使用基于细胞的雌激素受体对植物雌激素进行筛查β记者分析
2020年6月7日
我们优化了一种市售雌激素受体β记者检测，用于筛查人类和非人类灵长类动物的食物，以进行雌激素活性活动。我们通过显示已知的雌激素人类食物大豆注册高，而其他食物显示没有活性来验证这一分析。
我们使用这种测定来评估植物性食物是否含有植物甾醇，这会影响动物的生理过程，以及行为和繁殖成功。该测定提供了一种简单可靠的方法来确定植物是否产生具有生物活性的雌激素化合物。该方法最初是为了筛选具有异种雌激素活性的药物以用于医学应用而开发的。
例如，抑制细胞增殖。我们正在使用它来提供对灵长类动物生态学和进化的见解。在尝试此分析之前，在清洁环境中练习使用无菌技术非常重要，因为它对污染非常敏感。
首先用冻干机冷冻干燥新鲜植物，然后使用带有 0.85 毫米网孔筛的研磨机将它们精细研磨。将研磨的样品存放在避光袋中直至提取。为了提取植物中任何潜在的植物类固醇，将干燥的样品加入适当大小的烧瓶中，然后在 HPLC 级甲醇中加入。
用铝箔覆盖植物甲醇溶液，并将其设置为在轨道振荡器上以 100 RPM 旋转三天。三天后，使用滤纸将上浆倒出并倒入滴滤系统中。用旋转蒸发器干燥植物提取物，直到变稠，但可以倒入 300 毫升圆底烧瓶中。
将样品倒入 50 mL 烧瓶中，用少量甲醇冲洗大烧瓶，然后继续在小烧瓶中干燥样品，直至甲醇完全蒸发。完成后，用分析天平称量样品残留物并记录质量。将植物提取物溶于 DMSO 中，浓度为 0.1 克提取物至 2 毫升 DMSO，涡旋直至匀浆。
DMSO 本身没有毒性，但它是一种允许其他物质穿过膜的载体。由于我们不知道我们的植物是否含有有毒化学物质，因此所有植物都被视为有害化学物质。不要让溶液接触皮肤，如果被污染，请更换手套，并穿厚厚的露趾鞋和实验室外套。
将样品储存在 4 摄氏度的琥珀色玻璃瓶中，直到准备好使用。涡旋样品，然后将每个样品的 4 微升添加到 496 微升化合物筛选培养基中，以产生 0.8% DMSO 溶液。用 70% 乙醇对预热的细胞回收培养基管的外表面进行消毒，并将 10 毫升培养基转移到冷冻报告细胞管中以解冻。
关闭报告细胞管，将其置于 37 摄氏度的水浴中 5 至 10 分钟。从水浴中取出细胞后，轻轻地将试管倒置数次，以打碎细胞聚集体并产生均匀的悬浮液，然后用 70% 乙醇清洁试管表面。使用多通道移液器将 100 μL 报告细胞悬液分配到 96 孔板的每个孔中，然后将 100 μL 样品一式三份分配到适当的孔中。
将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 22 至 24 小时。在板孵育结束之前，从冰箱中取出检测底物和检测缓冲液，将它们放在弱光区域直至平衡至室温，然后轻轻倒置每个试管以混合溶液。在板孵育完成之前，将检测缓冲液的全部内容物倒入检测底物管中，以制备荧光素酶检测试剂。
轻轻混合试管，以免产生泡沫。将样品板的内容物丢弃在不合适的废液容器中，然后在干净的吸水纸巾上轻轻敲击，以去除孔中的最后一滴。向每个孔中加入 100 μL 荧光素酶检测试剂，让检测板在室温下静置 15 分钟，然后使用 96 孔板读数发光计定量发光。
对人类饮食中常见的 22 种水果和蔬菜提取物进行了雌激素化合物筛查。雌激素活性以高、中、低或无活性的顺序定性方式呈现。有机和非有机大豆的活性水平较高，而所有其他水果和蔬菜均无活性。
将大豆结果与标准曲线进行比较还表明，在此浓度下，它们具有较高的雌激素活性水平。大豆提取物是异黄酮、黄豆苷元和染料木黄酮的已知有效来源，进一步用于测定稀释度，从而产生最大 50% 信号。该提取物需要 422 倍的稀释才能产生我们标准稀释方案一半的信号。
可以送去通过质谱法鉴定出具有活性的样品进行分析，以鉴定活性化学物质。使用拮抗剂方法，我们还可以确定植物性食物是否含有降低内源性雌激素结合和活性的化学物质。这项技术使我们能够进一步了解灵长类动物饮食中雌激素食物的普遍程度，以及当分析与粪便激素分析和现场数据相结合时，植物雌激素的消耗如何影响生理学和行为。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本研究提出了一种优化的雌激素受体β报告基因检测法，用于筛选食物中的雌激素活性。该检测法通过已知的雌激素化合物进行了验证，并为灵长类动物的生态和进化方面提供了见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 生态学
背景
- 雌激素化合物可以影响动物的生理过程。
- 植物食物中的植物固醇可能影响行为和繁殖成功。
- 该检测法最初是为与外源雌激素活性相关的药物筛选开发的。
- 对污染的敏感性需要实验室中使用无菌技术。
研究目的
- 评估各种植物食物的雌激素活性。
- 提供有关灵长类生态学和进化的见解。
- 开发一种可靠的方法来检测具有生物活性的雌激素化合物。
使用的方法
- 优化商业可获得的雌激素受体β报告基因检测法。
- 筛选人类和非人类灵长类动物的食物。
- 使用已知的雌激素食物对检测法进行验证。
- 实施无菌技术以防止污染。
主要结果
- 该检测法成功地将大豆识别为高雌激素食物。
- 其他被测试的食物没有显示雌激素活性。
- 该方法被证明是简单可靠的筛选方法。
- 获得的见解有助于理解灵长类动物饮食的影响。
结论
- 优化的检测法对于筛选食物中的雌激素活性是有效的。
- 了解雌激素化合物的食物来源对灵长类动物的健康至关重要。
- 这项研究为进一步研究饮食对行为和繁殖影响开辟了途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
This assay enables early-stage target validation by providing a quantitative readout of estrogen receptor β activation, supporting mechanistic de-risking in endocrine-disruptor screening. It offers a reproducible, cell-based system for assessing ligand-dependent transcriptional activity, which aids in lead identification and predictive confidence for compounds targeting nuclear receptor pathways. The method’s stability and sensitivity facilitate integration into discovery workflows focused on hormonal modulation and pathway interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates ligand-dependent activation of estrogen receptor β to clarify mechanism of action for test compounds.
