维产生的力可通过干涉仪数据进行数学推导。干涉测量基于两个或多个波（在本装置中为三个光波）的叠加或干涉原理。干涉仪发射波长为1,528.77–1,563.85 nm的激光，并通过光纤传输。在探针内部，光在以下三个界面发生反射：1）光纤与介质之间的界面（图3A）；2）介质与悬臂之间的界面（图3B）；3）悬臂金属基底与镀金层之间的界面（图3C）。界面A和B的反射取决于探针所处介质的折射率（n）。由这三个叠加反射光组成的光信号返回至干涉仪中的光电二极管。光电二极管测量光强，该光强是三个反射光叠加后形成的干涉图样的结果。当通过激活或拉伸肌原纤维产生收缩力时，肌原纤维会牵拉悬臂，这一运动改变法布里-珀罗腔的尺寸（d），从而改变腔内可容纳的波长数量。从悬臂反射的光将具有不同的相位，导致干涉图样发生变化。光电二极管将这种干涉图样强度的变化记录为电压变化。随后，结合悬臂刚度，由该电压变化计算出肌原纤维产生的力。制造商通过将连接在悬臂自由端的固定针尖压向称重天平来校准力探针，同时使悬臂的弯曲程度等于读出激光波长的整数倍13。因此，干涉测量是一种高度敏感的方法，可用于检测微小距离变化，实现纳牛顿级分辨率的力测量。该分辨率使得肌原纤维力的测定具有高信噪比。尽管传统干涉测量将测量范围限制在干涉曲线的线性部分，但使用锁相放大器并调制激光波长可克服这一限制14。这一点将在讨论部分进一步详细说明。
为了测量肌原纤维的主动张力，采用了一种快速切换灌流系统，以使肌原纤维暴露于含钙溶液中（图4A）。该快速切换灌流系统可在10毫秒内完成溶液更换。由于肌原纤维直径很小，钙离子扩散进入肌原纤维几乎瞬时完成。因此，该系统特别适用于测量激活过程中肌动蛋白-肌球蛋白结合速率以及舒张过程中解离的速率。激活速率（kACT）和舒张速率（kREL）可通过激活-舒张曲线确定。此外，通过将肌原纤维暴露于钙离子浓度逐步升高的溶液中，可测定张力-钙关系及钙敏感性。
此外，压电长度电机可实现肌原纤维的快速拉伸与缩短。这为研究肌原纤维的黏弹性特性（即被动张力），以及进行快速缩短再重新拉伸以测定张力恢复速率（kTR）提供了可能。从主动张力和被动张力实验中获得的参数可因肌节蛋白的基因突变而发生改变。
该定制装置用于测量从健康人、患者和小鼠骨骼肌中分离出的肌原纤维的主动和被动收缩特性。

<table><tbody><tr><td>Bio Spec Products, Inc.</td><td>985370-XL</td><td>用于分离肌原纤维</td><td></td></tr><tr><td>定制编码</td><td></td><td>Matlab</td><td></td></tr><tr><td>定制制造</td><td></td><td>包含通过串行连接进行控制的Labview程序；用于控制阀门</td><td></td></tr><tr><td>定制制造</td><td></td><td>用于冷却帕尔帖模块</td><td></td></tr><tr><td>定制制造</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>定制制造</td><td></td><td>铝制组织腔室</td><td></td></tr><tr><td>定制制造</td><td></td><td>用于控制阀门；包含通过USB控制的PC软件</td><td></td></tr><tr><td>IonOptix</td><td></td><td>系统控制器软件：具有用于压电和快速步进的高级信号发生器的数据记录软件</td><td></td></tr><tr><td>IonOptix</td><td>MCS100</td><td>用于记录肌节长度</td><td></td></tr><tr><td>IonOptix</td><td></td><td>包含：Optiforce（干涉仪）、微操作器、信号接口、压电马达及控制器。基于MyoStretcher设计</td><td></td></tr><tr><td>IonOptix</td><td></td><td>力探针</td><td></td></tr><tr><td>Koolance</td><td>ADT-EX004S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koolance</td><td>EX2-755</td><td>用于冷却帕尔帖模块</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft</td><td></td><td>数据注册</td><td></td></tr><tr><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus</td><td>TH4-200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>529265</td><td>聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）；用于显微镜载玻片的涂层，防止组织粘连</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>78471</td><td>溶于乙醇后形成胶水的晶体</td><td></td></tr><tr><td>TE Technology, Inc.</td><td>TE-63-1.0-1.3</td><td>用于冷却组织流动腔室</td><td></td></tr><tr><td>TE Technology, Inc.</td><td>TC-720</td><td>包含通过USB控制的PC软件</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Trading AG</td><td>20736652</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecan Trading AG</td><td>20739263</td><td>与快速步进灌注系统联用的注射泵，用于诱导背景流；组织流动腔室的流出端</td><td></td></tr><tr><td>Thermo scientific</td><td>2441081</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td><td>已停产</td><td>替代型号：SF-77CST/VCS-77CSP</td><td></td></tr><tr><td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td><td>TG150-4</td><td>用于灌注组织</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>1台PC用于IonWizard，另1台PC用于其他软件</td><td></td></tr></tbody></table>

