测量在C.elegan的RAN肽毒性

RAN肽是重复扩张性神经退行性疾病的一个特征，如亨廷顿舞蹈症、肌萎缩性侧索硬化症和前脑膜痴呆症。这些协议为C.elegans模型系统中的 RAN 肽毒性定量提供了一种重要的标准化方法。所述技术简单易学，价格低廉，可以快速执行，并利用C.elegans系统的可重复特性，如移动和复制。

在尝试此协议时，主要的挑战是获得一致的 RAN 肽毒性和表达。控制的主要因素包括药物温度、温度变化的时间和检测板的准备。实验者必须在这个与年龄相关的过程检测中对动物的表型进行一致分类。

该技术的可视化演示显示了它们的分类标准。首先，用一毫摩尔IPTG和每毫升25微克的碳素将标准线虫生长介质倒入24孔板中。将 HT115 细菌中的 RNAi 喂养到 LB 卡贝尼西林加糖上，并在 37 摄氏度下生长 24 小时。

第二天，在250转/小时摇晃时，将单个菌落放入一毫升LB卡贝尼西林液体介质中，在37摄氏度下生长细菌18小时。如文本手稿所述，发现 NGM RNAi 24 孔板的四个单独孔，含有 20 微升的隔夜细菌培养物，并允许 RNAi 细菌在一夜之间诱导双链RNA生产。使用标准的次氯酸盐方法从表达综合 RAN 肽转基因的第一天成年 C.elegans 分离卵子。

然后将大约30个卵子播种到24井板的每个井中，并在20摄氏度下孵育该板7天。要执行视频速度分析，使用装有单色摄像机的立体解剖显微镜，从两个单独的孔中获取两个视频，用于处理每个 RNAi 条件。确保在井之间使用一致的采集设置。

对于每个视频，将持续时间设置为 10 秒，将时间间隔设置为 76 毫秒。将图像曝光时间设置为四毫秒，并使用 1.49 缩放设置。然后选择两个按两个装箱。

验证分辨率为 800 x 600 像素并开始录制。采集后，立即用应变、RNAi 状况和井号标记每个视频。然后测量每个视频中 20 种不同动物的行驶距离和长度，检查每个 RNAi 条件的总共约 40 个蠕虫。

在软件中，选择注释工具按钮。然后绘制文本工具。单击在视频的第一帧中测量的蠕虫中心一个点，然后用数字标记它。

在直观地跟踪蠕虫的同时，将视频推进到末尾。然后单击它，然后用下一个相应的数字标记它。使用绘制比例条工具绘制一条从第一个数字到第二个数字的线，并在电子表格中记录行驶距离。

对视频中的其他 19 个蠕虫重复此测量，同时在分析窗口中保留每个单独的测量值。测量完成后，拍摄最终视频帧的快照，说明所有测量线，以便数据可追溯到其来源的动物。接下来，使用四列电子表格分析数据，其中第 1 列是蠕虫标识符，第 2 列是速度。

通过右键单击实验下的视频并访问属性，可以找到每个视频的时间。要使速度测量正常化，请找到每个动物的长度。使用绘制折线工具从头尖到尾部尖端自由跟踪 C.elegans。

然后拍摄最终视频帧的快照，说明所有折线。行的长度将在统计下记录。在电子表格中添加两列，一列用于动物长度，另一列用于规范化速度。

最后，使用单向 ANOVA 与空向量 RNAi 进行非正常测试分析规范化速度数据。将四到六个转基因L4 C.elegans在6厘米的GP RNAi板上放置表达 RAN肽GP，并在20摄氏度下生长。如果实验是利用RNAi来测试对RN肽毒性的遗传影响，则将10名转基因重力成人移动到两个空载体RNAi GFP RNAi或基因特异性RNAi板中。

如果突变体被用来分析对 RAN 肽毒性的遗传影响，则将 10 种重力野生类型或突变动物在两个空载体 RNAi 或 GFP RNAi 板块上放置 10 种表达相同 RAN 转基因的突变动物。在20摄氏度下生长48小时。从 RNAi 板中挑选 10 组 10 个转基因 L4，将每组 L4 放在三厘米 RNAi 板上。

确保为测定选择的蠕虫都有表面正常的活动性。将盘子放在塑料袋中，以保留水分，并在 25 摄氏度下孵育。24小时后，通过敲击解剖显微镜上的板检查运动，分析动物的机动性。

如果蠕虫移动超过身体长度，将其计为移动，并转移到新的三厘米 RNAi 板。使用铂金拾取来敲击头部和尾部的剩余蠕虫。如果动物移动超过身体长度，将动物计数为移动，并转移到一个新的三厘米RNAi板。

如果第二天空病媒控制中未观察到严重瘫痪，则终止测定并重新开始。将所有非移动蠕虫分组在一起，以便轻松检测超过体长的运动。数一数所有瘫痪、袋装或死蠕虫，然后丢弃盘子。

继续每天给动物打分，持续五到七天。生长测定用于测量基因抑制对在具有G4C2重复扩张的ALS患者中发现的 RAN二肽毒性的影响。仅PR50 GFP的表达就导致完全生长停止，但几个基因的敲击抑制了发育毒性。

利用视频速度分析法测量了特定基因敲击对PR50表达动物发育运动的影响。正如预期的那样，与空向量RNAi相比，PR50 GFP表达的抑制导致运动性显著增加。此外，RNAi对蛋白酶体亚单位RPN7导致PR50运动性显著增加。

当用年龄依赖性麻痹测定分析成人表型时，PR50 GFP在五天前表现出高达80%的瘫痪。然而，RNAi针对基因cul-6显著延迟瘫痪，表明PR50 GFP毒性需要cul-6。为了确定 RAN 蛋白在 C.elegans 神经元中表达时是否引起神经病理学，使用小卖部测定法检查了神经元特异性毒性。

在第二天成人，PR50 GFP表达在运动神经元导致显著增加的运动神经元出血。胰岛素IGF受体基因同源DAF-2的突变显著抑制了这种神经病理学，该突变延缓了几种神经退行性蛋白质的毒性。对于行为分析，RAN肽必须产生高度的佩内性表型。

这种基因或药物可以为 RAN 肽疾病提供新的生物标志物或治疗选择。使用这些测定方法，我们为C9ORF72相关冉多肽精氨酸的抑制者进行了全基因组RNAi筛查。在这个屏幕中识别的基因包括许多新的和保存的基因，这些基因将成为未来机械研究的主题。