Name: 阿西尔-PEGyl交换凝胶移位测定，用于脑膜蛋白棕榈酸化定量测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 了解阿西尔-PEGyl交换凝胶移位测定法，用于定量分析小鼠脑组织中的膜蛋白棕榈酰化状态。该方法无需亲和纯化，通过凝胶迁移率变化快速检测蛋白质修饰程度，为神经科学研究提供简便高效的生化工具。

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作者感谢 K. Woolfrey 对 APEGS 检测实验提供的建议和意见。本研究由 Whitehall 基金会和美国国立卫生研究院神经科学与心理健康研究所（NIH-NIMH，项目编号：1R01MH119347）向 E.D. 提供的研究基金资助。

所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）制定的指南，并已获得加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 小鼠脑膜的制备
<ol>
	<li>使用断头器装置处死小鼠，并迅速解剖取出脑组织（尽可能在&#60;1 分钟内完成，以尽量减少解剖过程中可能发生的棕榈酰化修饰变化）。立即在冰上用玻璃匀浆器（约 12 次 strokes）将组织在 10 mL 匀浆缓冲液（表 1）中匀浆。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 1,400 × g 离心裂解物 15 分钟。将上清液转移至冰上新的离心管中。用等体积的匀浆缓冲液重悬沉淀（约 6 次 strokes），并在 4 °C 条件下以 710 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>合并第 1.2 步的上清液，并在 4 °C 条件下以 40,000 × g 离心 20 分钟。</li>
	<li>弃去上清液（胞质组分），用匀浆缓冲液重悬沉淀的膜组分（P2 组分）。 
	注意：样品可进行速冻，并在 -80 °C 保存以备后续使用。</li>
	<li>采用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度。进行 APEGS 检测时，取约 100−200 mg 蛋白（最多不超过 250 mg），溶于 470 µL 缓冲液 A（表 1）中，置于 1.5 mL 离心管内。超声处理后，在 25 °C 条件下以 &#62;13,000 × g 离心 10 分钟，去除不溶性蛋白。将可溶性蛋白转移至新的 1.5 mL 离心管中。</li>
</ol>
2. 酰基-PEG交换凝胶迁移（APEGS）实验
<ol>
	<li>破坏二硫键并封闭游离半胱氨酸。
	<ol>
		<li>在 25 mM 三(2-羧乙基)膦（TCEP；25 µL，由储备液加入；表 1）中于 55 °C 孵育 60 分钟，以破坏二硫键。</li>
		<li>在室温下用 50 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM；12.5 µL，由储备液加入；表 1）封闭游离半胱氨酸，孵育 3 小时。 
		注：反应时间可延长至过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行氯仿-甲醇（CM）沉淀。
	<ol>
		<li>将蛋白溶液从 1.5 mL 离心管转移至可于摆动桶转子中以中等速度离心的聚丙烯或玻璃管中。5 mL 管为理想选择。加入四倍体积（2 mL）甲醇（MeOH），短暂涡旋混匀。</li>
		<li>加入两倍体积（1 mL）氯仿，短暂涡旋混匀。</li>
		<li>加入三倍体积（1.5 mL）dH2O，短暂涡旋混匀。</li>
		<li>在摆动桶转子中，于 25 °C 以 3,000 x g 离心 30 分钟。</li>
		<li>小心移除并弃去上层液相。</li>
		<li>加入三倍体积（1.5 mL）MeOH，轻柔但彻底混匀，注意避免破坏不透明的蛋白饼状沉淀。</li>
		<li>在摆动桶转子中，于 25 °C 以 3,000 x g 离心 10 分钟。</li>
		<li>使用玻璃刻度移液管，尽可能移除上层液相，避免扰动蛋白饼状沉淀。</li>
		<li>用 1 mL MeOH 小心冲洗沉淀。</li>
		<li>将沉淀在空气中干燥至少 10 分钟。 
		注：干燥后的沉淀可在 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用羟胺（NH2OH，HAM）裂解棕榈酰-硫酯键。
	<ol>
		<li>将蛋白沉淀重悬于 125 µL 缓冲液 A 中，并短暂超声处理。于 25 °C 以 &#62;13,000 x g 离心 10 分钟，去除不溶性物质。将溶解的蛋白转移至新的 1.5 mL 管中。</li>
		<li>加入 375 µL 缓冲液 H（HAM+；表 1）或缓冲液 T（HAM-；表 1），于 25 °C 孵育 60 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复步骤 2.2 中所述的 CM 沉淀。 
	注：干燥后的沉淀可在 -20 °C 保存。</li>
	<li>向未保护的半胱氨酸残基添加 mPEG。
	<ol>
		<li>将沉淀重悬于含 10 mM TCEP 的 100 µL 缓冲液 A 中。转移至 1.5 mL 管中。 
		注：在 CM 沉淀步骤中发生显著蛋白损失是正常现象。后续所有步骤均在 1.5 mL 管中进行，蛋白体积限制在约 120−130 µL 以内。这将减少最终 CM 沉淀过程中的蛋白损失。</li>
		<li>向蛋白样品中加入 20 mM mPEG-5k（25 µL，由储备液加入；表 1），通过移液混匀。于 25 °C 在翻转混合仪上孵育 60 分钟。</li>
		<li>为去除未结合的 mPEG-5k，按步骤 2.2 所述进行 CM 沉淀，使用以下调整后的体积：4 倍体积 MeOH（500 µL）、2 倍体积氯仿（250 µL）和 3 倍体积 dH2O（375 µL）。于 25 °C 以 &#62;13,000 x g 离心 10 分钟。</li>
		<li>如前所述小心移除上层液相，避免扰动厚实的絮状沉淀。加入 1 mL MeOH，轻柔但彻底混匀。于 25 °C 以 &#62;13,000 x g 离心 10 分钟。</li>
		<li>小心移除上清液，并用 1 mL MeOH 冲洗沉淀。于 25 °C 以 &#62;13,000 x g 离心 10 分钟。将沉淀空气干燥。 
		注：干燥后的沉淀可在 -20 °C 保存。</li>
		<li>将干燥的沉淀重悬于 50 µL 缓冲液 A（不含 TCEP 或任何还原剂）中。保留 5 µL 用于 BCA 蛋白定量。定量后，加入适量 4x Laemmli 上样缓冲液，并根据目标蛋白情况，可能需将样品在 70−100 °C 加热 10 分钟。 
		注：煮沸可能导致某些膜蛋白发生聚集。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 聚乙二醇化蛋白的蛋白质印迹分析
<ol>
	<li>将样品上样至十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶13。 
	注意：本实验方案中使用了10%的聚丙烯酰胺凝胶。</li>
	<li>采用标准的分离、转膜和检测步骤进行蛋白质印迹（Western blotting）14。</li>
	<li>使用密度测定法14确定聚乙二醇化蛋白与非聚乙二醇化蛋白的相对含量。</li>
</ol>