- Operational Value: Uses a stable reporter cell line that reduces variability compared to transient transfection systems.
- Predictive Value: Enables dose-response characterization to estimate relative potency and prioritize hits for follow-up.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces a luminescent signal proportional to receptor activation, enabling high-throughput compatibility.
- Reproducibility: Demonstrates consistent results across replicates when performed under aseptic, controlled conditions.
- Scalability: Adaptable to 96-well format for screening libraries of extracts or synthetic compounds.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports evaluation of endogenous and exogenous ligands in disease-relevant hormonal contexts.
- Biomarker Alignment: Luminescent output correlates with transcriptional activity, serving as a functional readout for pathway engagement.
- De-risking: Helps distinguish agonists from antagonists when combined with competitive binding assays.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, particularly for nuclear receptor modulators. It provides a functional confirmation step after initial binding or phenotypic screens, helping to triage compounds based on pathway-specific activity. The output supports go/no-go decisions by quantifying transcriptional response, which informs structure-activity relationship efforts and reduces false positives in downstream profiling.
- Discovery Biology: Confirms whether a compound acts as an agonist via estrogen receptor β-mediated transcription.
- Screening: Delivers a quantitative, luminescence-based readout suitable for screening natural product extracts or compound libraries.
- Analytics: Generates dose-response data that can be compared to reference agonists like estradiol or genistein.
- Translational Research: Connects in vitro activity to physiological relevance when paired with hormonal or behavioral readouts in model systems.
- Enterprise Reuse: The stable cell line can be banked and reused across projects, reducing redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into nuclear receptor activation, reducing ambiguity in compound profiling.
- Operational Value: Eliminates need for repeated transfection, improving assay consistency and throughput.
- Strategic Value: Supports early identification of endocrine-active compounds, enabling proactive risk assessment.
- Portfolio Impact: Informs prioritization of scaffolds with desired receptor selectivity or activity profile.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, aseptic technique, and luciferase-based detection.
- Depends on access to a luminometer and reagent preparation for luminescence detection.
- Necessitates standardization of DMSO vehicle controls and incubation times across runs.
- Must account for compound solubility and cytotoxicity when screening at higher concentrations.
- Limited to detecting agonist activity; antagonist effects require orthogonal methods.
