光遗传学操控神经元活动以调节自由活动小鼠的行为

通过光遗传学手段操控特定的神经元群体或脑区，可以在自由活动的动物中以高时空分辨率改变其行为。结合不同类型的光遗传学工具与慢性植入的光纤，可实现多种神经调控和行为学测试。光遗传学的最终目标是在活体动物行为过程中，以高时空分辨率调控神经环路。

与药理学或电学操控方法不同，光遗传学技术能够对神经环路中的特定细胞类型实现精确控制。光遗传学是针对行为过程中特定脑区内的特定细胞类型进行靶向干预，并深入研究这些微环路变化所产生直接效应的理想方法。接下来，我们将逐步介绍如何在自由活动的小鼠中进行光遗传学实验的准备、植入及操作流程。

制备光学植入物时，将陶瓷插芯的平面朝上放置于台钳中。使用光纤剥线工具剥离直径为200微米的玻璃光纤的涂覆层，并用陶瓷光纤刻划笔截取两到三厘米长的光纤段。将截好的玻璃光纤段插入陶瓷插芯中，然后用注射用套管在插芯的平面端滴加一滴瞬干胶。

在陶瓷插芯的圆形端面，将玻璃纤维尽可能剪短，并将预植入体放置于插芯抛光托盘上，利用四种不同的抛光纸对圆形端面进行抛光。随后，在陶瓷插芯的平面端面处，将玻璃纤维切割至植入所需长度。使用小鼠脑图谱计算植入体的长度。

植入物必须正好位于目标区域的上方。植入前需施加麻醉。精确且美观的技术在文稿中有详细描述。

当小鼠达到深度麻醉状态后，将其置于加热板上，并用立体定位仪固定头部。固定鼻部和门齿于前方，两侧耳杆固定耳朵。在小鼠背部皮下注射布洛芬以进行镇痛，并在双眼涂抹不透明眼膏，防止角膜干燥。

用湿润的纸巾将头皮上的毛发润湿，然后用剪刀将其剪除。务必用湿润的纸巾清除所有松散的毛发。使用棉签蘸取含碘酊剂对头皮进行消毒。

用镊子提起目标区域的头皮，沿中线剪开约一厘米。为使颅骨粗糙以利于植入，将少量磷酸涂抹于切口处，作用15秒。用棉签彻底清除所有酸液，并用氯化钠溶液冲洗切口两次。

为正确注射，需计算各个坐标的F值。将玻璃套管置于立体定位仪框架中，并将其准确定位于前囟正上方。随后将坐标系统归零，并将玻璃套管移至后囟。

使用以下公式计算F值：Bregma减去Lambda，再除以4.2，即为F值。精确的坐标对于注射和植入至关重要，因为如果刺激了错误的脑区，将导致行为学效应不特异。

所有小鼠的颅骨大小均存在最小程度的差异，因此，校正系数是绝对必需的。使用校正后的坐标来确定位于目标结构正上方的颅骨表面位置。使用注射套管通过在原位旋转套管的方式在颅骨上钻孔。

吸取病毒溶液至连接注射器的玻璃套管时，先在颅骨上放置一滴氯化钠溶液，再在其上方放置一片明胶海绵。取两微升病毒溶液滴加在明胶海绵上，将玻璃套管的尖端浸入病毒溶液中。施加负压，等待病毒溶液被吸入套管内。

当带有套管的病毒注射尖端到达颅骨水平时，将坐标归零，然后缓慢将其降入钻孔，直至到达注射位置的最深处。用注射器施加少量正压，直到液面下降。让病毒扩散两到三分钟，然后再将玻璃套管向上移动至下一个位置。

非常缓慢地取出玻璃插管，末次注射后将其丢弃。现在准备进行颅骨植入。用压缩空气吹干颅骨，用对应的引物棒涂抹底漆，并静置干燥15秒。

使用相同的粘合剂涂抹，并用紫外光照射固化20秒。将植入物放入相应的夹持器中，将玻璃纤维的尖端准确定位于钻孔正上方，然后小心下放。当下方残留的少量超级胶水接触颅骨时，停止下放植入物。

