Name: 神经活性的光遗传学操作，调节自由移动小鼠的行为 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: 了解光遗传学操作方法，通过植入光纤精确调控小鼠特定神经元群体，实现自由移动动物行为的高时空分辨率调节。该技术为神经环路研究提供强大工具。

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衷心感谢德国哥廷根马克斯·普朗克实验医学研究所的Klaus-Armin Narve教授和Sandra Goebbels博士慷慨提供Nex-Cre小鼠。同时，我们感谢视频团队成员Yunus Dikici和Ruben Wiesner为本文的JoVE视频进行拍摄和后期处理。此外，衷心感谢Kristin Claussen为视频提供配音，以及Kimberly Anne Go对稿件的校对工作。
所展示的结果在波鸿鲁尔大学获得，视频在不来梅大学录制。
本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）资助——项目编号 122679504 — SFB 874 以及 DFG MA 4692/3-2。

作者无任何利益冲突需要披露。

利用光来操控神经元信号传导近十年来一直是首选方法。自2005年以来，关于新型光遗传学工具开发4,6,8,14,49,50,51以及应用这些工具研究脑环路的研究论文数量显著增加21,23,40,43,52。一方面，由于可注射光遗传学工具、植入方式、转基因小鼠品系和行为学实验的种类极为丰富，实验的可能性多种多样且几乎不受限制；另一方面，选择实验条件时出错的可能性也很高，且实验具有高度特异性，往往难以与其他研究进行比较。
关键步骤 
本方案中一个重要的关键步骤是充分的规划。光遗传学工具的选择应与科学问题相匹配。是否仅需操控神经元或突触的整体活性？在这种情况下，商业化的工具如 ChR221,25,27 和 Arch37 是较好的选择。然而，如果需要操控特定的神经递质系统，甚至单个受体，则通常构建个体化受体嵌合体是更优的选择3,6。目前已有一些基于 GPCR 的受体嵌合体，即所谓的 Opto-XRs，以及构建这些嵌合体的指导方案可供使用4,50。除了光遗传学工具的选择外，小鼠品系与行为学实验的组合也至关重要。不同的背景品系，例如 C57Bl/6 和 BALB/cByJ，在某些方面表现出不同的行为表型53,54。C57Bl/6 小鼠的基础焦虑水平较低，适用于进行促焦虑性操控；而 BALB/cByJ 小鼠则表现出较高的焦虑水平，因此对具有抗焦虑作用的药物更为敏感。此外，这些背景品系的转基因变体在表型上也可能存在差异48。通过将特异性启动子与光遗传学工具及转基因小鼠品系进行合理组合，几乎可以靶向任意期望的细胞群体。
手术过程中的一个关键步骤是准确定位目标区域。借助小鼠脑图谱，可以确定结构在前后轴、内外侧轴以及深度上的正确坐标45。实际上，每只小鼠的颅骨在形态和大小上都略有差异。因此，在立体定位手术中，调整立体定位坐标的F因子46至关重要，同时必须正确固定鼻部和耳部。如果小鼠头部发生倾斜，注射套管将无法准确到达目标区域。
此外，注射套管的直径也非常关键。如果直径过小，则病毒无法释放到组织中；如果直径过大，则套管在到达目标区域的过程中会泄漏病毒溶液。如果植入的光纤末端正好位于目标区域上方，则皮层上方区域的病毒表达无关紧要。但如果植入位置位于其他区域之上以刺激轴突末梢，则上层皮层区域的轴突也会被光激活，从而干扰实验数据的准确性。例如：内侧前额叶皮层的下边缘区（IL）和前边缘区（PrL）均投射至基底外侧杏仁核55,56，但在焦虑调节中具有完全不同的功能和作用26,57。如果将植入物置于杏仁核上方以激活来自IL区的轴突末梢，而在注射过程中由于使用了不合适的注射套管，导致病毒溶液也进入了PrL区，则极有可能同时激活来自PrL区的轴突末梢，造成实验结果的混淆。
在准备颅骨以固定植入物时，少量使用底漆和粘合剂对于实现可靠且持久的固定至关重要。如果双组分粘合系统未薄层涂抹，牙科水泥可能在数天或数周后从颅骨上脱落。此外，在固定植入物前，颅骨必须完全干燥，否则水泥将无法与颅骨牢固结合。
本实验方案的行为学部分也存在一些关键步骤。首先，迷宫的构建非常关键。在各种行为学实验设置中，关于迷宫的尺寸、形状以及具体操作流程，文献中均存在多种不同的方案58,59,60。选择一种能够确保数据具有可比性和可重复性的方案至关重要。此外，还需考虑所使用小鼠品系的特殊要求43,48。从高架十字迷宫（EPM）的代表性数据可以看出，若干Nex-Cre小鼠在实验过程中曾从迷宫上跌落或多次滑脱（图2b）。对于这类小鼠，采用在开放臂周围加设低矮侧壁的迷宫设计将是更合适的选择。
其次，必须保持所有外部环境条件恒定61，否则不同组的小鼠将完全无法进行比较。在这方面，应选择实验装置空闲且实验人员始终在场的时间段进行实验，这一点非常重要。此外，还需考虑建筑物内的各种事件，例如施工、任何系统测试（如火灾报警系统）或小鼠设施的清洁日，以避免对所获得的数据造成干扰。
最后，动物的处理和饲养条件对行为学实验至关重要。当进行植入手术后，小鼠需要单笼饲养，以避免其他小鼠造成伤害。为了确保组间良好的可比性以及组内较低的误差，每只小鼠都必须拥有相同大小的笼具和相同的环境丰富化设施。在与焦虑相关的行为实验中，单笼饲养具有一些优势，因为单笼饲养的雄性小鼠表现出更低的基础焦虑水平、更小的焦虑水平变异以及更少的类抑郁症状15,16。而群养的雄性小鼠由于个体间的等级关系，其焦虑水平可能存在显著差异。除了饲养方式外，对所有小鼠及各组进行恒定且一致的处理同样重要。抓取小鼠以连接植入物上的光纤过程具有高度应激性，因此该操作必须对每只小鼠保持一致，即采用相同的技术和由同一名实验人员完成。此外，用于缓解小鼠在连接操作后应激状态的等待笼中的适应时间，也必须在持续时间、垫料和相对于迷宫的位置等方面保持一致。在动物设施内的日常操作也对后续行为表现具有重要影响。实验组与对照组动物不应在不同日期或由不同人员进行清洁，因为这同样会对小鼠造成应激。此外，清洁日不应与实验日重合，以避免行为结果的差异。
