Name: 测量在C.elegan的RAN肽毒性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 了解利用秀丽隐杆线虫模型系统量化RAN肽毒性的标准化方法。本研究通过行为学检测和细胞学检测，为神经退行性疾病机制研究提供可靠的技术手段。

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NIH R21NS107797

1. 构建密码子变异的RAN多肽表达载体
<ol>
	<li>利用同义密码子设计单个RAN肽编码序列，以消除基本的重复DNA/RNA结构，同时保留其对应的氨基酸序列。</li>
	<li>根据研究所需的重复长度（通常为5–100个重复），商业订购定制密码子序列。在5'端包含HindIII限制性酶切位点，3'端包含BamHI限制性酶切位点，以便将序列克隆至C. elegans表达载体（如pPD95.79）中。 
	注意：若较大构建体的合成存在困难，可先合成较小的模块序列，再通过定向连接策略将其组装成更长的重复序列17。</li>
	<li>使用标准的T4 DNA连接酶方法，将肽序列亚克隆至C. elegans表达载体中。</li>
	<li>通过PCR扩增获得细胞类型特异性启动子序列，并将其亚克隆至RAN肽序列的上游，以驱动RAN肽-GFP在特定组织中的表达。</li>
	<li>采用标准方法18，将RAN肽构建体显微注射至野生型C. elegans的生殖腺中，以产生含有染色体外阵列的转基因品系。共注射标记物使用肌肉特异性RFP报告基因（myo-3p::RFP（pCFJ104）），但也可使用其他标记物。</li>
	<li>采用标准的C. elegans整合筛选方法19，将稳定的转基因整合至基因组中。</li>
	<li>若RAN肽具有毒性导致转基因动物无法存活，可在注射前后喂食表达gfp(RNAi)的细菌，以沉默毒性蛋白的表达。 
	注意：将动物从gfp(RNAi)处理条件下移除后，可恢复RAN肽的表达，进而利用下述实验方法进行表型分析。</li>
</ol>
2. 基于RNA干扰基因敲低后RAN肽发育毒性的测量：视频速度分析方案
<ol>
	<li>在含有1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）和25 µg/mL羧苄青霉素的线虫标准生长培养基（NGM）RNAi 24孔板中进行铺板。</li>
	<li>将待测的RNAi饲喂克隆在含有羧苄青霉素（25 µg/mL）的LB琼脂平板上划线，使用HT115菌株，37 °C培养24 h。包括 空载体（RNAi） 作为毒性的阳性对照 gfp(RNAi) 作为阴性对照。</li>
	<li>对于每个克隆，挑取单个菌落至1 mL LB + 羧苄青霉素液体培养基中，于37 °C、250转/分钟（RPM）振荡条件下培养18小时过夜。</li>
	<li>在NGM RNAi 24孔板中，分别向4个单独的孔加入20 µL以下过夜培养的细菌菌液：第1列孔 = gfp(RNAi)第2列孔 (EV)RNAi；第3–6列孔 = 针对待测基因的RNAi。在室温（RT）下孵育RNAi细菌过夜，以诱导dsRNA产生。</li>
	<li>从第一天成虫中分离卵 秀丽隐杆线虫 使用标准次氯酸盐方法表达整合的RAN肽转基因，并接种约30 秀丽隐杆线虫 将卵放入每孔NGM RNAi 24孔板中。</li>
	<li>将24孔板在20 °C孵育7天。 
	注意：此孵育时间适用于表达毒性 C9orf72 RAN 二肽（如 PR50 或 GR50）的菌株。其他菌株可能需要更短的孵育时间，以防止细菌食物来源耗尽，进而导致饥饿。</li>
	<li>使用配备 DFC345FX 单色相机的 Leica MZ16FA 体视解剖显微镜，结合运行 Leica AF 视频采集软件（版本 2.6.0.7266）的 Windows 兼容计算机，采集透射光视频。
	<ol>
		<li>对每种RNAi条件，使用一致的视频采集设置从两个不同的孔中分别获取两段视频。每段视频采集10秒，分辨率为800 × 600像素，帧速率为每秒13.16帧（时间体素维度为0.076秒），放大倍数为18.6倍（AF软件中变焦设置为1.49）。将图像曝光时间设置为4毫秒。立即为每段视频标注对应的品系、RNAi条件和孔编号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将视频文件的顺序随机化，并将视频文件名更改为数字，以使实验人员对每个视频文件对应的基因型设盲。将这组视频另存为新文件。在分析完成后，对实验人员解除设盲。</li>