从骨骼肌活检样本中分离肌原纤维并利用纳牛顿分辨率力传感器测定其收缩功能

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

横纹肌细胞对人类和动物的活动至关重要。单个肌纤维由肌原纤维组成，而肌原纤维则由串联连接的肌节构成，肌节是肌肉中最小的收缩单位。编码肌节蛋白的基因发生突变时，肌节功能障碍会导致患者出现肌无力。研究肌原纤维力学特性可以在测量单根肌纤维收缩力时，避免邻近受损肌原纤维可能带来的干扰因素，从而准确评估肌动蛋白与肌球蛋白之间的相互作用。肌原纤维的超微结构损伤和排列紊乱可能导致收缩功能受损。如果肌原纤维存在结构性损伤，在分离过程或实验过程中很可能发生断裂。此外，对肌原纤维的研究还能在肌节几何约束存在的条件下评估肌动蛋白与肌球蛋白的相互作用。例如，通过肌原纤维的测量可以阐明肌原纤维功能障碍是否为肌节蛋白突变的直接效应。另外，由于肌原纤维直径很小，灌注钙溶液或化合物几乎可以瞬间完成，这使得肌原纤维非常适合用于测量收缩过程中激活和舒张的速率。本文所述方案采用基于法布里-珀罗干涉仪原理的光学力探针，可测量纳牛顿（nN）范围内的力，并结合压电长度马达和快速步进灌注系统。该装置能够以高分辨率力测量手段研究肌原纤维的力学特性。

使用系统控制软件记录并打开数据轨迹（参见材料表）。将完整的轨迹或选定的片段导出至剪贴板或文本文件，以便使用所需的软件进行进一步分析。通过自定义软件或手动切换阀门以控制不同溶液的流动。使用自定义的 MATLAB 脚本分析激活速率、张力重建速率和舒张速率。最大主动力以及被动力实验中的峰值力和平台期力直接从系统控制软件的力轨迹中获取。安装肌原纤维后（图2），选择所需的实验方案。
最大主动收缩力与钙-小鼠和人类骨骼肌活检分离的肌原纤维中力的敏感性 
在 图 4A 用于主动收缩力实验的实验装置示意图如图所示。图中展示了从健康人股四头肌分离的肌原纤维进行主动收缩力实验的力迹。该肌原纤维依次用不同pCa值的溶液（pCa 6.2、5.8、5.6、5.4、4.5）激活5次（所示数据来自 图4B）。本实验中所有肌原纤维...