故障排除 
在实验过程中可能会出现若干问题。例如，在立体定位手术期间对颅骨钻孔可能会损伤血管。通常会出现明显出血，尤其是在前囟和后囟上方区域。如果发生这种情况，切勿使用棉签止血，因为棉签的吸水性可能导致血管出血进一步加剧；相反，应直接用氯化钠溶液冲洗。
也可能出现病毒溶液压力注射无法正常工作的情况。此时，可能是封口膜、颅骨钻孔处的结痂或脑组织堵塞了套管的尖端。在这种情况下，应缓慢将套管从脑组织中退出，且不改变X轴或Y轴位置，然后使用镊子去除套管尖端前端1-2 mm的部分。在重新插入套管之前，应通过施加少量压力测试其是否通畅，观察病毒溶液是否能从套管尖端流出。为避免堵塞，应以恒定速度下放套管，并在到达注射位点最深位置之前不要停止移动。如果去除的套管尖端过多导致直径过大，套管将损伤组织，并增加病毒一次性全部注入的风险。因此，务必仅小心去除被堵塞的部分尖端。
在行为学实验过程中，视频追踪软件（例如 Ethovision XT）中的实验设置可能会出现问题。例如，如果光输出无法正常工作，可能由多种原因导致。必须在打开 Ethovision XT 之前先启动 Pulser 程序，并对其进行编程和运行。在“实验设置”（步骤 3.2.2.4）中必须正确选择硬件。如果选择了错误的 IO-Box，或未选择“Custom Hardware”（自定义硬件），则 Ethovision 无法控制 Pulser 设备。如果光输出测试成功，但在数据采集过程中“试验控制设置”中编程的光刺激方案无法执行，则可能是子规则或子规则引用位置不正确，或条件与动作设置不明确。例如：该引用是否属于正确的子规则？引用是否正确编程（例如，子规则执行的次数是否设置正确）？
此外，可能会出现这种情况：在“检测设置”期间动物被正常追踪，但在数据采集期间却存在某些样本无法识别受试对象。此时，应检查实验室内照明是否发生变化，或是否有物体在迷宫内产生不必要的阴影。迷宫底部整体必须保持同一颜色，因为该设置仅适用于特定的单一组合。如果由于某些原因无法避免不同的底部颜色或阴影，则应在迷宫最暗的区域定义检测设置。
在首次获取动物数据后，若需更改任何设置，切勿在已使用的设置中直接应用这些更改，而应先复制设置后再进行调整。这意味着此前已记录的试验数据将不再适用于后续数据分析。在此情况下，应使用原始设置完成该实验组所有动物的记录，然后创建一个新的实验，用于分析已录制的视频，而非进行实时追踪。在这一“基于视频”的实验中，可使用多种设置进行分析，而不会影响动物之间甚至数据之间的可比性。
局限性与未来应用 
这种在自由活动动物中利用光遗传学操控行为的方法也存在一定的局限性。在手术过程中，两个植入物之间的距离受到限制。对于双侧植入，两个植入物之间的最小距离必须不小于用于固定植入物的装置宽度。这是因为在第一个植入物已经固定的情况下，装置需要将第二个植入物置入颅骨钻孔中。一种可能的解决方案是采用斜向植入，使玻璃光纤的尖端非常接近，而颅骨上方的陶瓷套管则保持较大的间距23,55,56,57,62,63。然而，斜向植入的一个缺点是光的扩散。当光纤尖端倾斜而非垂直植入时，所刺激的脑区会发生改变。因此，在两个目标区域彼此靠近的情况下，必须考虑光刺激位置的变化。
在行为学实验过程中，迷宫的构建可能会干扰连接到动物身上的光纤电缆。一些行为学测试，例如明暗箱实验，包含一个室内区域64,65，而其他类型的迷宫则包含小鼠需要进入的隔间。这类实验无法使用本实验装置进行。替代方案可能是采用无线系统22,26,66。但幸运的是，某些迷宫（例如巴恩斯迷宫）可以进行适当布置，使小鼠能够进入相关隔间67。
除了具有封闭区域的迷宫外，过宽的迷宫也可能导致问题。迷宫面积越大，为使动物能够到达迷宫中每个位置所需的电缆就越长。必须注意防止动物踩踏电缆或抓住并啃咬电缆。一种可能的解决方案是设计一个可卷收多余电缆的装置。但其缺点是，电缆展开时的阻力对小鼠而言过大，因此该方案更适用于大鼠。另一种可能的选择是在实验前而非实验过程中进行光刺激，当然，这仅在光刺激可产生长期效应的情况下才可行23。
与现有/替代方法的比较 
替代方法包括在行为过程中进行化学或电刺激8,18。化学激动剂或拮抗剂可通过特异性受体激活或抑制神经元，并且还可调控单一神经递质系统38,68。一方面，化学物质的受体特异性较高，因为特异性激动剂或拮抗剂仅激活特定受体39；另一方面，对于同一神经递质类别的受体亚型，其特异性往往不足。大多数化学物质会以不同概率结合至少两种受体亚型69。此外，只要神经元具有相同的受体类型，化学方法便无法区分不同的神经元细胞类型。除此之外，与光遗传学相比，化学操控在时间和空间分辨率上均较差。激动剂或拮抗剂通常通过口服35或全身注射57,70给药。如果将化学物质直接注入脑组织，其效应比口服给药更快，但仍比光刺激慢。由于所给予的化学物质会在脑内扩散，并且对神经元类型或脑区不具特异性，因此无法实现对特定脑环路的精确操控。
电刺激的时间分辨率高于化学刺激9,14。电刺激在神经组织中的扩散范围小于化学刺激，且空间分辨率优于化学刺激。然而，电刺激无法特异性地作用于不同类型的神经元或受体类型，因为电极附近的每一个神经元都会对电刺激产生反应。
研究自由活动小鼠行为的替代方法包括脑切片中的电生理记录，在该方法中可通过光遗传学调控单个神经元或轴突，并利用记录电极测量所引发的效应6,71。体外实验能够探究光遗传刺激的分子与细胞基础，但其局限性在于缺乏固有的神经连接以及其他脑区的输入。另一种选择是将光遗传学与多光子成像结合使用1,72。在此情况下，小鼠头部被固定，可处于麻醉状态或清醒状态下完成简单任务。
要成功开展光遗传学实验，目前可使用的工具和应用非常广泛。选择合适的光遗传学工具和行为学实验装置，对于回答特定的研究问题至关重要。若选择了正确的工具组合与实验方案，光遗传学能够以前所未有的时间与空间分辨率，深入探究神经环路，从而有助于理解精神类疾病和认知功能，并推动新型治疗策略的开发。