	<li>从每个视频中测量20只不同动物的“移动距离”和体长，每种RNAi条件下共检测约40只线虫。
	<ol>
		<li>在软件中，选择注释工具按钮，然后选择绘制文本工具。在视频的第一帧中，点击被测线虫中心位置的某一点，并标记为一个数字。推进视频至末尾，同时目视追踪线虫的运动路径。在最后一帧中，点击被测线虫中心位置的某一点，并标记下一个对应的数字。然后，使用绘制标尺工具，从第一个数字画一条线至第二个数字，以记录 &#34;移动距离&#34;</li>
		<li>“移动距离”是指两个质心点之间的距离，该距离显示在测量线旁边。将此测量值记录在电子表格中。在视频中对另外19条蠕虫重复此测量，并在分析窗口中保留每条个体的测量值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从运动最活跃的动物中进行测量，以避免选择无运动的个体而导致数据偏向瘫痪状态。测量完成后，截取显示所有测量线的最终视频帧图像，以便将数据追溯至其来源动物。</li>
	<li>使用四列电子表格分析数据。第一列为线虫 &#34;标识符&#34;，第二列为行进距离 / 时间（速度）。
	<ol>
		<li>每个视频的时间可通过在实验下方右键点击视频并查看其属性来找到。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过选择软件中的“量化”（Quantify），然后选择“统计”（Statistics），测量每只动物的体长，以标准化速度测量。在视频显示界面上点击注释工具图标，即可使用该工具 &#34;绘制多段线&#34; 工具。该工具可用于自由追踪 秀丽隐杆线虫 从视频中头部顶端到尾部末端的长度。该线段的长度将被记录在统计结果中。
	<ol>
		<li>拍摄最终视频帧的快照，以展示所有用于测量尺寸的折线 秀丽隐杆线虫 以便数据可以追溯到其来源动物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过在电子表格中添加两列来分析数据。第三列为 &#34;动物长度&#34;，第四列是 &#34;标准化速度&#34; （速度/动物体长）。使用单因素方差分析（One-way ANOVA）对归一化速度数据进行分析，并进行事后检验与对照组比较 空载体（RNAi）.</li>
</ol>
3. RAN 多肽发育毒性的测定：生长实验
<ol>
	<li>挑选约30只怀卵动物放入50 µL的次氯酸盐溶液（10 mL 漂白剂，2.5 mL 10 N NaOH，37.5 mL dH₂O）中2O）在任一 gfp(RNAi)， (EV)RNAi， 或 （基因特异性的） 6 cm RNA干扰 平板</li>
	<li>24小时后，将六只从次氯酸钠溶液液滴中爬出的转基因子代转移至新的6 cm培养皿 RNA干扰 将这些子代（F1）置于与RNAi处理条件相同的培养板上，并用次氯酸钠溶液处理，随后在20 °C下培养以生长和繁殖。</li>
	<li>24–48 小时后，挑选 10 只转基因 L4 期线虫，转移到 6 cm 的 RNAi 平板上，RNAi 条件需与线虫此前生长的条件一致。将线虫置于 20 °C 培养箱中孵育 24 小时，使其同步产卵。</li>
	<li>24小时后，移除成虫并弃去。使用机械式手持计数器统计24小时内所产的卵和L1幼虫数量，此即为总子代数。</li>
	<li>在接下来的72小时内，统计达到L4或更晚发育阶段的动物数量。每计数一只动物，即从培养皿中移除。</li>
	<li>量化 &#34;生长百分比&#34; 占总子代数量中达到L4或更晚阶段的动物百分比。</li>
	<li>进行 2 × 2 检验的费舍尔精确检验 空载体（RNAi） 以确定生长百分比是否具有统计学显著性。用于比较的类别为 &#34;生长&#34; （72小时内发育至L4阶段或更晚阶段的动物数量）以及 &#34;无生长&#34; （总产卵数减去72小时内达到L4或更晚阶段的个体数量）。</li>
</ol>
4. 发育后RAN肽麻痹检测
<ol>
	<li>保持整合 秀丽隐杆线虫 在肌肉中表达RAN肽-GFP的转基因品系 gfp（RNAi）通过将4–6条转基因L4幼虫放置于6 cm培养皿中 gfp(RNAi) 平板，于 20 °C 培养线虫。</li>