本文介绍了一种以纳牛顿分辨率评估横纹肌肌原纤维收缩特性的实验方案。该方案采用基于干涉测量法的光学力探针装置，可获得高信噪比的数据，并能够检测肌原纤维的收缩动力学特性。

横纹肌细胞对人类和动物的活动至关重要。单个肌纤维由肌原纤维组成，而肌原纤维又由……

评估从横纹肌中分离出的肌原纤维的收缩特性，可用于确定肌节功能障碍是否为肌节蛋白突变所致肌肉无力的主要原因。该技术可获得信噪比极高、分辨率达到纳牛顿级别的数据。本方案也适用于测量透化心肌细胞的收缩力。请注意，力传感器非常脆弱。因此，在从固定针上清除胶水或粘贴肌原纤维时，需要手部稳定、大量练习和极大耐心。在安装组织之前，将匀浆器棒放入含有肌肉组织的试管中。保持离心管置于冰上，在5档速度下旋转转子15秒。匀浆结束后，取50微升所得的肌原纤维悬液和250微升松弛液，转移至组织浴槽中经聚-HEMA包被的载玻片上。用盖子盖住浴槽，防止灰尘污染混合液，静置5至10分钟，使肌原纤维沉降至液滴底部。在肌原纤维下沉过程中，将虫胶乙醇胶水在65摄氏度下加热30至60秒，然后在未包被的玻璃载片上加入约六微升胶水。反复将每个固定针的尖端浸入胶水中，直至可见一层胶水附着。随后使用显微操作器垂直移动探针和压电元件，为显微镜载物台上的组织浴槽腾出空间，并移除含有胶水的玻璃载片。安装肌原纤维后，为测量肌节长度，移动压电装置和/或力探针，将肌原纤维的初始肌节长度设定为 2.5 µm。使用系统控制软件中的容器功能，测量肌原纤维的长度和宽度。利用显微镜载物台将肌原纤维置于视频图像中央，并从肌原纤维一侧向另一侧拉出一个矩形框，注意包含胶滴的深色边缘。要开始记录数据，请点击“开始”。五秒后，点击“暂停”。此时长度数据将已被记录。为测量宽度，将相机旋转90度以观察肌原纤维边缘的对比度。调整矩形区域后，点击“开始”以启动数据记录。五秒后，点击“暂停”。宽度将已被记录。为定位theta玻璃管，请使用目镜和操纵器小心地将theta玻璃管移向肌原纤维。将theta玻璃管的上通道与肌原纤维对齐，并执行快速步进来检查位置。打开背景松弛流以检查theta玻璃的对齐情况，并使用Luer阀杆打开流动室的流入。然后，为启动流动室的排出并防止其溢出，将流出泵阀设置为浴阀二，微步模式设置为微，柱塞目标设置为48,000，柱塞速度设置为38至40。为测量张力重建速率，计算使肌原纤维松弛15%所需的压电移动量，并将该值输入信号发生器。单击“继续”以恢复数据记录，并打开阀门一和六，分别使松弛液和不同钙浓度溶液流经θ玻璃管。在干涉仪上选择“重置范围”，以重置干涉仪的范围，使基线力为零伏。当力信号稳定后，使用100微米的步长对θ玻璃管执行快速步进操作。当达到力的平台期时，使用压电陶瓷进行缩短-重拉伸操作。将记录一次激活-松弛轨迹。点击暂停。进行分步拉伸时，先点击“开始”并重置干涉仪的范围，使基线力为零伏。使用信号发生器执行分步拉伸。拉伸完成后，利用压电陶瓷将肌原纤维缩短至松弛长度。然后按暂停、停止并保存数据。此处显示的是从健康人体股四头肌分离出的肌原纤维在活性力实验中的力-时间曲线。该肌原纤维使用不同钙离子浓度的溶液共激活五次，所有肌原纤维的平均最大力约为 123 毫牛顿每平方毫米。通过五个钙曲线上每次激活所达到的平台期力值构建力-钙浓度曲线，可计算出产生最大力值50%时的钙浓度。如本代表性分析所示，可在单次实验中用多种化合物处理肌原纤维，以进一步探究肌原纤维类型相关问题。还可测量主动收缩力和肌节长度，从而计算力的重新发展速率、激活速率和舒张速率。虚线红框中显示的陡峭上升是由黏性和弹性共同引起的。平台阶段仅类似于弹性组分。由于黏性对应变呈线性抵抗，因此在应变移除后力随之下降。放置theta玻璃管时，务必将其与肌原纤维正确对齐。否则，激活溶液可能会进入光纤与力探针悬臂之间，导致数据中出现伪迹。此外，肌原纤维也可能无法正常激活。这种灌注方法也适用于确定肌原纤维的肌纤维类型。例如，可先用正常的钙溶液对肌原纤维进行灌注，随后使用相同的溶液再次灌注，但此时加入针对特定肌纤维类型的增强收缩力的化合物。

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生物学

使用纳米-牛顿分辨率力转换器从骨骼肌肉活检中隔离肌异物并确定收缩函数

肌肉功能的测量有助于评估肌肉病理的潜在治疗方法，以及阐明该组织生理学的潜在机制。我们将演示趾长伸肌和膈肌的功能测试前处理。将展示等长收缩和离心收缩的实验方案，并比较代表病理状态的肌营养不良肌肉与野生型肌肉在实验结果上的差异。...

