Name: 骨关节炎模型中骨髓、骨髓、淋巴结和合成组织内免疫细胞子集的流动细胞测量分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: 了解流式细胞术分析骨关节炎模型小鼠骨髓、淋巴结和滑膜组织中单核细胞、巨噬细胞及T细胞亚群的方法。该技术可精确鉴定免疫细胞并表征骨关节炎免疫反应。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Andrew Lim博士和Giles Best博士在流式细胞仪设置过程中提供的帮助。本项目由德国研究基金会（DFG）（DFG-HA 8481/1-1）资助，授予PH。

本方案中提及的所有操作均已获得北悉尼地方卫生区动物伦理委员会批准。小鼠的饲养和护理均遵循澳大利亚国家卫生与医学研究委员会2010年修订版《实验动物护理与使用指南》。所有实验均使用10至12周龄的雄性C57BL/6小鼠。
注意：为了诱导创伤后骨关节炎，对右侧膝关节进行内侧半月板手术去稳定化（DMM）。有关该动物模型的详细信息已由 Glasson 等人发表18。简言之，使用异氟烷在诱导室中诱导全身麻醉，随后通过鼻罩维持麻醉。用剃须刀片剃除手术侧肢体的毛发，并用乙醇清洗和擦拭手术区域，以尽量减少污染。随后将动物转移至手术显微镜下，置于无菌毛巾上，并用无菌纸巾覆盖肢体，以隔离手术区域并减少污染。在显微镜下，做一条长约 0.5 cm 的髌骨旁内侧关节切口，将髌骨向外脱位，抬起髌下脂肪垫以暴露内侧半月板胫骨韧带，并使用解剖镊将其横断。关节腔用无菌生理盐水冲洗以清除血液，伤口则分三层闭合——关节囊、皮下组织（使用缝合材料）和皮肤（使用外科组织胶）。然而，本方案中描述的方法也可应用于其他诱导骨关节炎的模型和方法。骨关节炎可诱导于动物的任一侧，而在采集组织时，重要的是要采集同侧（引流）淋巴结。
1. 脾脏、对侧骨髓、同侧引流膝关节的淋巴结及滑膜组织的分离
<ol>
	<li>通过颈椎脱位处死小鼠。将小鼠仰卧置于解剖显微镜下，用70%乙醇擦拭胸部、腹部和腿部。使用直剪刀沿腹部中线小心切开皮肤，长度适中，保持腹腔完整。</li>
	<li>轻轻将动物右侧皮肤从下方肌肉组织上拉开，使皮下脂肪组织保留在皮肤上。通常仅需轻柔牵拉即可使皮肤及皮下脂肪组织与肌肉分离。若存在零星粘连，应用精细剪刀剪开，以尽量减少分离组织所需张力，并降低损伤淋巴结的风险。使用两把弯头精细镊子轻轻分离大腿部位的脂肪组织，寻找三条血管交汇处。腹股沟淋巴结位于该交汇点，可通过其卵圆形形状及略深的颜色进行识别。</li>
	<li>使用精细解剖镊取出腹股沟淋巴结，注意避免破裂包膜。用镊子清除淋巴结表面残留的脂肪组织。</li>
	<li>打开腹腔并识别脾脏。用精细剪刀切除脾脏。轻轻拨开肠道以暴露腹主动脉及其分叉处，操作时注意避免损伤，以最大限度减少污染风险。&#160;髂淋巴结位于腹主动脉末端及髂总动脉起始处。取出右侧髂淋巴结，并按步骤1.3所述进行后续操作。</li>
	<li>轻轻去除双侧后肢皮肤。用刀片和精细剪刀清理左侧股骨上的肌肉组织，进行解剖。小心分离膝关节和髋关节，保持整根骨骼完整，随后取出股骨。</li>
	<li>识别右侧膝关节的髌腱，然后使用精细剪刀去除其近端相邻的肌肉组织，直至暴露髌骨近端约5 mm的股四头肌腱。随后，在髌骨近端约3–4 mm处切断股四头肌腱，形成一个操作手柄，并用精细镊子轻轻将其从关节处拉起。此时可清晰看到关节囊在股骨上的附着边缘，使用手术刀片从股骨侧开始，沿关节囊两侧边缘小心切割，向胫骨方向推进，以最大程度获取滑膜组织。切割过程中应持续对股四头肌腱施加轻柔牵拉；当滑膜组织块仅与胫骨相连时，应暂停操作。此时髌骨远端的关节内脂肪垫已清晰可见，可用刀片轻轻将其从关节及半月板前部分离。随后，沿关节囊剩余部分（胫骨侧）切割，完整取下滑膜组织块。 
	注意：此步骤必须精确操作，以确保结果可靠。解剖完成后，“滑膜组织块”应包含髌骨、髌腱、髌下脂肪垫、髌上及髌下滑膜隐窝的滑膜衬里，以及位于副韧带前方的相关关节囊。解剖过程中应持续使用0.9%生理盐水保持所有组织湿润。 
	注意：将每份滑膜组织块样本分别放入已标记的24孔板中的独立孔内，每孔含1.5 ml RPMI 1640培养基。将髂淋巴结与腹股沟淋巴结合并置于同一孔中，并将两只小鼠的组织合并为一组。&#160;</li>
</ol>
2. 从每种组织制备单细胞悬液
注意：为确保流式分析所需的足够细胞数量，需要合并两只小鼠的滑膜组织。在本方案中，为保持一致性，需将同两只小鼠的所有组织合并处理。此外，每只小鼠的髂淋巴结和腹股沟淋巴结合并收集，使每个样本总共获得4个淋巴结。通常情况下，单只动物的脾脏、骨髓和淋巴结中的细胞数量足以进行流式分析，可直接应用本方案。然而，当仅使用单只动物的组织时，可能需要调整裂解时间。
<ol>
	<li>脾脏
	<ol>
		<li>将两个合并的脾脏置于置于15 mL离心管上方的70 µm细胞筛网上。使用无菌3 mL注射器活塞轻轻将脾脏组织碾压通过筛网滤膜。用总共6 mL添加了10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基频繁冲洗筛网。</li>
		<li>离心细胞（500 × g，5分钟，室温），弃上清，将沉淀重悬于5 mL红细胞（RBC）裂解缓冲液中。室温孵育5分钟，然后加入10 mL PBS稀释裂解液以终止反应。离心细胞（500 × g，5分钟，室温），重复此步骤一次或直至沉淀中无残留红细胞。 
		注意：两次裂解之间，使用30 µm细胞筛网将悬液过滤至新的15 mL离心管中，以去除凝集的细胞。</li>
		<li>裂解完成后，离心细胞（500 × g，5分钟，室温），弃上清，将沉淀重悬于1 mL PBS中。使用台盼蓝染色排除法，在血细胞计数板上计数活细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>淋巴结
	<ol>
		<li>将四个合并的淋巴结置于置于15 mL离心管上方的70 µm细胞筛网上。使用无菌3 mL注射器活塞轻轻按压，将淋巴结研磨成单细胞悬液。用总共6 mL含10% FBS的RPMI培养基频繁冲洗筛网。</li>
		<li>离心细胞（500 × g，5分钟，室温），弃上清，将沉淀重悬于500 µL PBS中。使用30 µm细胞筛网将悬液过滤至新的15 mL离心管中，以去除凝集的细胞。使用台盼蓝染色排除法，在血细胞计数板上计数活细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>骨髓
	<ol>
		<li>使用组织镊小心夹住完整股骨，避免将其折断。用锋利的剪刀剪去股骨近端的末端，以便冲洗骨髓。将股骨翻转，将23 G针头置于股骨髁间切迹的中央。在轻柔施加压力的同时，用拇指和食指旋转针头，以在髁间切迹处钻孔进入骨髓腔。 
		注意：钻孔后有时骨碎片会堵塞针头，为避免冲洗时产生不必要的高压，建议在冲洗前更换针头。</li>
		<li>使用装有23 G针头的10 mL注射器，将6 mL含10% FBS的RPMI培养基（或冲洗至液体变白为止）注入置于15 mL离心管上方的70 µm细胞筛网中冲洗骨髓。用3 mL注射器的活塞轻轻将骨髓组织压过筛网，并用另外3 mL RPMI冲洗筛网。 
		注意：当所有骨髓完全冲洗出后，骨骼应呈现白色。</li>
		<li>离心细胞（500 × g，5分钟，室温），将沉淀重悬于5 mL红细胞裂解缓冲液中。室温孵育5分钟，然后加入10 mL PBS稀释裂解液以终止反应。</li>
		<li>离心细胞（500 × g，5分钟，室温），弃上清，将沉淀重悬于1 mL PBS中。使用30 µm细胞筛网将悬液过滤至新的15 mL离心管中，以去除凝集的细胞。使用台盼蓝染色排除法，在血细胞计数板上计数活细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>滑膜组织
	<ol>
		<li>用精细的手术剪将两个滑膜组织块切成微小碎片。将样品连同培养基转移至15 mL离心管中。用额外0.5 mL RPMI冲洗原孔，以收集残留的细胞和滑膜组织，转移至离心管中（最终体积2 mL）。 
		提示：此步骤中建议使用移液器，并将吸头末端直径扩大部分剪去。</li>
		<li>根据制造商说明重悬酶并分装（例如Liberase）。加入足量酶，使终浓度为1单位/mL（每样品共2单位）。使用MACS旋转仪在37 °C下消化2小时。</li>
		<li>加入8 mL含10% FBS的RPMI终止消化反应，并将细胞悬液通过70 µm细胞筛网过滤至新的15 mL离心管中。用另外5 mL含10% FCS的RPMI培养基冲洗原15 mL离心管，并将冲洗液通过同一筛网过滤至新管中（最终体积15 mL）。</li>
		<li>离心细胞（500 × g，10分钟，室温），弃上清，将沉淀重悬于500 µL PBS中。使用台盼蓝染色排除法，在血细胞计数板上计数活细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞分配
<ol>
	<li>用组织类型、动物编号和指定的抗体组合标记两个96孔板（U型底）。本方案中总共使用两种抗体组合：单核细胞亚群组合（细胞外染色）和T细胞亚群组合（细胞外和细胞内染色）。</li>
	<li>使用相应的单细胞悬液，每孔加入5 × 105个细胞。 
	注意：在设置实验时，应评估每组和每种组织类型预期的细胞绝对数量（经处理的动物组织中细胞数量高于对照动物）。在制备单细胞悬液的最后一步重悬细胞沉淀时，应选择适量的PBS，使最终浓度为每200 µL含5 × 105个细胞。此处使用的96孔板最大容量为300 µL，通常200 µL为理想体积，可最大限度降低因液体溢出导致交叉污染的风险。</li>
	<li>针对每种抗体组合和组织类型，将至少5 × 105个细胞分配至已明确标记的孔中作为未染色对照。</li>
</ol>
4. 单核细胞亚群检测面板
<ol>
	<li>进行活率染色：使用板式离心机以500 × g 离心5分钟（4 °C）收集细胞，并用200 µL 1× PBS洗涤细胞一次。将细胞不可渗透的胺反应性染料（活率染料）用1× PBS按1:50稀释，配制染色工作液。随后，用100 µL该工作液重悬细胞沉淀，使每孔中活率染料的终体积为2 µL。在4 °C避光孵育15分钟。 
	注意：所需活率染料的最佳用量应通过剂量滴定曲线确定。此外，稀释后的活率染料工作液应在配制当天使用，不可保存。有关活率染料的复溶、稀释和储存方法，请参考生产商说明书。</li>