<ol><li>Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+S-palmitoylation+do+to+membrane+proteins%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">What does S-palmitoylation do to membrane proteins?</a> FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).</li>
<li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).</li>
<li>Globa, A. K., Bamji, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+the+development+and+plasticity+of+neuronal+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).</li>
<li>Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation-dependent+regulation+of+glutamate+receptors+and+their+PDZ+domain-containing+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners.</a> Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).</li>
<li>Kalashnikova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynDIG1%3A+an+activity-regulated%2C+AMPA-+receptor-interacting+transmembrane+protein+that+regulates+excitatory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development.</a> Neuron. 65, 80-93 (2010).</li>
<li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Dependent+Palmitoylation+Controls+SynDIG1+Stability%2C+Localization%2C+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function.</a> Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).</li>
<li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylated+proteins%3A+purification+and+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).</li>
<li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).</li>
<li>Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Screening+of+Depalmitoylating+Enzymes+and+Evaluation+of+Their+Activities+by+the+Acyl-PEGyl+Exchange+Gel-Shift+%28APEGS%29+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).</li>
<li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).</li>
<li>Percher, A., Thinon, E., Hang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-Tag+Labeling+Using+Acyl-PEG+Exchange+for+the+Determination+of+Endogenous+Protein+S-Fatty+Acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).</li>
<li>Yokoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+PSD-95+Depalmitoylating+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes.</a> Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Separating+Protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Science+Education+Database.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Science Education Database. The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Chenaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+SynDIG1+Reduces+Excitatory+Synapse+Maturation+But+Not+Formation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li>
<li>Matt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynDIG4%2FPrrt1+Is+Required+for+Excitatory+Synapse+Development+and+Plasticity+Underlying+Cognitive+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function.</a> Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).</li>
<li>Purkey, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKAP150+Palmitoylation+Regulates+Synaptic+Incorporation+of+Ca%282%2B%29-Permeable+AMPA+Receptors+to+Control+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP.</a> Cell Reports. 25, 974-987 (2018).</li>
<li>Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+palmitoyl+acyltransferase+DHHC2+regulates+recycling+endosome+exocytosis+and+synaptic+potentiation+through+palmitoylation+of+AKAP79%2F150%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150.</a> Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在我们之前的研究中，我们利用ABE检测法证明，SynDIG1在两个保守的跨膜邻近半胱氨酸残基（在所有SynDIG蛋白中均存在）上以依赖于活性的方式发生棕榈酰化，从而调控其稳定性、定位和功能6。该方法的一个局限性在于，ABE检测法在操作的最后一步需要使用与亲和素分子偶联的琼脂糖树脂进行亲和纯化，导致信号显著丢失，使定量分析变得复杂。此外，ABE检测法无法区分蛋白质是仅在一个位点还是在多个位点发生棕榈酰化。
本文采用 APEGS 检测法8,9,10,11,12，以确定从小鼠脑组织提取物中获得的 AMPA 受体辅助跨膜蛋白 SynDIG1 及其相关蛋白 SynDIG4（亦称为 Prrt1）和 Prrt2 的棕榈酰化状态...