中枢神经系统中神经元环路的调控及其行为学结果对于理解大脑功能至关重要，尤其是在精神类疾病以及学习和记忆等认知任务中。利用光遗传学技术，可以通过光来调控单个细胞或细胞群体，直至整个神经环路。常用的光遗传学工具如通道视紫红质2（ChR2）或古紫红质（Arch），能够激活或抑制神经元，或在投射到特定脑区的轴突末梢处增加或抑制神经递质的释放1,2,3,4。然而，使用Arch时需格外谨慎，因其在突触前末梢激活时可增加自发性神经递质释放5。Arch是一种外向整流质子泵，可改变细胞内的pH值。这种碱性环境会诱导钙离子内流，从而增强神经递质的释放5。为了特异性地调控细胞内信号通路，可构建受体嵌合体，该嵌合体由光可激活的光遗传学工具（如视紫红质或视锥蛋白）与适当的G蛋白偶联受体组合而成6,7,8。在过去十年中，可用的光遗传学工具在数量和种类上均显著增加9。
光遗传学的目的是在动物行为过程中调控神经环路。光遗传学技术能够实现对急性行为变化的测量，例如焦虑相关行为的改变。光遗传学工具通过病毒载体递送至大脑的特定靶区。借助特殊的启动子和增强子，或Cre-loxP系统，可确保光遗传学工具在特定细胞类型中表达（图1A）。目前已开发出多种基因修饰小鼠品系，仅在特定细胞类型中表达Cre重组酶。例如，Nex-Cre小鼠在Nex启动子的调控下，仅在大脑皮层和海马的锥体神经元中表达Cre-Recombinase10。该酶能够识别并翻转两侧带有loxP位点的DNA序列11。因此，只有表达Cre-Recombinase的神经元才能转录位于两个loxP位点之间且已被翻转的双floxed光遗传学工具，而其他类型的神经元则不能12,13。在Nex-Cre小鼠中，光遗传学工具仅在锥体神经元中表达。随后通过在目标脑区上方长期植入光纤，实现对特定脑区的光刺激。动物可连接至合适的光源，在几乎各类行为学实验中自由活动。
<img alt="通过病毒注射、光纤装置和脑区示意图实现神经元激活的光遗传学方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：注射与植入。 A) ChR2-YFP 的 Cre-loxP 系统。双 floxed 光遗传学工具被包装在腺相关病毒（AAV）中，用于注射至脑组织。 B) 病毒注射及光学神经接口植入小鼠前额叶皮层（mPFC）IL 区域上方/内部的矢状面示意图。注射与植入均从上方进行。所有目标区域，包括 IL、BLA 和 DRN，均已标出。 C) 植入式光纤、套管及光源的详细结构示意图。 D) 从一根 200 µm 光纤发出的蓝光和红光在灰质脑组织中的扩散范围（Yizhar 等，2011）。蓝光在组织中的最大扩散距离为 0.5 mm，红光约为 1 mm。颜色编码：红色表示光强达到该区域最大值的 50%，黄色为 10%，绿色为 5%，蓝色为 1%。 E) 在左侧 IL 区域正上方单侧植入 200 µm 光纤的冠状面示意图。每个半球的 IL 区域宽度为 0.25 mm，深度为 0.2 mm。蓝光和红光灯泡图标表示光强扩散至 5% 的边界范围，该数据根据 Yizhar 等人的研究换算至实际尺寸。LoxP：P1 交叉位点；ChR2：通道视紫红质；YFP：黄色荧光蛋白；dflox：双 floxed；IL：下边缘皮层；BLA：基底外侧杏仁核；DRN：背缝核；PrL：前边缘区域。本图改编自 Berg 201948。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
光遗传学方法被广泛应用，因其兼具高时间分辨率和高空间分辨率14，并可实现特定细胞类型的调控。此外，植入装置可重复使用，无需额外处理。在立体定位手术中完成携带光遗传工具的腺相关病毒注射以及光纤植入后，小鼠需恢复两周。我们选择仅两周的恢复时间，因为该时长已足以使小鼠从手术中恢复，并确保病毒充分表达。由于行为学实验之后需进行免疫组织化学分析，我们必须确保小鼠在实验过程中不会年龄过大，否则组织质量将下降。小鼠在植入后未表现出明显的行为障碍，并能进行典型的笼内活动。当然，植入手术伴随显著的外科损伤，因此需对小鼠进行密切监测。术后小鼠需单笼饲养，因为群养小鼠倾向于相互损伤新鲜伤口和植入物。然而，饲养条件对雄性小鼠的焦虑水平具有显著影响，单笼饲养的小鼠表现出较低的焦虑水平15，且总体上更少出现类似抑郁的症状16。
化学或电学手段对脑环路的操控缺乏光遗传学所具有的高细胞类型特异性，且在时间和空间分辨率上也较低14,17,18。根据具体的研究问题，电刺激或化学刺激可能具有不同的优势。当需要同时刺激某一特定脑区内的纤维终末时，电刺激是最适宜的方法；而当需要通过激动剂激活某一完整脑区内特定的递质受体时，化学刺激则是较好的选择。相较于化学或电刺激，光遗传学的另一显著优势在于，神经元在体内天然情况下对光不敏感，从而避免了副作用的发生19。尽管如此，高强度的光照可能引起热效应8,20，但通过设置适当的对照组，可排除由光遗传操控引起的非特异性行为学效应。
利用光遗传学技术研究啮齿类动物行为，尤其是在精神疾病相关领域，已取得显著进展，该技术能够在自由活动的动物体内直接调控单个受体乃至特定的细胞群体21和神经环路22。能够测量此类调控的急性效应，以及在特定时间点23或慢性刺激后24的长期行为效应，使实验设计具有高度灵活性，并为脑环路提供极为细致的洞察。光刺激可用于调控光遗传工具注射部位的神经元。当注射与植入靶向同一脑区时，可作用于该区域内主神经元和中间神经元的胞体及其反向投射的轴突3,6,8。然而，光导纤维也可植入与注射部位不同的脑区。在此情况下，光刺激可调控注射区域投射靶区中轴突末梢的神经递质释放25,26,27。
本研究中，采用光遗传学技术结合行为实验来分析与焦虑相关的行为。与焦虑相关的精神性疾病影响了全球超过三分之一的人口28,29,30，并造成巨大的经济负担31。患者常表现出觉醒感、紧张和担忧，并继而出现回避行为32,33。这些持续出现的负面情绪主要针对未来事件34，严重干扰患者的日常生活。常用的治疗方法，如苯二氮䓬类药物或选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs），仅对部分患者有效。大量患者对治疗完全无反应35，表明此类疾病的潜在机制尚未被充分阐明。内侧前额叶皮层（mPFC）已被证实对焦虑的发生和发展具有重要作用21,25,27,36,37,38。特别是，mPFC中的下边缘皮层（IL）区域的过度激活可能与焦虑相关障碍有关39,40。本文所描述的示例实验有助于理解mPFC的IL区域的调控如何影响焦虑行为。此外，该研究还可能为开发焦虑相关精神疾病的新治疗策略提供支持。
使用2-6个月大的雄性Nex-Cre小鼠，在mPFC的IL脑区内的锥体神经元中特异性表达ChR241。Nex-Cre小鼠品系背景为C57Bl/6，可在锥体神经元中特异性表达Cre重组酶。在立体定位手术过程中，通过腺相关病毒载体将双floxed的ChR2-DNA注射至IL区域。光遗传学植入物置于目标区域正上方（图1B），并用牙科水泥固定。对照动物在同一区域注射双floxed的tdTomato-DNA，以模拟细胞特异性表达。
动物在手术前群养，手术后单笼饲养，以避免其他小鼠造成伤害。单笼饲养的小鼠置于独立通气笼（IVC）架中的TypI-L笼具中。光照-黑暗循环采用12:12 h节律，光照期从上午10点开始。所有行为学实验均在黑暗期进行，此阶段相当于啮齿类动物的活跃期。水和标准饲料颗粒均自由供应。经过两周恢复期后，以确保锥体神经元中ChR2的充分表达，小鼠即可用于行为学实验。
开放旷场（Open Field, OF）是一个50 cm × 50 cm的方形迷宫，四周为40 cm高的喷砂墙壁。地面被划分为16个方格，其中内部的4个方格代表中心区域。测定的行为指标包括：1）在中心区域停留的时间，2）进入中心区域的次数，以及3）总移动距离。本实验共包含4个试验阶段，总计20分钟。在第1和第3个试验阶段不进行光刺激，而在第2和第4个试验阶段施加20 Hz的刺激，光脉冲持续时间为5 ms，光强度为1 mW，波长为473 nm（图2A）。在后续的试验阶段中考虑了动物对测试环境的适应性，而使用假注射对照组动物可揭示这种适应性的具体表现。
Barnes迷宫是一种用于研究学习与记忆的实验。该装置是一个直径为92 cm的圆形平台，周边均匀分布着20个等距的孔洞，其中19个孔洞封闭，另一个孔洞下方放置一个逃逸箱。连续4天，小鼠每天进行4次训练试验，以学习逃逸箱的位置。第5天进行一次记忆测试。th 第1天，移除逃生箱，测试小鼠找到正确孔洞所需的时间。测量的行为指标包括：1）找到逃生箱/正确孔洞所需时间；2）目标孔洞访问次数及错误次数；3）进入逃生箱前所移动的距离。不同组别的光刺激分别在训练第1-4天的获取（acquisition）或巩固（consolidation）阶段进行，或在第5天测试日的记忆提取（retrieval）阶段进行。图 2D).
<img alt="旷场实验、高架十字迷宫、巴恩斯迷宫示意图，详细说明实验时间序列。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：结合光遗传学方案的行为学实验。A) 旷场实验的示意图及其对应的光刺激方案。C) 高架十字迷宫实验的示意图及其对应的光刺激方案。D) 巴恩斯迷宫实验的示意图及其对应的光刺激方案。EPM：高架十字迷宫；OF：旷场实验；BM：巴恩斯迷宫测试。本图经修改自 Berg 201948。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
进行光遗传学刺激时，需根据所使用的光遗传学工具及目标神经元类型，调整光照强度和频率。应使用尽可能低的光照强度，以避免对组织造成损伤，已有研究表明高强度光照可能引起组织发热效应8,20。对于ChR2，通常采用20 Hz频率、每次5 ms光脉冲的刺激方案2。由于ChR2对光敏感度较高，1 mW的光照强度已足够。光刺激方案应交替设置“光照关闭”与“光照开启”试验，以直接测量行为变化。行为学实验期间，整个实验动物群体所处的外部环境条件应保持稳定。需关注的关键条件包括噪音（注意实验设备本身可能产生噪音）、气味（始终使用乙醇清洁行为学装置）、光照强度以及实验操作者。实验操作者应始终保持为同一人。此外，同一组动物的所有实验应在每天相同的时间段进行，建议选择在动物设施黑暗期开始后数小时进行。
本实验的目标是通过强烈激活兴奋性锥体神经元，提高内侧前额叶皮层（IL）区域的兴奋/抑制（E/I）比率。已知该特定皮层区域的E/I比率升高会增加小鼠的焦虑水平40,42,43,44。