	<li>在孵育期间，将抗体混合物按适当体积加入FACS缓冲液（含0.1% BSA和0.02%叠氮化钠的无Ca²⁺和Mg²⁺ PBS）中配制。用200 µL FACS缓冲液洗涤细胞两次，以500 × g 离心5分钟（4 °C），然后每管细胞沉淀用100 µL抗体混合液或相应的对照混合液重悬。在4 °C避光孵育30分钟。 
	注意：请注意叠氮化钠对细胞具有毒性。本方案中FACS缓冲液内的叠氮化钠浓度极低（0.02%），且染色后样本立即上机检测，因此不会造成问题。若计划对分选后的细胞进行后续功能性实验，建议每日新鲜配制FACS缓冲液，并避免使用叠氮化钠。当同时使用多种抗体时，建议在抗体混合液中加入适量“Brilliant Stain Buffer”以提高染色效果。</li>
	<li>用200 µL FACS缓冲液洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于250 µL FACS + EDTA缓冲液（含1 mM EDTA的FACS缓冲液）中。将样本转移至标记好的FACS管中。样本在上机前应保持在4 °C并避光保存。 
	注意：免疫细胞容易发生黏附。为最大限度降低堵塞风险和双联体数量，建议在最终的流式缓冲液中添加1 mM EDTA。</li>
</ol>
5. T细胞亚群检测面板
<ol>
	<li>进行活率染色：使用板式离心机将细胞离心（500 × g，5 分钟，4 °C），并用 200 µL 1× PBS 洗涤细胞一次。将细胞膜不渗透性胺反应性染料（活率染料）用 1× PBS 按 1:50 稀释，配制染色工作液。随后，用 100 µL 该工作液重悬细胞沉淀，使每孔中活率染料的终体积为 2 µL。在 4 °C 避光孵育 15 分钟。</li>
	<li>在样本孵育期间，用适量 1× FACS 缓冲液配制细胞外染色抗体混合液。用 200 µL 1× FACS 缓冲液洗涤细胞两次，离心（500 × g，5 分钟，4 °C），然后每管沉淀用 100 µL 抗体混合液或相应的对照混合液重悬。在 4 °C 避光孵育 30 分钟。</li>
	<li>使用固定和通透试剂盒按照制造商说明书进行细胞内染色。用 200 µL 1× FACS 缓冲液洗涤细胞两次，重悬于 200 µL 固定缓冲液中。在 4 °C 避光孵育 40 分钟。</li>
	<li>在孵育过程中，用适量 1× 通透与洗涤缓冲液配制细胞内染色抗体混合液。将细胞以 750 × g 离心（5 分钟，4 °C）收集，并用 200 µL 1× 通透/洗涤缓冲液洗涤两次。 
	注意：固定和通透处理后的细胞较难完全沉淀。为尽量减少后续洗涤步骤中的细胞损失，建议将离心力提高至 750 × g。也可选择延长离心时间，但这将显著增加细胞处理的总时长。</li>
	<li>将细胞离心（750 × g，5 分钟，4 °C），每管沉淀用 100 µL 抗体混合液或相应的对照混合液重悬。在 4 °C 避光孵育 40 分钟。</li>
	<li>用 200 µL 1× 通透/洗涤缓冲液洗涤细胞两次，将细胞重悬于 250 µL FACS + EDTA 缓冲液中。将样本转移至标记好的流式管中。样本在上机前应保持在 4 °C 并避光保存。 
	注意：每种抗体的最佳浓度需通过梯度稀释实验确定。不同抗体的最适浓度差异显著：CD3 和 CD80 使用 1:1 的稀释比例，而 CD11b 和 CD4 使用 1:6400 的稀释比例。进行抗体浓度滴定时，应使用与正式实验相同数量的细胞。</li>
</ol>
6. 补偿、适当的对照和设门
<ol>
	<li>实验设置
	<ol>
		<li>在确定最佳抗体浓度后，运行未染色对照和单染对照以进行补偿，校正光谱重叠。 
		注：细胞和补偿微珠均需进行所有补偿对照实验。选择能产生最强信号（阳性事件的最高MFI值）的条件用于补偿。MFI代表平均荧光强度，常用于描述和定义所产生信号的平均强度，从而反映抗体表达水平。</li>
		<li>开始新的多色实验时，应运行荧光减一（FMO）对照和同型对照。有关FMO的更多细节此前已有发表19。</li>
		<li>确定前向散射面积（FSC-A）电压和侧向散射面积（SSC-A）电压的最佳值，以便在每种组织类型的未染色对照中检测白细胞群。 
		注：固定和透化过程会改变细胞的尺寸。因此，单核细胞亚群检测 panel 与T细胞亚群检测 panel 的FSC-A和SSC-A电压差异较大。为确定T细胞亚群 panel 的最佳电压，可使用CD3单染细胞，并在调整FSC-A和SSC-A值的同时反向设门，回归至白细胞群。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设门策略
	<ol>
		<li>在确定最佳FSC-A和SSC-A电压后，对白细胞群设置初始门控。 
		注：每次实验前，应按照制造商说明使用校准微珠对流式细胞仪进行校准，并运行未染色微珠对照。不同时间点的白细胞群应具有相似的FSC和SSC特性（不同组织类型之间存在轻微差异属正常现象）。若FSC和SSC出现显著差异，需对流式细胞仪和样本制备过程进行故障排查。</li>
		<li>排除双联体：绘制FSC-A（y轴）与FSC-H（x轴）散点图。单细胞呈对角线分布，对该区域设门以选择单细胞。</li>
		<li>排除死细胞：绘制FVS510（活性染料）（x轴）与FSC-A（y轴）散点图。死细胞表现为阳性信号，因此应对活细胞设门。 
		注：真实阴性细胞可在未染色对照中观察到。因此，在运行染色样本前，应根据未染色对照为每组样本调整此门控。后续设门策略取决于所使用的抗体 panel 及目标细胞类型。本方案中各 panel 的具体设门策略分别见图1和图4。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology%2C+treatment%2C+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).</li>
<li>Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+in+Osteoarthritis%3A+Alterations+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond.</a> Frontiers in Immunology. 8, 356(2017).</li>
<li>Woolf, A. D., Pfleger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+major+musculoskeletal+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Burden of major musculoskeletal conditions.</a> Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).</li>
<li>Little, C. B., Hunter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-traumatic+osteoarthritis%3A+from+mouse+models+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials.</a> Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).</li>
<li>Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+post-traumatic+OA+with+a+view+to+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research%3A+Clinical+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention.</a> Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).</li>
<li>Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+knee+injuries+and+knee+osteoarthritis%3A+a+meta-analysis+of+observational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).</li>
<li>Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+subsets+in+osteoarthritis+versus+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Egyptian+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis.</a> Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).</li>
<li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+accumulation+of+activated+Th1+cells+not+only+in+rheumatoid+arthritis+but+also+in+osteoarthritis+joints%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints.</a> Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).</li>