S-棕榈酰化是一种可逆的蛋白质翻译后修饰，能够调节靶蛋白与细胞膜的稳定结合、蛋白质的转运以及蛋白质-蛋白质相互作用1。该过程由棕榈酰酰基转移酶（PAT）催化，通过硫酯键将一个16碳的棕榈酰基团添加到半胱氨酸残基上。大脑中许多突触蛋白会发生棕榈酰化修饰，包括AMPA受体（AMPA-Rs）和PSD-95，这种修饰具有活动依赖性，可调控这些蛋白的稳定性、定位和功能2,3,4。突触后密度区（PSD）中AMPA受体水平的变化依赖于辅助因子与PSD-95等突触支架蛋白的相互作用，这是突触可塑性的基础；因此，检测突触蛋白棕榈酰化状态的方法为研究突触可塑性机制提供了重要线索。
此前，我们鉴定了包含四个基因（SynDIG1-4）的 SynDIG 基因家族，这些基因编码在脑组织中特异性表达的跨膜蛋白，并可与 AMPARs5 相互作用。在分离的大鼠海马神经元中，过表达或敲低 SynDIG1 分别会使 AMPA 受体突触的大小和数量增加或减少约 50%，该结果通过免疫细胞化学和电生理学方法检测得到5。我们曾利用酰基-生物素交换（ABE）实验表明，SynDIG1 在两个保守的跨膜邻近半胱氨酸残基（在所有 SynDIG 蛋白中均存在）上以依赖于神经元活动的方式发生棕榈酰化修饰，从而调控其稳定性、定位及功能6。ABE 实验依赖于对经修饰保护的半胱氨酸位点进行生物素交换，随后通过亲和纯化进行检测7。本文中，我们描述了一种创新的生化方法——酰基-聚乙二醇交换凝胶迁移（APEGS）实验8,9,10,11,12，该方法无需亲和纯化步骤，而是利用蛋白在凝胶电泳中迁移率的变化来确定目标蛋白的修饰数量。本方案以小鼠脑组织中内源性膜蛋白为研究对象，适用于已有合适抗体的蛋白检测。

