阿西尔-PEGyl交换凝胶移位测定，用于脑膜蛋白棕榈酸化定量测定

这种生化方法允许确定大脑中任何有适当抗体的膜蛋白的棕榈基化状态。这种技术的主要优点是它不需要亲和力纯化，而是利用凝胶流动性的变化来确定感兴趣的蛋白质的修饰数量。解剖大脑后，立即在冰面玻璃均质器中的10毫升均质缓冲液中均质。

使用大约 12 冲程，在 1400 倍 G 和 4 摄氏度下将酸盐离心 15 分钟。将上一液转移到冰上的新管子上。将颗粒重新在10毫升的均质缓冲液中。

使用大约六个笔画进行同质化。将悬浮液在710倍G和4摄氏度下离心10分钟。将超级natant将它们与4万倍G和4摄氏度的离心器结合20分钟。

丢弃上流剂，通过用移液器尖端分解颗粒并上下移液，在均质缓冲液中重新填充颗粒膜分数。执行 ABCA 测定以量化蛋白质水平。要执行 APEGS 测定，将 470 微升缓冲液 A 放在 1.5 毫升管中，并加入约 100 至 200 毫克蛋白质。

在25摄氏度和至少13，000次G下离心管，将不溶性蛋白质分离，然后分离出不溶性蛋白质，10分钟。将溶解的蛋白质转移到新的1.5毫升管中。首先，在55摄氏度下，在25微升TCEP中孵育溶解蛋白60分钟，从而破坏二硫化物键。

然后，在室温下用12.5微升的NEM库存溶液孵育溶液，阻断释放半胱氨酸，长达3小时。接下来，开始氯仿甲醇沉淀过程。将蛋白质溶液从1.5毫升管转移到聚丙烯或玻璃管中，这种管可以以适中的速度在摆动桶转子中离心。

短暂添加两毫升甲醇和涡流。短暂加入一毫升氯仿和涡流。然后加入1.5毫升的去维化水和涡流再次短暂。

如有必要，反转管子以确保彻底混合。在摆动桶转子中，在 3000 倍 G 和 25 摄氏度下将样品离心 30 分钟。小心地取出并丢弃管中溶液的上相。

加入1.5毫升甲醇。轻轻但彻底混合通过轻轻反转的管，小心不要分裂不透明的蛋白质煎饼。在摆动桶转子中，以 3000 倍 G 和 25 摄氏度的离心样品 10 分钟。

使用玻璃血清移液器，在不干扰蛋白质煎饼的情况下，尽可能去除溶液的顶相。用一毫升甲醇小心地冲洗颗粒，让其风干至少10分钟。随着氯仿甲醇沉淀的完成，开始棕榈基硫化酯连接的裂解，将沉淀的蛋白质重新沉淀在缓冲液 A 的125微升中。转移到新的1.5毫升管中。

将管短暂化，然后在13，000倍G或更高、25摄氏度时离心10分钟，以去除不溶性物质。将溶解蛋白转移到新的1.5毫升管中，并加入375微升缓冲液H或缓冲液T.在室温下孵育样品60分钟后，重复氯仿甲醇沉淀。要将 m-PEG 添加到未受保护的半胱氨酸中，首先在含有 10 密耳或更多 TCEP 的 100 微升缓冲液 A 中重新填充颗粒。

然后将悬浮液转移到1.5毫升管中。添加 25 微升库存 m-PEG 5K 溶液，通过移液混合。在室温下孵育，端过端旋转。

孵育60分钟后，通过再次进行氯仿甲醇沉淀，去除未合并的m-PEG 5K。在超过13，000倍的G和25摄氏度的离心机10分钟。小心地去除上相，避免厚，絮凝的煎饼。

加入一毫升甲醇，轻轻但彻底混合。在超过13，000倍的G和25摄氏度的离心机10分钟。小心地取出上清液，用一毫升甲醇冲洗颗粒。

同样，离心机在大于13，000倍的G和25摄氏度10分钟。空气干燥颗粒后，在50微升缓冲液 A 中重新排放，无需 TCEP 或任何还原剂。保留5微升溶液，用于BBA蛋白定量。

定量后，添加适当量的 4x Laemmli 样品缓冲液。将样品加载到 SDS 页面凝胶上。使用标准分离传输和检测协议进行西印。

为了研究SynDIG蛋白质的手掌化状态，对来自同质小鼠大脑的P2膜分数进行了PEGS测定。分离和与抗体的探测表明，SynDIG1、SynDIG4Prrt1和Prrt2在小鼠大脑中被棕榈化。氯仿甲醇沉淀的目的是防止一种化学物质，如NEM，干扰协议的下一步。

适当的氯仿甲醇沉淀将去除不良化学物质，同时最大限度地减少蛋白质损失。该方法可应用于不同年龄或不同大脑区域的小鼠的脑体，研究棕榈醇化的时空结构。