骨关节炎模型中对小鼠脾脏、骨髓、淋巴结及滑膜组织内免疫细胞亚群的流式细胞术分析

本方案可实现对神经元、滑膜及免疫系统其他各种组织中单核细胞、巨噬细胞、T细胞及其相关亚群的详细鉴定与分析。本技术有助于从滑膜及其他相关组织中可靠地分离活免疫细胞，从而全面表征骨关节炎的免疫应答。为从骨关节炎模型小鼠中分离目标组织，将小鼠置于仰卧位，用70%乙醇擦拭其胸部、腹部和腿部。

使用剪刀沿腹部中线小心切开皮肤，注意保持腹腔完整。轻轻将动物右侧的皮肤从下方肌肉组织上分离，使皮下脂肪组织仍附着于皮肤上。将小鼠置于解剖显微镜下，用两把弯头精细镊子轻轻分离出位于大腿部位的脂肪组织。

确定三条交叉血管后，使用精细解剖镊子小心摘除位于血管交叉处的腹股沟淋巴结，注意避免破坏包膜。用镊子清除淋巴结表面残留的脂肪组织，并打开腹腔。若未见残留脂肪组织，立即将淋巴结置于预先准备并标记好的六孔板中，每孔加入0.5毫升RPMI培养基。

随后，打开腹腔。使用精细剪刀切除脾脏，并轻柔地移出肠道以暴露主动脉及其分叉处。随后立即将脾脏放入预先准备并标记好的六孔板中，每孔加入0.5毫升RPMI培养基。

取出位于腹主动脉末端和髂总动脉起始处的髂淋巴结，并仔细剥离后肢两侧的皮肤。立即将淋巴结放入预先准备并标记好的六孔板中，每孔加入0.5毫升RPMI培养基，将两只动物的淋巴结合并置于同一孔中。使用精细剪刀或解剖刀清除左侧股骨附着的肌肉组织，并小心分离膝关节和髋关节，保留完整骨骼的同时取出股骨。

然后将股骨放入预先准备并标记好的六孔板中，每孔加入0.5毫升RPMI培养基。辨认右侧膝关节的髌腱，使用精细剪刀去除关节近端相连的肌肉组织，直至暴露出髌骨近端约五毫米的股四头肌腱。在髌骨近端约3至4毫米处切断股四头肌腱，形成一个手柄，用精细镊子轻轻牵拉，使关节处的张力松解，从而暴露关节囊附着处的边缘。

从股骨开始，向胫骨方向操作，使用手术刀在维持股四头肌腱轻柔牵引的同时，沿关节囊两侧边缘仔细切开。当滑膜组织块仅附着于胫骨时，应清晰可见髌骨远端的关节内脂肪垫，可将其从关节及Minsky前部轻柔分离。随后，沿剩余的关节囊部分进行切割，以移除滑膜组织块，并立即将其置于预先准备并标记好的六孔板中，每孔加入1.5毫升RPMI培养基。

当所有组织收集完毕后，将每种条件下两个合并的脾脏置于15毫升离心管中的70微米细胞筛网上，用无菌的3毫升注射器活塞轻轻研磨组织，使其通过筛网，并频繁用总共6毫升添加了10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基冲洗筛网。通过离心沉淀细胞，然后将细胞沉淀重悬于5毫升红细胞裂解缓冲液中。5分钟后，加入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）终止反应，并对细胞进行离心。

当观察不到红细胞时，将沉淀重悬于1毫升新鲜PBS中用于计数。对于淋巴结处理，将全部四个淋巴结置于新的15毫升离心管中的70微米细胞筛网上，使用新的无菌3毫升注射器活塞轻轻挤压淋巴结，使其通过筛网形成单细胞悬液，然后以500 × g离心5分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于500微升PBS中用于计数。为分离骨髓，使用组织镊小心夹住完整的股骨，并用锋利的剪刀剪除股骨近端末端。

将23号针头插入股骨髁间切迹的中部，同时施加轻柔压力并旋转针头，在切迹中钻出一个孔。根据需要更换针头，用六毫升添加了10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基冲洗骨组织内容物，使其流入置于新15毫升离心管上的70微米细胞滤筛中，并使用新的3毫升注射器活塞轻轻将骨髓细胞压过滤网。此后，按照脾脏操作所示方法进行红细胞裂解步骤。