<table><tbody><tr><td>氯胺酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2753-64</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>20% 葡萄糖</td><td>AlleMan Pharma</td><td></td><td>皮下注射以快速恢复</td></tr><tr><td>行为迷宫</td><td>定制</td><td></td><td>测量焦虑行为</td></tr><tr><td>贝潘廷</td><td>Bayer</td><td></td><td>眼科软膏</td></tr><tr><td>贝塔碘伏</td><td>Monodipharma</td><td></td><td>含碘消毒剂</td></tr><tr><td>贝塔碘伏</td><td>Monodipharma</td><td></td><td>碘软膏</td></tr><tr><td>双目显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ52, 110AL0.62x WD160</td><td>手术使用</td></tr><tr><td>陶瓷套管</td><td>Thorlabs</td><td>CFLC230-10</td><td>植入物</td></tr><tr><td>陶瓷光纤刻划笔</td><td>Thorlabs</td><td>CSW12.5</td><td>切割玻璃光纤</td></tr><tr><td>通道视紫红质2-YFP病毒</td><td>Penn Vector Core</td><td>Addgene 20298</td><td>光遗传学工具</td></tr><tr><td>压缩空气</td><td>Kontakt Chemie</td><td>Druckluft 67</td><td>干燥颅骨</td></tr><tr><td>坐标系统</td><td>Stoelting</td><td></td><td>手术用立体定位坐标</td></tr><tr><td>Correl Draw</td><td></td><td></td><td>图形软件版本13</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>MICROM</td><td>HM500OM</td><td>制备用于染色的脑切片</td></tr><tr><td>Ethovision XT 14</td><td>Noldus</td><td></td><td>行为追踪软件</td></tr><tr><td>Excel</td><td></td><td></td><td>统计软件</td></tr><tr><td>套管抛光夹具</td><td>Thorlabs</td><td>D50-F</td><td>抛光植入物圆面</td></tr><tr><td>双头光纤跳线</td><td>Prizmatix</td><td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td><td>用于连接双侧植入物的电缆</td></tr><tr><td>单头光纤跳线</td><td>Prizmatix</td><td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm</td><td>通过套管连接植入物的电缆</td></tr><tr><td>光纤剥除工具</td><td>Thorlabs</td><td>T06S13</td><td>剥离用于植入的玻璃光纤</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>VWR European</td><td>516-0300</td><td>裁剪成小片用于新奇抑制摄食实验</td></tr><tr><td>食物颗粒</td><td>M&amp;uuml;hle Levers</td><td>H&amp;ouml;veler Nagerfutter</td><td>小鼠营养饲料</td></tr><tr><td>玻璃移液管</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC150-10</td><td>注射移液管</td></tr><tr><td>Gradia direct-Flo</td><td>Henry Schein</td><td>103322</td><td>流动型牙科水泥</td></tr><tr><td>加热灯</td><td>efbe-Schott/Phillips</td><td>R95E</td><td>防止小鼠术后体温过低</td></tr><tr><td>加热板</td><td>Stoelting</td><td></td><td>集成于坐标系统中</td></tr><tr><td>注射套管</td><td>Braun</td><td>100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20</td><td>用于所有注射及颅骨钻孔</td></tr><tr><td>垫料</td><td></td><td>T 1350</td><td>新奇抑制摄食实验中的接地材料</td></tr><tr><td>小鼠笼具</td><td>Zoonlab</td><td>405 cm^2</td><td>实验用单只饲养</td></tr><tr><td>Optibond FL</td><td>Kerr</td><td>26684E</td><td>植入前颅骨处理</td></tr><tr><td>光学玻璃光纤</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>用于植入的导光光纤</td></tr><tr><td>Optogenetics-LED.STSI</td><td>Prizmatix</td><td></td><td>行为实验中光刺激用光遗传学工具箱</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td>灌流小鼠以取出脑组织</td></tr><tr><td>粒径0.02 &amp;micro;m抛光片</td><td>Thorlabs</td><td>LFCF</td><td>抛光植入物圆面</td></tr><tr><td>粒径1 &amp;micro;m抛光片</td><td>Thorlabs</td><td>LF1D</td><td>抛光植入物圆面</td></tr><tr><td>粒径30 &amp;micro;m抛光片</td><td>Thorlabs</td><td>LF30D</td><td>抛光植入物圆面</td></tr><tr><td>粒径6 &amp;micro;m抛光片</td><td>Thorlabs</td><td>LF6D</td><td>抛光植入物圆面</td></tr><tr><td>脉冲控制软件</td><td>Prizmatix</td><td></td><td>光刺激设备控制软件</td></tr><tr><td>Rimadyl-卡洛芬</td><td>Zoetis</td><td></td><td>镇痛剂</td></tr><tr><td>Sigma Plot</td><td></td><td></td><td>统计分析软件</td></tr><tr><td>套管</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>连接植入物与光缆</td></tr><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>Braun</td><td>3570410</td><td>冲洗颅骨</td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>Pattex Henkel</td><td></td><td>将玻璃光纤固定于套管内</td></tr><tr><td>td-Tomato病毒</td><td>Penn Vector Core</td><td>Addgene 51503</td><td>光遗传学工具</td></tr><tr><td>紫外光</td><td>KoQGHJ</td><td>无线, 1200 mW/cm^2</td><td>牙科水泥聚合用光源</td></tr><tr><td>Xylavet-赛拉嗪</td><td>cp pharma</td><td></td><td>麻醉剂</td></tr></tbody></table>