<li>Sakkas, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+and+T-cell+cytokine+transcripts+in+the+synovial+membrane+in+patients+with+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+and+Diagnostics+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis.</a> Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).</li>
<li>Guo, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+CD%284%29%28%2B%29+CD%282%29%285%29%28%2B%29+Foxp%283%29%28%2B%29+Treg+with+the+recovery+of+joint+function+after+total+knee+replacement+in+rats+with+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Research%22%5BJournal%5D)">Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis.</a> Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).</li>
<li>Moradi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29%2FhighCD127low%2F%28-%29+regulatory+T+cells+are+enriched+in+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis+joints--analysis+of+frequency+and+phenotype+in+synovial+membrane%2C+synovial+fluid+and+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood.</a> Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97(2014).</li>
<li>Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cellular+infiltrate+in+inflammatory+synovia+of+osteoarthritic+knees%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+macrophage+M1+polarisation+exacerbates+experimental+osteoarthritis+partially+through+R-spondin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).</li>
<li>Culemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+renewing+resident+synovial+macrophages+provide+a+protective+barrier+for+the+joint%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint.</a> Nature. 572, 670-675 (2019).</li>
<li>Mocellin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+immune+cell+density+and+cytokine+gene+profile+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).</li>
<li>Ward, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+markers+for+the+rodent+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical markers for the rodent immune system.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).</li>
<li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology%2C+treatment%2C+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).</li>
<li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+%28DMM%29+model+of+osteoarthritis+in+the+129%2FSvEv+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li>
<li>Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Staining+and+Flow+Cytometry+to+Identify+Lymphocyte+Subsets+within+Murine+Aorta%2C+Kidney+and+Lymph+Nodes+in+a+Model+of+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55266(2017).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Protocol+for+the+Comprehensive+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+in+Normal+and+Inflamed+Murine+Non-Lymphoid+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).</li>
<li>Lorenz, J., Grassel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+osteoarthritis+models+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental osteoarthritis models in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).</li>
<li>Christiansen, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+mouse+models+of+post-traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+alteration+of+lymphatic+vessels+in+knee+joints+of+normal+and+osteoarthritic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice.</a> Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).</li>
<li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+mapping+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Lymph node mapping in the mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+culture+and+isolation+of+murine+synovial+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Reports%22%5BJournal%5D)">A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts.</a> Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).</li>
<li>Belluzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Infrapatellar+Fat+Pad+and+Synovial+Membrane+to+Knee+Osteoarthritis+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain.</a> BioMed Research International. 2019, 18(2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案中描述的方法经过设计和验证，可稳定地从小鼠骨关节炎（OA）模型的脾脏、骨髓、淋巴结以及滑膜组织中鉴定出单核细胞/巨噬细胞和T细胞的多种亚群。当前方案可通过更换抗体以适应不同类型组织或其他细胞的研究，并可用于其他小鼠骨关节炎模型。在检测其他类型组织时，必须验证每种抗体的特异性，因为免疫细胞表面标志物的表达在不同组织中存在差异20。此外，在更换抗体时，需进行剂量滴定实验以确定抗体的最佳浓度，同时需重复补偿过程，以校正光谱重叠发生的变化。
在本实验方案中，采用DMM小鼠模型诱导骨关节炎（OA）18。目前最常用且已确立的动物模型为小鼠模型，因为该物种在研究创伤后骨关节炎病理生理学方面具有多重优势17。特别是在小鼠中，已有报道描述了手术性和非手术性OA模型17：其中最常见的分别为内侧半月板失稳术（DMM）、前交叉韧带切断术（ACLT）和非手术性前交叉韧带断裂（ACLR）<sup class="xr...