<table><tbody><tr><td>羟胺（HAM）</td><td>ThermoFisher</td><td>26103</td><td></td></tr><tr><td>甲氧基-PEG-(CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;NHCO(CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-MAL（mPEG）</td><td>NOF</td><td>ME-050MA</td><td>分子量 ~5000 kDa</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>或性能相当的设备</td></tr><tr><td>N-乙基马来酰亚胺（NEM）</td><td>Calbiochem</td><td>34115</td><td>剧毒。</td></tr><tr><td>用于密度测定的光学成像仪</td><td>Azure Biosystems</td><td>Sapphire Biomolecular Imager</td><td>或性能相当的设备</td></tr><tr><td>带盖聚丙烯管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-1D</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管（玻璃）</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-27D</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-15R</td><td>或性能相当的设备</td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）</td><td>EMD Millipore</td><td>580560</td><td></td></tr></tbody></table>

用于定量测定脑膜蛋白棕榈酰化的酰基-peg化交换凝胶迁移实验

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

突触后密度区（PSD）内AMPA受体（AMPARs）水平的活动依赖性改变被认为是学习与记忆的细胞机制之一。棕榈酰化以活动依赖的方式调控多种突触蛋白的定位与功能，包括AMPA受体、辅助因子及突触支架蛋白。我们鉴定了突触分化诱导基因（SynDIG）家族的四个基因（SynDIG1-4），它们编码在脑中特异性表达的跨膜蛋白，能够与AMPARs结合并调控突触强度。SynDIG1在跨膜区附近第191和192位的两个半胱氨酸残基上发生棕榈酰化修饰，该区域对活动依赖性兴奋性突触的发育具有重要作用。本文介绍了一种创新的生化方法——酰基-聚乙二醇交换凝胶迁移（APEGS）检测法，用于研究任意目标蛋白的棕榈酰化状态，并展示了该方法在小鼠脑裂解液中SynDIG蛋白家族的应用价值。

使用针对目标蛋白的抗体进行免疫印迹，通过与未加入HAM的样品进行迁移率比较，可揭示小鼠脑组织裂解液中蛋白的棕榈酰化状态（非棕榈酰化、单棕榈酰化、双棕榈酰化等）。此前，我们已通过ABE实验表明SynDIG1在两个位点发生棕榈酰化修饰6；然而，尚无法确定这两个位点在脑组织中是否均被修饰。本文结果显示，SynDIG1、SynDIG4/Prrt1和Prrt2在小鼠脑组织中均存在棕榈酰化修饰，且各自具有两个潜在的棕榈酰化位点（图1）。有趣的是，根据非棕榈酰化、单棕榈酰化和双棕榈酰化蛋白信号的差异，每种蛋白在小鼠脑组织中呈现出不同的棕榈酰化状态。通过蛋白印迹条带的密度分析，可获得棕榈酰化状态的定量信息。
<img alt="Western blot 示意图；蛋白质表达分析；SD1、Prrt2、SD4 泳道；分子量标记物。" class="xfigimg" s...

棕榈酰化是指以可逆方式将一个16碳的棕榈酰基团结合到靶蛋白的半胱氨酸残基上。本文中，我们描述了一种生物化学方法——酰基-聚乙二醇交换凝胶迁移（APEGS）检测法，用于研究小鼠脑组织裂解液中任何目的蛋白的棕榈酰化状态。