光遗传学操控神经元活动以调节自由活动小鼠的行为

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

在自由活动的小鼠中，光遗传学调控神经环路可影响其急性和长期行为。该方法能够对单个神经元和特定脑区的神经递质释放进行操控，直至调控中枢神经系统中的完整神经环路，并允许直接测量行为学结果。通过注射携带特定DNA（如通道视紫红质2（ChR2））的病毒载体，使神经元表达光遗传学工具。通过慢性植入的光学器件将光导入特定脑区，其末端直接位于目标区域上方。经过两周的恢复期并确保光遗传学工具充分表达后，可对小鼠重复进行行为学测试，并在测试中对目标神经元实施光遗传学刺激。
与常用的化学或电刺激方法相比，光遗传学调控具有高时空分辨率，并可实现高度的细胞特异性。光刺激不会损伤神经组织，因此既可用于长期实验，也可用于同一只小鼠的多次行为学实验。光遗传学工具的应用潜力几乎无限，能够实现通过光来激活或沉默整个神经元，甚至操控特定类型的受体。
通过整合光遗传学刺激的行为学实验结果，可直接可视化由干预引起的行为变化。以同一动物在无光照刺激条件下的行为作为基线，是检测诱导性变化的良好对照。这有助于详细解析参与特定行为（如焦虑）的神经元类型或神经递质系统。通过对神经网络进行长期刺激或在光刺激后开展行为观察，还可深入研究神经网络的可塑性。光遗传学技术将有助于阐明多种神经系统疾病中的神经信号机制。