当观察不到红细胞时，将沉淀重悬于1毫升新鲜PBS中用于计数。处理滑膜组织时，使用精细手术剪将两块滑膜组织剪成微小碎片，并将样品转移至新的15毫升离心管中。用500微升培养基冲洗收集容器，以回收残留的细胞和滑膜组织，并将洗涤液吸入样品收集管中。

接下来，加入足量的酶，使终浓度达到每毫升1个单位，并将滑膜组织样本置于37°C的摇床培养箱中消化2小时。将离心管放入摇床时，确保其具有足够的运动幅度。消化结束后，加入8毫升添加了10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基终止消化反应，并将细胞悬液通过70 µm细胞滤网过滤至新的15 mL离心管中。

用 5 毫升培养基冲洗旧的 15 毫升离心管，并用此液体洗涤滤膜。然后，通过离心沉淀细胞，并将沉淀重悬于 500 µL PBS 中用于细胞计数。为了对分离的免疫细胞进行活力染色，将每种细胞悬液中的 5 × 10⁵ 个细胞加入两个不同的 96 孔 U 型底板的相应孔中，并将细胞离心至各孔底部。

始终为每种组织类型的细胞设置足够数量的未染色细胞作为阴性对照。用 200 µL PBS 洗涤细胞，然后将细胞沉淀重悬于 100 µL 每孔的细胞通透性胺反应性染料中，在 4°C 避光孵育 15 分钟。孵育结束后，每次用 200 µL FACS 缓冲液洗涤细胞，共洗涤两次，然后将每次的细胞沉淀重悬于 100 µL 相应的目标抗体或对照混合液中。

如果同时进行细胞内和细胞外染色，请现在执行细胞外染色步骤。在4°C避光孵育30分钟后，每孔用200 µL FACS缓冲液洗涤细胞两次，并将细胞及单核细胞亚群检测板中的细胞重悬于250 µL含有1 mM EDTA的FACS缓冲液中。此步骤仅在不进行细胞内染色时执行；否则，请继续进行本方案中的细胞内染色部分。

然后，将每种单核细胞亚群样品转移至相应的预冷避光 FACS 管中。对于 T 细胞亚群 panel 细胞的胞内染色，将细胞沉淀重悬于 200 µL 固定缓冲液中（使用适当的固定和破膜试剂盒），在 4 °C 避光孵育 40 分钟。孵育结束后，用 200 µL 破膜洗涤缓冲液洗涤细胞两次，再将细胞沉淀重悬于 100 µL 相应的目标抗体或对照抗体混合液中，在 4 °C 避光孵育 40 分钟。

随后，每次用 200 微升破膜洗涤缓冲液洗涤细胞，共洗涤两次。然后将细胞重悬于 250 微升含 EDTA 的 FACS 缓冲液中，并将样品转移至预置于冰上避光保存的相应 FACS 管中。此处可观察到针对经 DMM 处理动物骨髓来源免疫细胞中单核细胞亚群分析所采用的层级设门策略。

未染色的对照样本可用于确定死活染色的真阴性结果，并可根据每次实验的具体情况调整设门。在此代表性分析中，于DMM或假手术对照处理六周后，从滑膜组织中分离免疫细胞，并使用细胞外表面标志物进行染色。与假手术小鼠中观察到的细胞群体相比，在DMM处理动物中观察到更高比例的Ly-SC阳性MHC2阴性细胞及M2型巨噬细胞。

在此，可以观察到针对DMM处理动物脾脏分离的免疫细胞进行胞外和胞内T细胞检测的层级设门策略。在DMM动物的淋巴结和滑膜组织中，观察到更高比例的TH1细胞，以及更多的调节性T细胞和TH17细胞。为确保获得高质量的样本，必须以快速、细致且一致的方式采集组织。

免疫细胞分离后，可进行其他后续分析，例如逆转录PCR（RTPCR）、细胞培养以及血液再刺激实验，以揭示感兴趣的分子过程。