骨关节炎（OA）是一种致残性且伴有疼痛的疾病，涉及关节相关所有组织的多种病理变化1影响全球约3.8%的人口2，骨关节炎是最常见的肌肉骨骼系统疾病之一，且将成为第四th 2020年全球致残的主要原因3创伤后骨关节炎发生在关节损伤之后，占所有骨关节炎病例的至少12%，在膝关节等易感关节中可高达25%4,5此外，关节损伤使骨关节炎的终生风险增加五倍以上6并非所有表现出明显不稳定性的损伤都会发展为骨关节炎（OA），因此确定导致长期OA风险的因素仍然具有挑战性。为了开发有效的治疗手段以预防和/或治疗创伤后骨关节炎，深入研究并更清晰地界定易感OA的损伤特异性病理、病因及机制至关重要。1.
骨关节炎（OA）及其特征性的软骨破坏曾被认为完全由机械应力所致，因此OA被视为一种非炎症性疾病2。然而，近期研究表明，与健康对照者相比，OA患者滑膜组织中存在炎症细胞浸润，且滑膜组织内的炎症细胞数量增加2，提示炎症成分可能在OA的发生发展中起驱动作用。进一步研究显示，适应性免疫系统中的CD4+和CD8+ T细胞谱系异常，以及先天免疫系统中的单核细胞/巨噬细胞异常，可能参与OA的发病机制2,7。对这些异常的深入研究揭示了多种T细胞亚群的重要作用2，例如Th18、Th29、Th178以及调节性T细胞（Treg）群体10,11。尽管存在这些有力证据，T细胞反应改变与OA的发生及进展之间的因果关系仍不明确2。
除了特定T细胞在骨关节炎（OA）中发挥作用外，近期研究表明，不同极化/活化的巨噬细胞可能也与OA的发病机制相关12。特别是，在OA发展过程中，来源于血液单核细胞的巨噬细胞在滑膜中聚集，并极化为经典活化的巨噬细胞（M1）或替代性活化的巨噬细胞（M2），提示单核细胞来源的巨噬细胞与OA之间存在关联13。相比之下，某些巨噬细胞亚群在发育早期即定植于器官中，并以单核细胞非依赖的方式自我维持其数量14。最近研究发现，这些滑膜组织驻留巨噬细胞（STRMs）可通过紧密连接屏障发挥关节保护作用14。这些发现表明，特定巨噬细胞亚群的异常可能在OA的发展过程中起关键作用。然而，这种炎症性细胞反应与创伤后关节结构变化之间的相互作用仍不清楚。
传统上，对滑膜组织中免疫细胞的分析局限于免疫组织化学（IHC）或通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测mRNA表达水平15,16。然而，IHC和RT-PCR均无法同时鉴定多种不同类型的细胞及其亚群，从而限制了这些方法的应用范围。此外，IHC仅适用于小量组织样本的分析，可能遗漏局灶性炎症细胞聚集区域。近年来，针对多种细胞类型的大量表面标志物已被开发出来，现在可通过这些标志物的独特组合可靠地鉴定免疫细胞亚群。随着技术的持续进步，流式细胞仪现已能够同时识别多种不同的荧光染料，从而实现对大型多色抗体组合的分析。
流式细胞术为研究人员提供了一种强大的技术，能够在单细胞水平上同时鉴定和定量多种免疫细胞及其亚群。我们已建立并优化了两种检测方法：一种是细胞外染色法，用于鉴定小鼠脾脏、骨髓、淋巴结和滑膜组织中的单核细胞/巨噬细胞及其亚群；另一种是细胞外/细胞内染色法，用于鉴定T细胞及其亚群。本方案的每一步均经过优化和验证，最终形成了一种高度可重复的检测方法，可用于其他手术性和非手术性骨关节炎小鼠模型17。