用于定量测定脑膜蛋白棕榈酰化的酰基-PEG化交换凝胶迁移实验

突触后密度（PSD）中突触AMPA受体（AMPARs）水平的活动依赖性改变被认为代表了一种细胞……

这种生物化学方法可用于检测脑组织中表达的任何膜蛋白的棕榈酰化状态，前提是存在针对该蛋白的合适抗体。该技术的主要优势在于无需进行亲和纯化，而是利用蛋白质在凝胶电泳中迁移率的变化来确定目标蛋白的修饰数量。取出脑组织后，应立即在冰上用玻璃匀浆器将组织加入10毫升匀浆缓冲液中进行匀浆处理。使用约12次 strokes，将裂解物在4℃条件下以1400 × g离心15分钟。将上清液转移至冰上预冷的新离心管中。用10毫升匀浆缓冲液重悬沉淀。使用大约六次 strokes 进行匀浆。在 710 × g 和 4 °C 条件下离心悬浮液 10 分钟。收集上清液并将其在 40,000 × g 和 4 °C 条件下离心 20 分钟。弃去上清液，用移液枪头将沉淀的膜组分在匀浆缓冲液中吹打重悬。进行ABCA检测以定量蛋白质水平。进行APEGS检测时，取470微升缓冲液A加入1.5毫升离心管中，再加入约100至200毫克蛋白质。将离心管超声处理，然后在25摄氏度下以至少13,000 ×g离心10分钟，分离不溶性蛋白。将溶解的蛋白转移至新的1.5毫升离心管中。首先，在55摄氏度下用25微升TCEP孵育溶解的蛋白60分钟，以打断二硫键。然后，在室温下将溶液与12.5 µL的NEM储备溶液孵育3小时，以封闭游离的半胱氨酸。接着，开始进行氯仿-甲醇沉淀处理。将蛋白质溶液从1.5 mL离心管转移至可于摆动桶转子中以中等速度离心的聚丙烯或玻璃管中。加入2毫升甲醇，短暂涡旋。加入1毫升氯仿，短暂涡旋。然后加入1.5毫升去离子水，再次短暂涡旋。如有必要，倒置离心管以确保充分混匀。将样品在25°C条件下，以3000 × g离心30分钟，使用水平转子转子。小心移除并弃去离心管中溶液的上层相。加入1.5毫升甲醇。通过轻轻倒置离心管的方式温和而充分地混匀，注意避免破坏不透明的蛋白质沉淀块。将样品在25摄氏度下以3000 ×g 的离心力在水平转子中离心10分钟。使用玻璃刻度移液管，尽可能移除溶液的上层相，注意不要扰动蛋白质沉淀。用一毫升甲醇小心冲洗沉淀，并使其在空气中干燥至少10分钟。氯仿-甲醇沉淀完成后，开始裂解棕榈酰硫酯键，将蛋白质沉淀重悬于125微升缓冲液A中，转移至新的1.5毫升离心管。短暂超声处理离心管，然后在25摄氏度下以13,000 × g或更高转速离心10分钟，以去除不溶性物质。将溶解的蛋白质转移至新的1.5毫升离心管中，并加入375微升缓冲液H或缓冲液T。室温孵育样品60分钟后，重复氯仿-甲醇沉淀步骤。为将m-PEG添加至未保护的半胱氨酸，首先将沉淀物重悬于含10毫摩尔或更高浓度TCEP的100微升缓冲液A中。然后将悬液转移至1.5毫升离心管中。加入25微升储备的m-PEG 5K溶液，用移液器吹打混匀。在室温下以翻转混匀的方式孵育。孵育60分钟后，再次通过氯仿-甲醇沉淀法去除未结合的m-PEG 5K。在大于13,000 ×g、25 °C条件下离心10分钟。小心移除上层相，避免触及厚实的絮状沉淀层。加入1毫升甲醇，轻轻但充分混匀。在大于13,000 ×g及25 °C条件下离心10分钟。小心弃去上清液，并用1毫升甲醇洗涤沉淀。再次在大于13,000 × g、25 °C条件下离心10分钟。将沉淀物空气干燥后，用50 μL不含TCEP或其他还原剂的缓冲液A重悬。保留5 μL溶液用于BCA蛋白定量。定量后，加入适量的4x Laemmli上样缓冲液。将样品上样至SDS-PAGE凝胶，按照标准的分离、转膜和检测流程进行Western blot分析。为了研究 SynDIG 蛋白的棕榈酰化状态，将小鼠脑组织匀浆后的 P2 膜组分进行 APEGS 检测。通过抗体分离和检测表明，SynDIG1、SynDIG4 Prrt1 和 Prrt2 在小鼠脑中均存在棕榈酰化修饰。氯仿-甲醇沉淀的目的是防止某些化学物质（如 NEM）干扰后续实验步骤。适当的氯仿-甲醇沉淀可去除不需要的化学物质，同时最大限度减少蛋白质损失。该方法可用于来自不同年龄小鼠或不同脑区的小鼠脑组织裂解液，以研究棕榈酰化修饰的时空调控规律。

acyl-pegyl-exchange-gel-shift-assay-for-quantitative-determination

Research

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Biochemistry

生物化学

阿西尔-PEGyl交换凝胶移位测定，用于脑膜蛋白棕榈酸化定量测定

受调控的内吞作用决定了大多数膜蛋白在细胞表面的表达水平。本文中，我们利用可还原且不能透过膜的生物素化试剂，测定多拓扑膜蛋白——多巴胺转运体（DAT）的内吞速率。该方法为测定大多数质膜蛋白内吞速率提供了一种简便直接的途径。...