光学纤维的植入也可用于海马体等双侧结构。这能够实现双侧半球的同时轻微刺激，或允许对两个不同结构进行刺激。此外，还可以在与光学纤维植入位置不同的位点注射病毒。

如果注射和植入操作在不同区域进行，则在涂抹磷酸后、进行双组分粘合前，钻出所有必要的孔。再次检查颅骨是否完全干燥，然后在植入物周围及周边区域涂抹液态牙科水泥，并用紫外光照射20秒使其固化。在完全无毛且干燥的颅骨区域再涂抹两层较薄的水泥，每涂一层均需用紫外光照射固化。

手术结束时，将碘伏涂抹于整个伤口。松开鼻部和耳部固定装置，将小鼠放入清洁的笼子中，并置于加热灯下以防止体温流失。每天至少检查一次其健康状况，必要时术后三天给予镇痛处理。

经过两周的恢复后，小鼠可用于行为学实验。打开Pulser软件，选择光源所连接的USB串行端口。选择操作模式三，以允许外部软件控制光源。

选择正确的20赫兹刺激参数，光脉冲持续时间为5毫秒。为建立与脉冲发生器的通信连接，请按下启动序列按钮。此状态将持续至实验结束。

现在，在 EthoVision XT 中创建一个新实验，进入文件菜单，选择“从模板新建”，然后选择应用预定义模板。选择实时追踪，并选择带有信号源的摄像头，确认已连接 Puslar Gen-Eye 摄像头。选择小鼠作为需要记录的动物。

选择竞技场模板“开放场地方格”以及区域模板“中心、边缘、角落”。确认需要追踪的单个对象，并选择中心点、鼻尖点和尾基点。确认动物颜色相对于背景较深，并确认完成此步骤的推荐采样率。

为实验命名并选择保存位置。在找到竞技场设置之前，相机会自动打开一张背景图像。通过使用箭头及其右侧的两个符号，将预定义区域调整为与实际竞技场一致。

如果某些区域不需要，可将其删除。按下绘制比例尺进行校准，并从迷宫的一个角落画一条线到另一个角落。输入实际距离的长度（单位：厘米）。

对另一轴重复上述操作。为定义试验控制设置，通过将条件时间调整为20分钟来配置主规则。《星际迷航》的条件应为：当受试对象在竞技场内持续两秒时，鼠标位于竞技场内即自动启动追踪状态。

要为光刺激创建子规则，请转到结构，点击“更多”并选择子规则。将其放置在主规则下方，并将两个框展开。进入条件，选择时间，并为其命名，例如“光开启一”，将条件满足时间调整为五分钟后。

将该盒子直接放置在子规则的规则起始盒子后面。进入“自定义硬件操作”并将其命名为“light on one”。选择要执行的操作为：我将置为高电平。

将该盒子直接放置在条件框的后面。重复上述步骤，以编程方式将“关灯”设置为“开灯”。然后转到结构部分，选择子规则引用，并确认该引用属于正确的子规则。

选择启动条件为“立即开始”，并将启动条件设置为“每个启动条件执行一次”。将参考框放置在主规则的附加书籍一和条件书籍二之间。现在定义检测设置，以告知系统需要跟踪的内容。

将测试小鼠放入实验区域，选择自动设置。选择啮齿类动物作为动物类型，并使用鼠标光标在实验区域内的小鼠周围绘制一个方框。对护理问题的结果确认选择“是”。

进行旷场实验时，应在实验开始前将实验小鼠带入行为学实验房间，以确保其具有适当的焦虑水平。通过轻轻按压小鼠使其紧贴笼具网格，并将光源狭缝对准小鼠。然后将其放入一个装有新鲜垫料的等待笼中，适应10分钟，使其适应光缆环境。