<table><tbody><tr><td>APC 抗小鼠 CD194 (CCR4)</td><td>BioLegend</td><td>131212</td><td>T 细胞检测组合</td></tr><tr><td>Brilliant Stain Buffer Plus 1000 次检测</td><td>BD</td><td>566385</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>可固定活力染料 510，100 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>564406</td><td>T 细胞检测组合</td></tr><tr><td>可固定活力染料 510，100 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>564406</td><td>单核细胞检测组合</td></tr><tr><td>Liberase，研究级</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td>滑膜组织消化用酶</td></tr><tr><td>小鼠 CD11b APC-R700 M1/70，100 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>564985</td><td>单核细胞检测组合</td></tr><tr><td>小鼠 CD11C PE-CF594 HL3，100 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>562454</td><td>单核细胞检测组合</td></tr><tr><td>小鼠 CD183 BB700 CXCR3-173，50 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>742274</td><td>T 细胞检测组合</td></tr><tr><td>小鼠 CD206 Alexa 647 MR5D3，25 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>565250</td><td>单核细胞检测组合</td></tr><tr><td>小鼠 CD25 BV605 PC61，50 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>563061</td><td>T 细胞检测组合</td></tr><tr><td>小鼠 CD3e APC-Cy7 145-2C11，100 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>557596</td><td>T 细胞检测组合</td></tr><tr><td>小鼠 CD4 PE-Cy7 RM4-5，100 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>552775</td><td>T 细胞检测组合</td></tr><tr><td>小鼠 CD44 APC-R700 IM7，50 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>565480</td><td>T 细胞检测组合</td></tr><tr><td>小鼠 CD62L BB515 MEL-14，100 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>565261</td><td>T 细胞检测组合</td></tr><tr><td>小鼠 CD69 BV711 H1.2F3，50 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>740664</td><td>T 细胞检测组合</td></tr><tr><td>小鼠 CD80 BV650 16-10A1，50 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>563687</td><td>单核细胞检测组合</td></tr><tr><td>小鼠 CD8a BV786 53-6.7，50 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>563332</td><td>T 细胞检测组合</td></tr><tr><td>小鼠 F4/80 BV421 T45-2342，50 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>565411</td><td>单核细胞检测组合</td></tr><tr><td>小鼠 Foxp3 PE MF23，100 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>560408</td><td>T 细胞检测组合</td></tr><tr><td>小鼠 I-A I-E BV711 M5/114.15.2，50 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>563414</td><td>单核细胞检测组合</td></tr><tr><td>小鼠 Ly-6C PE-Cy7 AL-21，50 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>560593</td><td>单核细胞检测组合</td></tr><tr><td>小鼠 Ly-6G APC-Cy7 1A8，50 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>560600</td><td>单核细胞检测组合</td></tr><tr><td>小鼠 NK1.1 BV650 PK136，50 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>564143</td><td>T 细胞检测组合</td></tr><tr><td>小鼠 ROR Gamma T BV421 Q31-378，50 &amp;micro;g</td><td>BD</td><td>562894</td><td>T 细胞检测组合</td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>转录因子缓冲液套装，100 次检测</td><td>BD</td><td>562574</td><td>缓冲液</td></tr></tbody></table>