通过可逆生物素化测定质膜蛋白内吞速率

该视频展示了从小鼠脑组织中分离的细胞膜蛋白的棕榈酰化状态分析。该过程包括暴露非棕榈酰化的半胱氨酸并将其封闭，然后使用一种可结合棕榈酰化半胱氨酸的聚合物，从而有助于评估所分离蛋白的棕榈酰化状态。...

评估小鼠脑组织细胞膜蛋白的棕榈酰化状态

蛋白质棕榈酰化修饰的可逆性添加是细胞内蛋白质转运的重要调控机制。这一过程在神经元中尤为关键，因为许多突触蛋白均会发生棕榈酰化修饰。我们采用一种简单的生物化学方法来检测培养神经元中的棕榈酰化蛋白，该方法可适用于多种细胞类型和组织。...

海马神经元培养物中蛋白质棕榈酰化检测的免疫沉淀与酰基-生物素交换（ABE）法

神经元膜运输动态调控质膜蛋白的可用性，并显著影响神经传递。 迄今为止，在成年神经元中测量内吞运输仍具挑战性。 本文中，我们描述了一种高效且定量的方法，可在急性脑切片中体外（ex...

脑片生物素化：一种 离体 成年神经元中区域特异性血浆膜蛋白运输的测量方法

一种使用尿素/硫脲/SDS缓冲液从人和小鼠脑组织中提取蛋白质的常用方法，可实现通过二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）对蛋白质进行鉴定，并随后通过微型二维电泳免疫印迹法（mini 2DE...

共识脑源性蛋白质提取方案：用于人和小鼠脑蛋白质组研究的双向差异凝胶电泳与微型双向电泳免疫印迹法

使用酰基树脂辅助捕获法检测蛋白质S-酰化

本文介绍了一种灵敏的荧光检测方法，利用二酰基甘油肽和炔基磷脂作为底物，结合点击化学反应，用于监测载脂蛋白N-酰基转移酶的活性。...

基于点击化学的荧光检测法用于载脂蛋白N-酰基转移酶的酶学表征及高通量筛选

脂肪酰化研究在细胞蛋白质相互作用及疾病中具有重要意义。本文介绍了一种改进的检测脂肪酰化蛋白质的点击化学实验方案，该方法可应用于多种细胞类型，并可与其他实验技术联用，包括脉冲追踪实验和质谱分析。...

利用点击化学法检测脂肪酰化蛋白质的炔基脂肪酸类似物优化整合方法

本文描述了利用荧光脂质探针和脂质体来确定某种蛋白质是否提取并转运磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇4-磷酸的实验方案 体外.

基于荧光的膜间磷脂酰丝氨酸/磷脂酰肌醇-4-磷酸交换测量方法

我们介绍一种利用环糊精介导细胞质膜脂质与外源性脂质进行交换的方法。该技术可与研究跨膜蛋白的实验相结合，因为跨膜蛋白在类似脂筏的环境中和非脂筏样环境中的行为表现不同。...

活细胞中的脂质交换实验

本研究概述了对GFAP及其致病突变进行生化表征的实验方法，重点在于中间丝的组装、聚集以及翻译后修饰。通过对高纯度GFAP蛋白的分析，揭示了Alexander病发病机制的相关见解，可能为研究潜在治疗靶点以及理解GFAP突变及相关疾病提供框架。...

用于胶质纤维酸性蛋白及其疾病相关变异体生化分析的实验方法

了解阿西尔-PEGyl交换凝胶移位测定法，用于定量分析小鼠脑组织中的膜蛋白棕榈酰化状态。该方法无需亲和纯化，通过凝胶迁移率变化快速检测蛋白质修饰程度，为神经科学研究提供简便高效的生化工具。

用于定量测定脑膜蛋白棕榈酰化的酰基-PEG化交换凝胶迁移实验

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