按下停止按钮开始采集，然后将小鼠从等待笼中转移至旷场的左上角。实验过程中避免进入小鼠的视野，并保持安静。20分钟后，实验结束，将小鼠从迷宫中取出，断开光源光纤电缆，并将其放回自己的笼中。

通过检查可视化结果，可以直观地看到光照开启与关闭状态下小鼠在中心区域停留时间的差异。当光照开启时，小鼠在中心区域停留的时间更短。进行巴恩斯迷宫实验时，应在实验开始前约一小时将所有实验小鼠带入行为学实验房间。

通过关闭除一个以外的所有孔洞来准备巴恩斯迷宫，并在该孔洞下方放置一个逃逸箱。将一只小鼠置于光源下，使其同时接触两个植入物，并将其直接放置于巴恩斯迷宫的中央。按下开始按钮后，小鼠需要前往下一个T点并移除纸箱。

务必准备手动停止实验，以防软件未能识别整个转换过程。将小鼠从迷宫中取出，并断开与光缆的连接。在进行学习与记忆任务时，不仅考察操作的即时效应，还考察在习得、巩固或提取阶段操作的长期效应。

进行数据分析时，找到已处理或对照的处理条件，进入嵌套设置并选择试验对照状态。选择从元素动作“Star Trek”到元素动作“light goes on one”的状态区间。将嵌套框放置在处理滤波框与相应结果框之间。

该定义的时间间隔为1。同样对间隔为2以及对照组重复上述步骤。同时，在分析配置文件中定义要分析的参数。

选择区域中的因变量，并选定区域中心、身体点、中心点，然后进行试验统计。选择频率、累积持续时间，并查看首次结果。同时添加移动距离作为变量。

通过此配置文件，可获取在中心区域停留的时间、进入中心区域的次数以及移动总距离的数据。要从每个分组中提取数据，请转到结果页面，选择统计与图表，点击计算以查看分析后的数据。点击导出数据，选择试验统计结果及保存位置。

导出的数据将保存为一个 Excel 文件，并包含每只小鼠的单独数值。此外，进入热图可视化界面，点击“绘制热图”按钮，在右侧选择试验，以查看每只小鼠每次试验的单独热图。在小鼠图像上单击右键，将热图导出为图像文件。

随后，在计算机上打开 Excel 文件，计算所有四次试验及每个测量的条件分组的平均值和标准误差（SCM）。为了生成图形并导入 SigmaPlot，将平均值和 SCM 从 Excel 文件按正确顺序复制到 SigmaPlot 中。其中，行应包含“关闭一”、“开启一”的数据，列应包含试验次数、平均值和 SCM（赫兹）。

选择所有三列并创建图表。选择条形图，然后选择不分组的带箭头的箱线图。为整个图表添加标签，转到首页，选择图表框，然后点击导出。

选择目标文件夹，并选择元文件作为格式。为了对获得的数据进行统计分析，将数据从 Excel 一一复制到 SigmaPlot 的单个列中。标记要比较的列，然后转到分析，选择 T 检验并点击运行。

最后，行为学数据可以进一步按释放期和刺激期进行划分，并辅以更精细的热图分析。在开放旷场实验中，当对通道视紫红质2和锥体神经元进行光刺激时，动物在中央区域的停留时间减少，表明其焦虑水平升高。通过免疫组织化学方法，可确定病毒注射位点及其表达情况，同时验证该病毒在特定Cre依赖小鼠品系中的特异性表达。

可以清楚地观察到，与刺激前的基线焦虑水平相比，对特定皮层区域的ChR2（Channelrhodopsin2）进行光刺激会增强该区域神经元的活动，从而提高焦虑水平。这种操控对行为产生的即时效应，正是如今光遗传学被广泛应用于众多行为相关研究问题的原因。该方法可用于小鼠脑内任意特定细胞类型或神经环路的光遗传学调控。

将该实验步骤与适合您研究的相应行为学测试相结合，可更深入地了解与特定行为及疾病相关的神经环路机制。