评估来自肌营养不良症小鼠模型的分离骨骼肌的等长和离心收缩力

肌纤维的分离与培养是金标准 体外...

分离与培养成年骨骼肌单个肌纤维及其卫星细胞

本方案描述了使用微尺度硅悬臂梁作为可变形培养表面，用于测量肌细胞收缩力的方法。 体外细胞收缩引起悬臂弯曲，该弯曲可被测量、记录并转换为力的读数，从而提供一种用于测量收缩功能的非侵入性且可扩展的系统...

利用微尺度硅悬臂梁评估细胞收缩功能 体外

化学去膜或透化骨骼肌纤维收缩特性的分析为在单个肌细胞水平上评估肌肉功能提供了一种强有力的方法。本文概述了一种制备和检测透化骨骼肌纤维的有效且可靠的实验技术。 体外.

透化骨骼肌纤维产生的最大等长收缩力的测定

本方案旨在逐步描述利用去膜心肌细胞提取和评估心脏功能的技术。该方法可利用从小块冷冻活检样本中获取的材料，对肌丝功能进行测量和急性调节，这些样本可从不同心脏部位获取，适用于从小鼠到人类的多种物种。...

利用去膜心肌细胞进行心脏功能的体外评估

本文描述了一种详细的方案，用于制备三维人源骨骼肌微组织阵列，并进行微创的下游原位功能检测，包括收缩力和钙处理分析。...

评估人类骨骼肌微组织中骨骼肌健康的各项功能指标

准确检测神经肌肉接头组分的能力对于评估病理或发育过程引起的结构改变至关重要。本文详细介绍了一种简便的方法，可用于获取高质量的全装片神经肌肉接头图像，进而进行定量测量。...

单根骨骼肌纤维的分离用于全 mounts 神经肌肉接头的免疫荧光及形态计量分析

本方案介绍了一组关于肌节、钙离子及宏观几何结构的 来自主动收缩的心室小梁的数据...

离体心脏小梁收缩过程中的明场、荧光与光学相干断层成像同步观察 Ex Vivo

可通过定量分离的肌纤维的收缩能力来评估骨骼肌功能，传统方法通常采用费力且通量较低的技术。本文介绍一种基于光学的高通量方法，用于定量水凝胶包埋肌纤维的收缩能力。该方法适用于药物筛选和治疗开发。...

基于光学系统的水凝胶包埋完整小鼠肌纤维高通量收缩力测量

我们描述了一种从成年小鼠六种肌肉中获取经酶法解离的不同长度和类型的肌纤维的方案：其中三种肌肉已有报道（趾短屈肌、趾长伸肌、比目鱼肌），另外三种则是首次成功实现解离（拇长伸肌、腓骨长肌、第四趾腓骨肌）。...

通过酶解法分离小鼠六种后肢肌肉获取完整短、中、长骨骼肌纤维：超越趾短屈肌的研究

本方案描述了从小鼠氧化型腓肠肌中分离完整单根肌纤维并建立高纯度肌母细胞培养物的方法。优化后的操作可稳定地从每只小鼠获得约300–500根完整的肌纤维，适用于后续的分子与细胞分析。...

单纤维分离检测法用于评估氧化型肌纤维行为

学习使用纳米牛顿分辨率光学力探针从骨骼肌中分离肌原纤维并测量其收缩特性。该方法可高精度评估肌节功能障碍与肌肉无力的关系，适用于心肌细胞研究。

从骨骼肌活检样本中分离肌原纤维并利用纳牛顿分辨率力传感器测定其收缩功能

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