本实验方案的目的是在光遗传学实验中测量基因改造小鼠行为的变化。通过注射腺相关病毒载体进行光遗传学操控。通过在目标脑区上方植入光纤，可在自由活动的小鼠中实现光刺激。
在图4中展示了光遗传学实验的结果。通过ChR2对mPFC的IL区域中兴奋性锥体神经元进行强烈激活，导致小鼠在敞箱实验中焦虑相关行为增加。在Nex-Cre小鼠的mPFC的IL区域注射ChR2，以实现其在锥体神经元中的表达（图4A）。在两项焦虑行为测试——敞箱实验（图4B,C）和新奇抑制摄食实验（图4F,G）中，使用蓝光刺激ChR2以激活锥体神经元。作为对照，另一组小鼠在相同脑区注射荧光蛋白tdTomato代替ChR2（图4D,G）。在此类实验中，焦虑行为定义为对较明亮中央区域的回避。小鼠天生会回避开阔区域，因其对捕食者存在焦虑。
在开放旷场实验中（如图4B所示），小鼠共进行了4次试验，每次持续5分钟。在第1次和第3次试验中未施加光刺激（Off1,2），而在第2次和第4次试验中施加了蓝光刺激，频率为20 Hz（光脉冲时长5 ms），光强为1 mW（On1,2）。热图显示，在实验组中，中心区域停留时间在关光和开光试验之间存在差异。在光刺激期间，小鼠更倾向于停留在边缘区域。对照组动物也偏好边缘区域，但在光刺激下其行为未发生改变。在图4C中展示了实验组在开放旷场实验期间的主要行为学指标。若数据通过Shapiro-Wilk正态性检验，则采用独立双尾t检验进行统计分析；若未通过正态性检验，则采用非参数的Mann-Whitney秩和检验作为替代方法。对于此类实验，采用组内比较策略，以探究光刺激是否能够直接随时间改变焦虑相关行为，而不受实验组与对照组基线焦虑水平差异的影响。结果显示，在两次光刺激试验中，中心区域停留时间均显著减少，表明焦虑水平升高；总移动距离未发生改变，说明运动行为未受影响；进入中心区域的次数有所增加，但未达到统计学显著性。在图4D中展示了对照组的数据。对照组动物在关光与开光试验之间各项分析参数均未表现出任何行为学变化，表明光刺激或植入操作本身并未引起所观察到的行为效应。综上所述，该实验表明通过ChR2激活内侧前额叶皮层（IL）锥体神经元时，光刺激可导致焦虑水平升高。
在图5中展示了在高架十字迷宫（Elevated-Plus Maze）中一次不成功的光遗传学实验数据。在高架十字迷宫实验中（见图5A），小鼠共完成了6次试验，每次持续3分钟。在第1、3和5次试验中未进行光刺激（Off1、Off2、Off3），而在第2、4和6次试验中进行了蓝光刺激，频率为20 Hz（光脉冲时长5 ms），强度为1 mW（On1、On2、On3）。在这些示例性结果中，光遗传学实验方案的持续时间以及迷宫本身的结构并不适用于该转基因小鼠品系。在图5B中可见，多只小鼠在实验过程中后肢滑出迷宫边缘，甚至跌落。一旦发生跌落，小鼠将在次日获得一次重新进行高架十字迷宫实验的机会；若再次跌落，则该小鼠将被排除在分析之外。若小鼠多次滑出但最终仍能留在迷宫上完成实验，则其数据将正常纳入分析。然而，此类数据必须谨慎解读，对照组动物的作用因此显得尤为重要。Nex-Cre小鼠在狭窄的开放臂上表现出运动困难，难以维持平衡。为避免此类情况，可在迷宫臂边缘设置高度为1 cm的小型侧壁，以帮助小鼠后肢在迷宫臂上获得更稳固的支撑。热图和图表均显示，实验组和对照组小鼠从第2次试验（On1）开始即表现出对开放臂的回避行为（图5C-E）。两组小鼠在开放臂上的停留时间均显著减少，进入开放臂的次数也显著下降。若仅分析实验组数据，结果将提示光刺激具有显著的促焦虑效应，因为在On1试验期间，小鼠在开放臂上的停留时间及进入次数均显著降低。然而，当与表现出相同行为模式的对照组进行比较时，可以明确观察到的行为并非由光遗传学刺激介导，而是由于小鼠对迷宫环境的习惯化，普遍回避开放臂所致。该结果强调了设置适当对照组的重要性，以区分由光遗传学刺激引起的行为效应与可能的行为适应。同时，该数据也突显了根据特定小鼠品系和具体科学问题，合理优化实验设计的必要性。
为验证并加强所收集的行为学数据，在最后一次实验后取出小鼠脑组织，以确认注射和植入位置的准确性图6）。脑组织用4%多聚甲醛固定后从颅骨中取出，置于30%蔗糖溶液中脱水1-2天，随后进行冷冻切片。 40 µm 厚的冠状脑切片经洗涤后，使用含DAPI的封片剂封固于SuperFrost载玻片上，DAPI可对细胞核进行染色，从而实现冠状切片中目标区域的识别。YFP标签或tdTomato自身的荧光信号可指示病毒注射部位的位置。在 图 6B 左侧为ChR2-YFP的示例注射位点（黄色），右侧为tdTomato的示例注射位点（红色）。借助源自Paxinos和Franklin的模板45 小鼠脑图谱中，可以识别出IL区域。在两张切片中，光遗传学工具均在IL区域表达，但在邻近的脑区也有表达。为准确解读结果，需参考蓝光在脑组织中的扩散情况8 (图1D，E）。可以看出，蓝光到达IL下方的DP区域时，其光强仅剩光纤尖端初始1 mW光强的不到5%（蓝线） 图1D)8此外，由于背向散射，少量光线可能向上进入PrL区域47因此可以说，IL 区域受到的光照最强，但邻近的 DP 和 PrL 区域也可能受到轻微刺激。因此，无法确保仅对 IL 细胞进行特异性刺激，应通过免疫组织化学分析检测邻近区域，以确定 PrL 和 DP 细胞的活动是否受到光照调节。在 图6C另一个重要的对照显示了Nex-Cre小鼠品系的特异性。通过对IL区域内的两种细胞类型——谷氨酸能主神经元和GABA能中间神经元——进行抗体染色，可以看出ChR2-YFP的表达仅出现在谷氨酸能神经元中，而不在GABA能神经元中。
总之，我们的实验表明，在行为测试期间通过光遗传学操控，可以观察到焦虑相关行为的变化。通过使用多种测试方法评估同一行为，能够得出可靠的结论。此外，免疫组织化学分析进一步证实了所获得的数据。我们的实验提示，在特定检测中，下边缘皮层锥体神经元的特异性激活会增加焦虑相关行为。
<img alt="小鼠脑部注射、行为分析图和活动热图的光遗传学实验示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig04v4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：IL 锥体神经元的光遗传学激活增加焦虑样行为。 实验中的光刺激参数：473 nm，1 mW，20 Hz 刺激。 A) 将 ChR2-YFP 或 tdTomato 注射并植入 IL 区域的示意图。在实验过程中，通过 ChR2 激活 mPFC 的 IL 区域中的锥体神经元。冠状脑切片图改编自 Paxinos 和 Franklin 小鼠脑图谱，冠状面：外侧 o,6。 B) 开放旷场迷宫实验中的光刺激方案（20 分钟，4 次 5 分钟交替的“关”和“开”试验；左侧），以及实验中代表性 ChR2 注射小鼠（EXP）和 tdTomato 注射小鼠（CT）的热图（右侧）。在蓝光激光刺激下，EXP 动物在开放旷场中心区域停留的时间更短。对于 CT 动物，中心区域停留时间在光“关”和“开”试验之间无差异。 C) EXP 动物在开放旷场中的群体数据，n=11。在蓝光刺激下，小鼠在开放旷场中心停留的时间显著减少（关1：39.49±6.9 秒，开1：19.87±4.47 秒，关2：28.13±8.55 秒，开2：23.42±9.32 秒；关1:开1，t 检验，p = 0.033，*；关1:开2，MWRS，p=0.049，*）。移动距离未受影响（关1：2703.09±292.65 cm，开1：3113.4±491.15 cm，关2：3331.86±482.62 cm，开2：3082.17±658.61 cm）。进入中心区域的次数随时间减少，但无显著差异（关1：22.36±3.78，开1：18.45±3.95，关2：17.36±1.99，开2：13.27±2.64）。 