骨关节炎模型中经由流式细胞术分析小鼠脾脏、骨髓、淋巴结及滑膜组织内的免疫细胞亚群

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

骨关节炎（OA）是最常见的肌肉骨骼系统疾病之一，影响着众多遭受疼痛和身体功能受限的患者。近期研究表明，该疾病可能存在炎症成分，其中T细胞和单核细胞/巨噬细胞可能与OA的发病机制相关。进一步的研究提出，两类炎症细胞谱系中的特定亚群可能发挥重要作用，例如Th1、Th2、Th17和调节性T淋巴细胞，以及M1、M2和滑膜组织常驻巨噬细胞。然而，局部滑膜和全身性炎症细胞反应与关节结构改变之间的相互作用尚不清楚。为了全面理解T细胞和单核细胞/巨噬细胞在OA中的作用，重要的是能够同时在滑膜组织、次级淋巴器官以及全身系统（脾脏和骨髓）中定量鉴定这些细胞及其亚群。如今，可通过细胞表面标志物的组合来识别不同的炎症细胞亚群，使得多色流式细胞术成为研究这些细胞过程的有力技术。在本实验方案中，我们详细描述了获取滑膜组织和次级淋巴器官以及制备单细胞悬液的具体步骤。此外，我们展示了用于鉴定单核细胞/巨噬细胞及其亚群的细胞外染色实验，以及用于鉴定小鼠脾脏、骨髓、淋巴结和滑膜组织中T细胞及其亚群的细胞外与细胞内染色实验。本方案的每一步均经过优化和验证，最终建立了一种高度可重复的实验方法，可用于其他手术性和非手术性OA小鼠模型的研究。

下文描述了单核细胞亚群检测 panel 和 T 细胞亚群检测 panel 的代表性结果。
图1展示了从DMM处理动物的骨髓中获取的免疫细胞单核细胞亚群 panel 的分层设门策略。该策略已在所有其他组织类型中使用并验证。实验设置时，需针对每种组织类型确定前向散射面积（FSC-A）和侧向散射面积（SSC-A）的电压，以识别单核细胞/巨噬细胞，并排除T细胞和碎片（G1）。每次实验过程中均需分析每种组织类型的未染色对照样本，并在必要时调整FSC-A和SSC-A电压。若参数未发生显著变化，电压应随时间保持相近；若参数发生剧烈变化，则可能提示流式细胞仪发生堵塞。此外，未染色对照还用于确定死/活染料的真实阴性信号，每次实验时均据此相应调整设门（图2A）。实验设计时应谨慎选择荧光染料，通常将低表达的表面标志物与高亮度荧光染料配对（例如，本实验中CD206使用了Alexa Fluor 647）。目前存在多种可在不同波长下检测的死/活染料；本实验中使用的是FVS510。
<...

本文介绍了一种详细且可重复的流式细胞术方案，利用已建立的小鼠骨关节炎手术模型，通过胞外和胞内染色实验，鉴定小鼠脾脏、骨髓、淋巴结及滑膜组织中的单核细胞/巨噬细胞和T细胞亚群。

