基于液滴的高通量酵母菌株表型分析与RNA测序

ICO（或称ICO-seq）是首个将高通量RNA测序技术应用于微生物的研究方法。该方法可在全基因组水平上评估微生物的功能。对于经过基因工程改造的微生物，该方法可阐明微生物基因组的改变如何影响其功能。

从悬浮培养物中获取酵母，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。用 PBS 重悬细胞，使其浓度约为每毫升 750,000 个细胞。接着，将超低熔点琼脂糖与 PBS 混合，并在 90 摄氏度下加热，直至琼脂糖完全融化。

将琼脂糖混合物装入带有0.22微米滤器的注射器中。将注射泵放置在设定为80摄氏度的加热器前方，并将注射器放入泵中。用第二个注射器吸入酵母悬浮液，用第三个注射器吸入含2%离子型氟化表面活性剂的氟化油。

将两个注射器装入注射泵中。将注射器的管路连接至装置A。取一个15毫升的锥形管置于冰桶中，并将出口管路导入锥形管内。设定每个注射器的流速，收集约1毫升乳液至15毫升锥形管中。

等待试管中的琼脂糖凝固5分钟后，向乳液中加入等体积的含20%全氟辛醇的氟化油。通过反复倒置锥形管数次，混合乳液与全氟辛醇。将破乳后的混合物在2,000 × g条件下离心2分钟。

确保水凝胶已沉淀至油相和PFO相上方。移除油相和PFO相。加入2 mL tet(W)缓冲液以重新悬浮水凝胶。

将悬浮液转移至新的15毫升锥形管中。再次以2,000 × g离心2分钟。弃去上清液，用tet(W)重新悬浮水凝胶。

将水凝胶在 2,000 × g 条件下离心两分钟，然后在两毫升酵母培养基中重新悬浮。在 30 °C 条件下振荡培养过夜。不同菌株的生长速率各异。

选择合适的培养基和孵育时间对于确保酵母在水凝胶内生长但不过度生长（从而导致细胞逃逸至培养基中）至关重要。首先，将水凝胶转移至15毫升锥形管中。以2,000 × g离心2分钟。

用 PBS 清洗水凝胶两次，然后用原生质体缓冲液清洗一次。将原生质体酶在原生质体缓冲液中进行 40 倍稀释。随后，向水凝胶中加入一毫升稀释后的酶。

将水凝胶管在 37 摄氏度下孵育一小时。经处理的酵母将显得更透明。从含有水凝胶悬浮液的试管中，从管底吸取 0.8 毫升悬浮液，并转移至一个未加盖的 1 毫升注射器中。

将注射器放入3D打印的注射器支架中。以2,000 ×g离心注射器及支架2分钟。在继续操作前，确保水凝胶已紧密聚集在注射器底部。

将 240,000 个 Drop-seq 磁珠放入一个 15 毫升的圆锥形离心管中。在 1,000 × g 条件下离心 1 分钟。弃去上清液，并将磁珠重悬于 2 毫升含有 500 毫摩尔/升氯化钠的 0.9x 酵母裂解缓冲液中。

插入一个搅拌子，并将珠子悬浮液转移至一个三毫升注射器中。另准备一个注射器，内含数毫升溶解于氟化油中的PFPE-PEG表面活性剂。取先前制备好的含有酵母克隆包埋水凝胶的注射器。

抽空顺应性头部，并盖上注射器盖帽。将三个注射器、水凝胶、微珠悬浮液和油分别装入注射泵中。通过管路将注射器连接至装置B，即包封装置。

将出口管路末端放入置于冰上的50毫升锥形管中。设置每支注射器的流速。收集约1,000毫升乳液，或持续运行装置直至无剩余水凝胶为止。

然后按照Drop-seq方案进行cDNA合成、文库制备和测序。使用微流控装置将酵母细胞包裹在160微米的液滴中。通过八通道分流器将这些液滴分成八个60微米的液滴。

过夜孵育后，部分水凝胶中生长出同基因型的酵母菌落。在将酵母水凝胶加载到第二个微流控装置之前，需对其进行洗涤并浸入溶液中以消化细胞壁。通过显微镜观察验证消化是否充分，经处理的酵母细胞呈现出更具反射性的形态。

在第二台微流控装置的液滴生成 junction 之前，将含有 mRNA 捕获磁珠的裂解缓冲液流与紧密堆积的酵母水凝胶流混合。在生成的乳液中，约 10% 的收集到的液滴包含一个带有裂解菌落的磁珠。该同基因型菌落测序工作流程用于分析白色念珠菌（C.albicans）的白-灰型转换反应。

主成分分析（PC）和tSNE降维分析表明，样本数据集与参考数据集之间具有总体一致性。tSNE分析揭示了三个细胞簇。其中，簇2主要由样本数据集中的细胞组成，而簇0和簇1则包含来自两个样本的细胞。

将WH11表达叠加到tSNE图上表明，簇1可能包含白色菌落。STF2在簇1中表达升高，与先前获得的数据一致。在簇0和簇2中，WH11和STF2的表达相较于簇1显著下调。

雄性激素微生物在大规模生产用于治疗多种疾病的生物制剂方面具有日益增长的潜力。通过本实验方案，可应用多种生物信息学工具对测序数据进行进一步分析。