D) CT 动物在开放旷场中的群体数据，n=15。小鼠在开放旷场中心停留的时间、移动距离、进入中心区域的次数在光“开”和“关”试验之间均无变化（中心时间：关1：16.73±2.65 秒，开1：16.02±1.89 秒，关2：12.02±1.76 秒，开2：13.04±2.58 秒；移动距离：关1：3399.69±296.77 cm，开1：3210.6±446.9 cm，关2：3030.28±513.83 cm，开2：2955±617.7 cm；进入中心次数：关1：14.2±1.98，开1：13.6±2.02，关2：10.8±1.88，开2：11.67±2.5）。CT 小鼠表现出显著更高的基线焦虑水平（关1 EXP:CT，MWRS，p=0.005，**）。数据以均值±标准误表示。* 表示显著差异（p≤0.05），** 表示显著差异（p≤0.01）。t 检验均为双尾检验，MWRS：Mann-Whitney 秩和检验；IL：下边缘皮层；BLA：基底外侧杏仁核；DRN：背缝核；OF：开放旷场；CT：对照动物；EXP：实验动物；L：光。本图改编自 Berg 等 2019，PLoS One43 及 Berg 201948。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="高架十字迷宫示意图及图表显示行为分析、滑落比例、动物运动轨迹。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig5v4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：EPM 实验未能显示 Nex-Cre 小鼠的行为效应。实验期间的光刺激参数：473 nm，1 mW，20 Hz 刺激。 A) 高架十字迷宫实验中的光刺激方案（18 分钟，6 次 3 分钟周期，交替进行“关闭”和“开启”试验）。 B) 包含“滑落”小鼠的群体数据，总计 n=23。Nex-Cre 小鼠倾向于在开放臂上用后肢滑落，且与实验分组无关（左图）。后续分析仅纳入在全部 6 次试验中均未从迷宫滑落的小鼠。在第一个“关闭”阶段（Off1）发生滑落的小鼠，后续更倾向于回避开放臂（Off1 实验组 1.63±0.6，对照组 2.2±0.79；Off2+3 实验组 0.125±0.125，对照组 0±0；On1+2+3 实验组 0.625±0.26，对照组 0.1±0.1）。右侧饼图显示，在 18 分钟实验期间有 42.42% 的小鼠从迷宫滑落，仅有 57.57% 完成了全部实验。 C) 实验组（EXP）和对照组（CT）代表性小鼠在全部 6 次试验中的热图。两组均在 Off1 试验后表现出开放臂停留时间减少。 D) EPM 实验中实验组（EXP）小鼠的群体数据，n=12。在开放臂停留的时间在前两次试验中显著下降，之后保持较低水平（Off1 73.91±12.22 s，On1 36.15±14.65 s，Off2 15.61±6.23 s，On2 19.49±7.51 s，Off3 9.36±4.44 s，On3 7.96±3.47 s。Off1 与 On1 比较，t 检验，p=0.041，*）。移动距离未受影响（Off1 679.96±71.63 cm，On1 712.24±112.82 cm，Off2 717.49±97.39 cm，On2 782.51±81.11 cm，Off3 722.11±68.60 cm，On3 663.90±106.57 cm）。进入开放臂的次数从 Off1 到 On1 显著减少，之后保持稳定（Off1 8.08±1.08，On1 3.33±0.76，Off2 2.16±0.69，On2 2.91±1.09，Off3 1.73±0.75，On3 1.73±0.66。Off1 与 On1 比较，t 检验，p=0.002，**）。在 EPM 中心区域停留的时间随试验进程逐渐减少，但在“关闭”与“开启”试验之间无显著差异（Off1 41.71±5.34 s，On1 31.2±4.59 s，Off2 19.8±3.44 s，On2 24.49±3.38 s，Off3 20.37±4.77 s，On3 18.85±4.07 s）。 E) EPM 实验中对照组（CT）小鼠的群体数据，n=11。对照组数据与实验组数据表现出相同的显著下降趋势，表明该实验未能成功实现预期效果（开放臂停留时间：Off1 86.92±12.74 s，On1 33.78±14.38 s，Off2 18.01±11.61 s，On2 16.41±9.61 s，Off3 11.36±4.01 s，On3 5.43±2.07 s。Off1 与 On1 比较，MWRS 检验，p=0.009，**；移动距离：Off1 705.11±88.36 cm，On1 789.45±77.53 cm，Off2 724.74±80.49 cm，On2 676.57±111.99 cm，Off3 716.99±132.47 cm，On3 663.03±132.46 cm；开放臂进入次数：Off1 7.09±1，On1 3.72±1.17，Off2 1.45±0.47，On2 1.36±0.58，Off3 0.91±0.43，On3 1.64±0.59。Off1 与 On1 比较，MWRS 检验，p=0.01，*；中心区域停留时间：Off1 35.89 s，On1 29.25±3.96 s，Off2 22.17±3.58 s，On2 15.9±2.57 s，Off3 13.86±4.2 s，On3 16.89±5.75 s）。数值以均值 ± 标准误（S.E.M.）表示。* 表示显著差异（p≤0.05），** 表示极显著差异（p≤0.01）。t 检验均为双尾检验，MWRS：Mann-Whitney 秩和检验；EPM：高架十字迷宫；CT：对照动物；EXP：实验动物；OA：开放臂。本图改编自 Berg 等 2019，PLoS One43 及 Berg 201948。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠脑图谱与显微镜图像；DAPI染色；PrL、IL、DP区域；神经成像分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：IL区ChR2与tdTomato的注射侧及Nex-Cre小鼠的特异性。A） 在冠状脑切片上（前囟点AP +1.66 mm，内侧-外侧mL 0.3 mm，背侧-腹侧DV -1.8 mm）单侧注射与植入位点的示意图（改编自小鼠脑图谱Paxinos和Franklin，前囟点Bregma +1.54 mm）。B） Nex-Cre小鼠中ChR2-YFP（左侧，黄色）和tdTomato（右侧，红色）的典型注射位点，与DAPI染色的细胞核（蓝色）合并显示。比例尺：1 mm。插图为IL区域的高倍放大图像，比例尺：150 µm。白色方框指示插图位置。C） 上排：Nex-Cre小鼠左侧IL区域的共聚焦图像，使用CamKII作为谷氨酸能神经元标记物（蓝色），以及ChR2-YFP（黄色）或Gad67作为GABA能神经元标记物（绿色）。下排：ChR2-YFP（黄色）与CamKII（左侧，蓝色）共定位，但不与Gad67（右侧，绿色）共定位，表明Nex-Cre小鼠对谷氨酸能神经元具有特异性。比例尺：50 µm。PrL：前边缘皮层；IL：下边缘皮层；DP：背侧束旁皮层。本图改编自Berg等2019年发表于PLoS One43，以及Berg 201948。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