骨关节炎（OA）是最常见的肌肉骨骼疾病之一，影响着许多遭受疼痛和身体功能受限的患者。近年来……

本方案可实现对神经元、滑膜及免疫系统其他各种组织中的单核细胞、巨噬细胞、T细胞及其相关亚群的详细鉴定与分析。本技术有助于从滑膜及其他相关组织中可靠地获取活免疫细胞，从而对骨关节炎的免疫应答进行全面表征。为从骨关节炎模型小鼠中分离目标组织，将小鼠置于仰卧位，用70%乙醇擦拭其胸部、腹部和腿部。使用剪刀沿腹部中线小心切开皮肤，同时保持腹腔完整。轻轻将动物右侧的皮肤从下方肌肉上拉开，使皮下脂肪组织仍附着在皮肤上。将小鼠置于解剖显微镜下，用两把弯头精细镊子轻轻分离位于大腿处的脂肪组织。确定三条交叉血管后，使用精细解剖镊子小心摘除位于血管交汇处的腹股沟淋巴结，注意不要破坏包膜。用镊子清除淋巴结表面残留的脂肪组织，并打开腹腔。若未见残留脂肪组织，立即将淋巴结置于预先准备并标记好的六孔板中，每孔加入0.5毫升RPMI培养基。随后，打开腹腔。使用精细剪刀切除脾脏，并轻柔地移出肠道以暴露主动脉及其分叉处。随后，立即将脾脏置于预先准备并标记好的六孔板中，每孔加入0.5毫升RPMI培养基。取出位于腹主动脉末端和髂总动脉起始处的髂淋巴结，并仔细剥离后肢两侧的皮肤。立即将淋巴结放入预先准备并标记好的六孔板中，每孔加入0.5毫升RPMI培养基，将两只动物的淋巴结合并于同一孔中。使用精细剪刀或解剖刀清除左侧股骨附着的肌肉组织，并小心分离膝关节和髋关节，保留完整骨骼的同时取出股骨。然后将股骨放入预先准备并标记好的六孔板中，每孔加入0.5毫升RPMI培养基。辨认右侧膝关节的髌腱，使用精细剪刀去除关节近端附着的肌肉组织，直至暴露出髌骨近端约五毫米的股四头肌腱。在髌骨近端约3至4毫米处切断股四头肌腱，形成一个手柄，用精细镊子轻轻牵拉，使关节处的张力松解，从而暴露关节囊附着处的边缘。从股骨开始，向胫骨方向操作，使用手术刀在维持股四头肌腱轻柔牵引的同时，沿关节囊两侧边缘仔细切开。当滑膜组织块仅与胫骨相连时，应清晰可见髌骨远端的关节内脂肪垫，可将其从关节及Minsky前部轻柔分离。随后，沿剩余的关节囊部分进行切割，以完整移除滑膜组织块，并立即将其置于预先准备并标记好的六孔板中，每孔加入1.5毫升RPMI培养基。当所有组织收集完毕后，将每种条件下两份合并的脾脏置于15毫升离心管中的70微米细胞筛网上，用无菌的3毫升注射器活塞轻轻研磨组织，使细胞通过滤网，并频繁用总共6毫升添加了10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基冲洗筛网。通过离心沉淀细胞，然后将细胞沉淀重悬于5毫升红细胞裂解缓冲液中。5分钟后，加入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）终止反应，并对细胞进行离心。 当观察不到红细胞时，将沉淀重悬于1毫升新鲜PBS中用于计数。对于淋巴结处理，将全部四个淋巴结置于新的15毫升离心管中的70微米细胞筛网上，使用新的无菌3毫升注射器活塞轻轻挤压淋巴结，使其通过筛网形成单细胞悬液，然后以500 × g离心5分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于500微升PBS中用于计数。为分离骨髓，使用组织镊小心夹住完整的股骨，并用锋利的剪刀剪除股骨近端末端。 将23号针头插入股骨髁间切迹中部，在施加轻柔压力的同时旋转针头，以在切迹处钻出一个孔。根据需要更换针头，用6毫升添加了10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基冲洗骨组织内容物，使其流入置于新15毫升离心管上的70微米细胞筛网中，并使用新的3毫升注射器活塞轻轻将骨髓细胞压过筛网。此后，红细胞裂解步骤参照脾脏处理方法进行。当观察不到红细胞时，将沉淀重悬于1毫升新鲜PBS中用于计数。处理滑膜组织时，使用精细手术剪将两块滑膜组织剪成微小碎片，并将样品转移至新的15毫升离心管中。用500微升培养基冲洗收集容器，以回收任何残留的细胞和滑膜组织，并将洗涤液吸入样品收集管中。接下来，加入足量的酶，使终浓度达到每毫升1个单位，并将滑膜组织样本置于37摄氏度的摇床培养箱中消化2小时。将离心管放入摇床时，应确保充分振荡。消化结束后，加入8毫升添加了10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基终止消化反应，并将细胞悬液通过70微米细胞滤网过滤至新的15毫升离心管中。用 5 毫升培养基冲洗旧的 15 毫升离心管，并用此液体洗涤滤膜。然后，通过离心沉淀细胞，并将沉淀重悬于 500 µL PBS 中用于细胞计数。为了对分离的免疫细胞进行活力染色，将每种细胞悬液中的 5 × 10⁵ 个细胞加入两个不同的 96 孔圆底板的相应孔中，并将细胞离心至各孔底部。始终为每种组织类型的细胞设置足够数量的未染色细胞作为阴性对照。用 200 µL PBS 洗涤细胞，然后在避光条件下，于 4°C 孵育 15 分钟，每孔加入 100 µL 细胞及通透性胺反应性染料。孵育结束后，每次用 200 µL FACS 缓冲液洗涤细胞，共洗涤两次，然后将每份细胞沉淀重悬于 100 µL 相应的目标抗体或对照抗体混合液中。如果同时进行细胞内和细胞外染色，请现在执行细胞外染色步骤。在4°C避光孵育30分钟后，每孔用200微升FACS缓冲液洗涤细胞两次，并将细胞及单核细胞亚群检测板重悬于250微升含有1毫摩尔EDTA的FACS缓冲液中。此步骤仅在不进行细胞内染色时执行；否则，请继续进行本方案的细胞内染色部分。然后，将每种单核细胞亚群样本转移至相应的预冷避光 FACS 管中。对于 T 细胞亚群 panel 细胞的胞内染色，将细胞沉淀重悬于 200 µL 固定缓冲液中（使用适当的固定和破膜试剂盒），在 4 °C 条件下避光孵育 40 分钟。孵育结束后，用 200 µL 破膜洗涤缓冲液洗涤细胞两次，再将细胞沉淀重悬于 100 µL 含相应目标抗体或对照抗体混合物的溶液中，在 4 °C 条件下避光孵育 40 分钟。然后，每次用 200 微升破膜洗涤缓冲液洗涤细胞，共洗涤两次。将细胞重悬于 250 微升含 EDTA 的 FACS 缓冲液中，随后将样品转移至预置于冰上并避光的相应 FACS 管中。此处可观察到针对经 DMM 处理动物骨髓来源免疫细胞中单核细胞亚群分析所采用的层级设门策略。未染色的对照样本可用于确定死活染色的真实阴性结果，并可根据需要在每次实验时调整设门。在此代表性分析中，于DMM或假手术对照处理六周后，从滑膜组织中分离免疫细胞，并使用细胞外表面标志物进行染色。与假手术小鼠中观察到的细胞群体相比，在DMM处理的动物中观察到更高比例的Ly-SC阳性MHC2阴性细胞和M2型巨噬细胞。此处可观察到针对经DMM处理动物脾脏分离的免疫细胞中胞外和胞内T细胞检测组合的层级设门策略。在DMM动物的淋巴结和滑膜组织中，观察到更高比例的TH1细胞，以及更多的调节性T细胞和TH17细胞。为确保获得高质量的样本，必须以快速、细致且一致的方式采集组织。免疫细胞分离后，可进行其他下游分析，例如RT-PCR、细胞培养以及全血刺激实验，以揭示感兴趣的分子过程。

