高通量酵母菌株，带基于滴滴的RNA测序

ICO 或 ICO-seq 是高通量RNA测序首次适应微生物。这种方法在全基因组尺度上评估微生物功能。对于工程微生物，这种方法可以阐明微生物基因组的变化如何干扰其功能。

从悬浮培养获得酵母，并使用血细胞计计算细胞。以每毫升约75万个细胞的浓度重新悬浮PBS中的细胞。接下来，在PBS中混合超低熔点气糖，在90摄氏度加热混合物，直到加糖融化。

将阿加罗斯混合物装入注射器中，并附上0.22微米过滤器。将注射器泵放在设置为 80 摄氏度的空间加热器前面，然后将注射器放在泵中。用酵母悬浮液填充第二个注射器，用氟化油填充第三个注射器，用2%的离子氟化物填充。

将两个注射器加载到注射器泵中。将注射器中的管材连接到设备 A.将 15 毫升锥形管放入冰桶中，并引导出口管进入锥形管。设置每个注射器的流速，并在 15 毫升锥形管中收集大约 1 毫升乳液。

等待五分钟后，管中的气糖设置，添加相当于20%的体积，在氟化油的乳液。通过反转锥形管几次，混合乳液和全氟-八烷醇。将破裂的乳液在2000倍G下离心两分钟。

确保水凝胶在油和 PFO 相以上颗粒。拆下机油和 PFO 相。添加两毫升的 Tet（W）缓冲液以重新悬浮水凝胶。

将悬架转移到新的 15 毫升锥形管中。将管子再次在2000次G下离心两分钟。拆下上一液，并再次将水凝胶重新悬浮在 Tet（W）中。

在将水凝胶旋转为2000次G后，将水凝胶重新悬浮在酵母培养基的两毫升中。在30摄氏度下孵育管子，摇晃。每种菌株以不同的速率生长。

选择适当的培养基和孵育时间对于确保酵母在水凝胶内生长至关重要，但不会过度生长，导致细胞逃入介质中。首先，将水凝胶转移到15毫升锥形管中。将管子在2000倍G下离心两分钟。

用 PBS 清洗水凝胶两次，然后在球状缓冲液中清洗一次。在球状缓冲液中进行40倍的球状酶稀释。然后，在水凝胶中加入一毫升稀释酶。

在37摄氏度下孵育水凝胶管一小时。经过处理的酵母看起来更加透明。从含有水凝胶悬浮液的管子中，从管底提取0.8毫升悬浮液，然后将其转移到一毫升未封盖的注射器中。

将注射器放在 3D 打印注射器支架中。将注射器和支架在2000次G下离心两分钟。在继续之前，确保水凝胶在注射器底部紧密包装。

将 240，000 滴塞克珠子放在 15 毫升锥形管中。将管子在1000倍G下离心一分钟。取出上流剂，用500毫摩尔氯化钠将珠子重新悬浮在两毫升0.9x酵母解液缓冲液中。

插入搅拌棒，并将珠悬浮液转移到三毫升注射器。准备另一个注射器，在氟化油中含有几毫升的PFPE-PEG表面活性剂。获取先前准备好的酵母克隆包装水凝胶的注射器。

疏散默许头，盖上注射器。将三个注射器、水凝胶、珠悬浮液和机油插入注射器泵。通过管道将注射器连接到封装装置 B。

将出口管的末端放入 50 毫升的圆锥管中。设置每个注射器的流速。收集大约1000毫升乳液，或运行设备，直到没有水凝胶剩余。

然后遵循cDNA合成、库准备和测序的滴塞协议。使用微流体装置，酵母细胞被封装在160微米液滴中。一个八倍的分路器将这些液滴分成八个60微米的水滴。

隔夜孵育导致一些水凝胶中生长的异源酵母菌菌群。在将酵母水凝胶装入第二个微流体装置之前，它们被清洗并浸入溶液中以消化细胞壁。适当的消化通过显微镜验证，处理酵母细胞具有更反射的形态。

在第二个微流体装置的滴入结之前，将解解缓冲液中的mRNA捕获珠流与一组近包酵母水凝胶混合在一起。在所得乳液中，大约10%收集的液滴含有一个带裂化菌落的珠子。这种同源菌群测序工作流程用于分析C.albicans的白色不透明开关响应。

主要组件、PC、分析和 tSNE 维减表示样本数据集与参考数据集之间的一般一致性。TSNE 分析揭示了三组细胞。虽然第二组主要由样本数据集中的细胞组成，而组零和组组由两个样本中的单元组成。

在 tSNE 上叠加 WH11 表达式表明聚类一个可能包含白色菌落。STF2 表达式在群集 1 中增加，与以前获得的数据一致。在群集 0 和 2 中，WH11 和 STF2 与群集 1 相比明显降低。

安德罗根微生物具有越来越大的潜力，可以大规模生产生物制剂，用于治疗各种疾病。按照此过程，可以应用各种生物信息工具进一步分析测序数据。