通过光遗传学手段操控特定的神经元群体或脑区，可在自由活动的动物中以高时空分辨率调控其行为。结合不同类型的光遗传学工具与慢性植入的光纤，可实现多种神经调控及行为学检测。

在自由活动的小鼠中，光遗传学调控神经元回路可影响其急性及长期行为。该方法能够对……进行操控

通过光遗传学手段操控特定的神经元群体或脑区，可以在自由活动的动物中以高时空分辨率改变其行为。结合不同类型的光遗传学工具与慢性植入的光纤，可实现多种神经调控和行为学测试。光遗传学的最终目标是在活体动物行为过程中，以高时空分辨率调控神经环路。与药理学或电学操控方法不同，光遗传学技术能够对神经环路中的特定细胞类型实现精确控制。光遗传学是针对行为过程中特定脑区内的特定细胞类型进行靶向干预，并深入研究这些微环路变化所产生直接效应的理想方法。接下来，我们将逐步介绍如何在自由活动的小鼠中进行光遗传学实验的准备、植入及操作流程。制备光学植入物时，将陶瓷插芯的平面朝上放置于台钳中。使用光纤剥线工具剥离直径为200微米的玻璃光纤的涂覆层，并用陶瓷光纤刻划笔截取两到三厘米长的光纤段。将截好的玻璃光纤段插入陶瓷插芯中，然后用注射用套管在插芯的平面端滴加一滴瞬干胶。在陶瓷插芯的圆形端面，将玻璃纤维尽可能剪短，并将预植入体放置于插芯抛光托盘上，利用四种不同的抛光纸对圆形端面进行抛光。随后，在陶瓷插芯的平面端面处，将玻璃纤维切割至植入所需长度。使用小鼠脑图谱计算植入体的长度。植入物必须正好位于目标区域的上方。植入前需施加麻醉。精确且美观的技术在文稿中有详细描述。当小鼠达到深度麻醉状态后，将其置于加热板上，并用立体定位仪固定头部。固定鼻部和门齿于前方，两侧耳杆固定耳朵。在小鼠背部皮下注射布洛芬以进行镇痛，并在双眼涂抹不透明眼膏，防止角膜干燥。用湿润的纸巾将头皮上的毛发润湿，然后用剪刀将其剪除。务必用湿润的纸巾清除所有松散的毛发。使用棉签蘸取含碘酊剂对头皮进行消毒。用镊子提起目标区域的头皮，沿中线剪开约一厘米。为使颅骨粗糙以利于植入，将少量磷酸涂抹于切口处，作用15秒。用棉签彻底清除所有酸液，并用氯化钠溶液冲洗切口两次。为正确注射，需计算各个坐标的F值。将玻璃套管置于立体定位仪框架中，并将其准确定位于前囟正上方。随后将坐标系统归零，并将玻璃套管移至后囟。使用以下公式计算F值：Bregma减去Lambda，再除以4.2，即为F值。精确的坐标对于注射和植入至关重要，因为如果刺激了错误的脑区，将导致行为学效应不特异。所有小鼠的颅骨大小均存在最小程度的差异，因此，校正系数是绝对必需的。使用校正后的坐标来确定位于目标结构正上方的颅骨表面位置。使用注射套管通过在原位旋转套管的方式在颅骨上钻孔。吸取病毒溶液至连接注射器的玻璃套管时，先在颅骨上放置一滴氯化钠溶液，再在其上方放置一片明胶海绵。取两微升病毒溶液滴加在明胶海绵上，将玻璃套管的尖端浸入病毒溶液中。施加负压，等待病毒溶液被吸入套管内。当带有套管的病毒注射尖端到达颅骨水平时，将坐标归零，然后缓慢将其降入钻孔，直至到达注射位置的最深处。用注射器施加少量正压，直到液面下降。让病毒扩散两到三分钟，然后再将玻璃套管向上移动至下一个位置。非常缓慢地取出玻璃插管，末次注射后将其丢弃。现在准备进行颅骨植入。用压缩空气吹干颅骨，用对应的引物棒涂抹底漆，并静置干燥15秒。使用相同的粘合剂涂抹，并用紫外光照射固化20秒。将植入物放入相应的夹持器中，将玻璃纤维的尖端准确定位于钻孔正上方，然后小心下放。当下方残留的少量超级胶水接触颅骨时，停止下放植入物。光学纤维的植入也可用于海马体等双侧结构。这能够实现双侧半球的同时轻微刺激，或允许对两个不同结构进行刺激。此外，还可以在与光学纤维植入位置不同的位点注射病毒。如果注射和植入操作在不同区域进行，则在涂抹磷酸后、进行双组分粘合前，钻出所有必要的孔。再次检查颅骨是否完全干燥，然后在植入物周围及周边区域涂抹液态牙科水泥，并用紫外光照射20秒使其固化。在完全无毛且干燥的颅骨区域再涂抹两层较薄的水泥，每涂一层均需用紫外光照射固化。手术结束时，将碘伏涂抹于整个伤口。松开鼻部和耳部固定装置，将小鼠放入清洁的笼子中，并置于加热灯下以防止体温流失。每天至少检查一次其健康状况，必要时术后三天给予镇痛处理。经过两周的恢复后，小鼠可用于行为学实验。打开Pulser软件，选择光源所连接的USB串行端口。选择操作模式三，以允许外部软件控制光源。选择正确的20赫兹刺激参数，光脉冲持续时间为5毫秒。为建立与脉冲发生器的通信连接，请按下启动序列按钮。此状态将持续至实验结束。现在，在 EthoVision XT 中创建一个新实验，进入文件菜单，选择“从模板新建”，然后选择应用预定义模板。选择实时追踪，并选择带有信号源的摄像头，确认已连接 Puslar Gen-Eye 摄像头。选择小鼠作为需要记录的动物。选择竞技场模板“开放场地方格”以及区域模板“中心、边缘、角落”。确认需要追踪的单个对象，并选择中心点、鼻尖点和尾基点。确认动物颜色相对于背景较深，并确认完成此步骤的推荐采样率。为实验命名并选择保存位置。在找到竞技场设置之前，相机会自动打开一张背景图像。通过使用箭头及其右侧的两个符号，将预定义区域调整为与实际竞技场一致。如果某些区域不需要，可将其删除。按下绘制比例尺进行校准，并从迷宫的一个角落画一条线到另一个角落。输入实际距离的长度（单位：厘米）。对另一轴重复上述操作。为定义试验控制设置，通过将条件时间调整为20分钟来配置主规则。《星际迷航》的条件应为：当受试对象在竞技场内持续两秒时，鼠标位于竞技场内即自动启动追踪状态。要为光刺激创建子规则，请转到结构，点击“更多”并选择子规则。将其放置在主规则下方，并将两个框展开。进入条件，选择时间，并为其命名，例如“光开启一”，将条件满足时间调整为五分钟后。将该盒子直接放置在子规则的规则起始盒子后面。进入“自定义硬件操作”并将其命名为“light on one”。选择要执行的操作为：我将置为高电平。将该盒子直接放置在条件框的后面。重复上述步骤，以编程方式将“关灯”设置为“开灯”。然后转到结构部分，选择子规则引用，并确认该引用属于正确的子规则。选择启动条件为“立即开始”，并将启动条件设置为“每个启动条件执行一次”。将参考框放置在主规则的附加书籍一和条件书籍二之间。现在定义检测设置，以告知系统需要跟踪的内容。将测试小鼠放入实验区域，选择自动设置。选择啮齿类动物作为动物类型，并使用鼠标光标在实验区域内的小鼠周围绘制一个方框。对护理问题的结果确认选择“是”。进行旷场实验时，应在实验开始前将实验小鼠带入行为学实验房间，以确保其具有适当的焦虑水平。通过轻轻按压小鼠使其紧贴笼具网格，并将光源狭缝对准小鼠。然后将其放入一个装有新鲜垫料的等待笼中，适应10分钟，使其适应光缆环境。按下停止按钮开始采集，然后将小鼠从等待笼中转移至旷场的左上角。实验过程中避免进入小鼠的视野，并保持安静。20分钟后，实验结束，将小鼠从迷宫中取出，断开光源光纤电缆，并将其放回自己的笼中。通过检查可视化结果，可以直观地看到光照开启与关闭状态下小鼠在中心区域停留时间的差异。当光照开启时，小鼠在中心区域停留的时间更短。进行巴恩斯迷宫实验时，应在实验开始前约一小时将所有实验小鼠带入行为学实验房间。通过关闭除一个以外的所有孔洞来准备巴恩斯迷宫，并在该孔洞下方放置一个逃逸箱。将一只小鼠置于光源下，使其同时接触两个植入物，并将其直接放置于巴恩斯迷宫的中央。按下开始按钮后，小鼠需要前往下一个T点并移除纸箱。务必准备手动停止实验，以防软件未能识别整个转换过程。将小鼠从迷宫中取出，并断开与光缆的连接。在进行学习与记忆任务时，不仅考察操作的即时效应，还考察在习得、巩固或提取阶段操作的长期效应。进行数据分析时，找到已处理或对照的处理条件，进入嵌套设置并选择试验对照状态。选择从元素动作“Star Trek”到元素动作“light goes on one”的状态区间。将嵌套框放置在处理滤波框与相应结果框之间。该定义的时间间隔为1。同样对间隔为2以及对照组重复上述步骤。同时，在分析配置文件中定义要分析的参数。选择区域中的因变量，并选定区域中心、身体点、中心点，然后进行试验统计。选择频率、累积持续时间，并查看首次结果。同时添加移动距离作为变量。通过此配置文件，可获取在中心区域停留的时间、进入中心区域的次数以及移动总距离的数据。要从每个分组中提取数据，请转到结果页面，选择统计与图表，点击计算以查看分析后的数据。点击导出数据，选择试验统计结果及保存位置。导出的数据将保存为一个 Excel 文件，并包含每只小鼠的单独数值。此外，进入热图可视化界面，点击“绘制热图”按钮，在右侧选择试验，以查看每只小鼠每次试验的单独热图。在小鼠图像上单击右键，将热图导出为图像文件。随后，在计算机上打开 Excel 文件，计算所有四次试验及每个测量的条件分组的平均值和标准误差（SCM）。为了生成图形并导入 SigmaPlot，将平均值和 SCM 从 Excel 文件按正确顺序复制到 SigmaPlot 中。其中，行应包含“关闭一”、“开启一”的数据，列应包含试验次数、平均值和 SCM（赫兹）。选择所有三列并创建图表。选择条形图，然后选择不分组的带箭头的箱线图。为整个图表添加标签，转到首页，选择图表框，然后点击导出。选择目标文件夹，并选择元文件作为格式。为了对获得的数据进行统计分析，将数据从 Excel 一一复制到 SigmaPlot 的单个列中。标记要比较的列，然后转到分析，选择 T 检验并点击运行。最后，行为学数据可以进一步按释放期和刺激期进行划分，并辅以更精细的热图分析。在开放旷场实验中，当对通道视紫红质2和锥体神经元进行光刺激时，动物在中央区域的停留时间减少，表明其焦虑水平升高。通过免疫组织化学方法，可确定病毒注射位点及其表达情况，同时验证该病毒在特定Cre依赖小鼠品系中的特异性表达。可以清楚地观察到，与刺激前的基线焦虑水平相比，对特定皮层区域的ChR2（Channelrhodopsin2）进行光刺激会增强该区域神经元的活动，从而提高焦虑水平。这种操控对行为产生的即时效应，正是如今光遗传学被广泛应用于众多行为相关研究问题的原因。该方法可用于小鼠脑内任意特定细胞类型或神经环路的光遗传学调控。将该实验步骤与适合您研究的相应行为学测试相结合，可更深入地了解与特定行为及疾病相关的神经环路机制。

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科研

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Behavior

行为

神经活性的光遗传学操作，调节自由移动小鼠的行为

来源：Kodani, S.，等．在监测小鼠睡眠/觉醒状态期间对神经环路进行光遗传学操控．J. Vis. Exp.

光遗传学操控小鼠睡眠到觉醒转换中的神经环路

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用于光遗传学操控神经环路的行为学检测方法 黑腹果蝇

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光遗传学操控神经元活动以调节自由活动小鼠的行为

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