flow-cytometry-analysis-immune-cell-subsets-within-murine-spleen-bone

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

骨关节炎模型中骨髓、骨髓、淋巴结和合成组织内免疫细胞子集的流动细胞测量分析

本文介绍了一种基于流式细胞术的方法，用于研究主动脉的免疫细胞组成。同时，本文还展示了一种额外的技术，可分别检测周围外膜和血管壁。该方法为开展主动脉白细胞的表型分析以及在动脉粥样硬化研究中应用多种免疫学检测手段提供了可能。...

小鼠主动脉内免疫细胞的流式细胞术分析

本视频展示了一种用于小鼠自身免疫性关节炎的细胞治疗法。将表达卵清蛋白特异性受体的诱导多能干细胞（iPSC）来源的调节性T细胞，与乳化于佐剂中的甲基化牛血清白蛋白（mBSA）共同注射。小鼠抗原呈递细胞（APCs）对mBSA进行加工并将其呈递给T细胞，从而促进T细胞活化并迁移至膝关节滑膜。后续注射在左膝关节仅使用mBSA，而在右膝关节则联合使用mBSA和卵清蛋白。在左膝关节，针对mBSA的免疫反应引发关节炎；而在右膝关节，调节性T细胞与卵清蛋白相互作用，减轻炎症反应，从而改善关节炎症状。...

一种用于小鼠模型中自身免疫性关节炎的细胞疗法

本文介绍了光谱流式细胞术，这是一种流式细胞术的新方法，利用发射光谱的形状来区分荧光染料。该方法采用一种算法替代补偿，并可将自发荧光作为一个独立参数进行处理。这种新方法使得对从实体器官中分离的细胞进行准确分析成为可能。...

通过光谱流式细胞术分析从实体组织中分离的细胞悬液

由于小鼠坐骨神经组织稀少，对其进行细胞成分的定量分析较为困难。本方案描述了一种组织消化与制备方法，可获得足够数量的细胞，用于对单只小鼠神经中的免疫细胞群体进行流式细胞术分析。...

利用流式细胞术分析单只小鼠单侧坐骨神经和背根神经节中的免疫细胞

本文介绍了一种简单的小鼠骨髓细胞分离与染色方案，用于表征造血干细胞和祖细胞，以及支持性微环境中的内皮细胞和间充质干细胞。方案中还包括一种富集位于骨内膜区和骨髓中央区域细胞的方法。...

小鼠骨髓造血干细胞与祖细胞及基质微环境细胞的流式细胞术分析

通过透射光、偏振光和补偿光显微镜对滑膜液进行分析，可利用简单的步骤评估样本的炎症性或非炎症性特征。该方法在骨关节炎中尤为有用，可用于检测钙盐结晶，并识别出更严重的骨关节炎亚型。...

关节液分析用于识别骨关节炎

本研究提供了一种改良方案，用于从鼠类炎症性关节炎组织中分离滑膜巨噬细胞和成纤维细胞。...

从小鼠关节炎组织中分离和培养原代滑膜巨噬细胞与成纤维细胞

体内关节成像是一种有价值的技術，可用於揭示白細胞在發炎關節中的遷移行為以及分子動態。本文中，我們介紹了一種利用II型膠原誘導關節炎（CIA）小鼠模型進行體內關節成像的詳細實驗方案。...

体内成像揭示白细胞在关节内的迁移行为

本文报道了一种通过过继转移SKG小鼠的CD4+...

小鼠类风湿性关节炎的过继转移模型

一种使用关节滑膜炎的临床前模型 离体 具有保留功能与结构的人类滑膜组织

了解流式细胞术分析骨关节炎模型小鼠骨髓、淋巴结和滑膜组织中单核细胞、巨噬细胞及T细胞亚群的方法。该技术可精确鉴定免疫细胞并表征骨关节炎免疫反应。

骨关节炎模型中经由流式细胞术分析小鼠脾脏、骨髓、淋巴结及滑膜组织内的免疫细胞亚群

探索更多视频