	<li>如果实验利用RNAi检测RAN肽毒性相关的遗传效应，将10只转基因的产卵期成虫从未饥饿的培养皿转移至两个6 cm 空载体（RNAi）（麻痹的阳性对照，遗传效应的阴性对照）， gfp(RNAi) （瘫痪的阴性对照，遗传效应的阳性对照） 基因特异性（RNAi）（即每个6 cm培养皿放置10只性成熟成虫）。</li>
	<li>若使用突变体分析RAN肽毒性的遗传效应，则将表达相同RAN转基因的10只野生型（WT）或突变体成虫分别放置于两个6 cm培养皿中 空载体（RNAi）或 gfp(RNAi) 平板。将线虫在20 °C培养48 h。</li>
	<li>从6 cm的RNAi平板中挑选10组各10只转基因L4期线虫，将每组分别转移至一个3 cm的RNAi平板上（即每种基因型n = 100只动物）。确保用于实验的L4期线虫表面运动能力均正常。将平板置于密封拉链袋中以保持湿度。</li>
	<li>将装有L4幼虫的培养皿放入25 °C培养箱中。</li>
	<li>24小时后，从25 °C培养箱中逐个品系取出动物，以尽量减少其在室温下暴露的时间。</li>
	<li>轻敲解剖显微镜下的培养皿以检查线虫活动。若线虫移动距离超过一个体长，则计为可移动个体，并将其转移至新的3 cm RNAi培养皿中。使用铂金丝挑取剩余线虫的头部或尾部进行轻触刺激。若线虫移动距离超过一个体长，则计为可移动个体，并将其转移至新的3 cm RNAi培养皿中。 
	注意：转移时每皿不得超过10条线虫。避免将子代移至新的RNAi平板，因为该实验仅需追踪成年个体。</li>
	<li>将所有不移动的线虫集中在一起，以便于检测是否出现超过一个体长的移动。给予线虫至少一分钟时间，观察其是否移动超过一个体长。如果在此期间仍无移动，则判定为瘫痪、体内孵化（即幼虫在母体内孵化）或死亡。</li>
	<li>对表现出胀袋、体侧干燥、肠道外露、钻孔、丢失或在检测时已死亡的线虫进行剔除。瘫痪的线虫需计数，保留在原有的RNAi平板上，随后丢弃。</li>
	<li>每天对动物进行瘫痪评分，持续5–7天，具体方法见步骤4.6–4.9。</li>
	<li>使用与分析寿命数据相同的对数秩检验（log-rank test）分析瘫痪数据。在此统计分析中，能够运动的线虫被记为存活 &#34;存活&#34;，瘫痪的线虫被记为 &#34;死亡&#34;死亡、装袋、肠道外露、脱水、钻入洞穴或其他方式丢失的蠕虫均记为 &#34;已屏蔽&#34;. 
	注意：在此分析中， &#34;存活率&#34; 数字表示 &#34;移动百分比&#34; 动物。倒数代表 &#34;瘫痪百分比&#34;. 使用在线分析工具 OASIS（<a href="https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/" target="_blank">https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/</a>进行对数秩统计分析。</li>
</ol>
5. 神经元病理学检测：联合体分析
<ol>
	<li>利用 unc-47 启动子构建在 GABA 能神经元中表达目标 RAN 肽的转基因 C. elegans。同时表达 unc-47p::GFP 或 unc-47p::RFP，以显示 GABA 神经元的细胞形态。</li>
	<li>挑选 50 只转基因 L4 期动物，将其置于 6 cm 的 OP50 平板上，在 25 °C 条件下培养 24 小时。</li>
	<li>将这 50 只转基因动物转移至一个新的 6 cm OP50 平板中，在 25 °C 条件下继续培养 24 小时。</li>
	<li>制备琼脂糖垫，用于在宽场显微镜下对动物进行成像。
	<ol>
		<li>在两张载玻片的顶部各贴一条胶带，将一张未贴胶带的洁净载玻片置于这两张带胶带的载玻片之间。</li>
		<li>使用一次性无菌移液管，将约 100 µL（一次性塑料巴斯德移液管中的一滴）熔融的 3% 琼脂糖滴加至中间的载玻片上。</li>
		<li>立即在熔融琼脂糖液滴上放置第二张洁净的载玻片，使其架在两侧带胶带的载玻片上，从而在两张载玻片之间形成一层薄而均匀的琼脂糖层。</li>
		<li>待琼脂糖冷却并凝固后，小心地将两张载玻片连同夹在其中的琼脂糖层一起取下，不要分开，将其放入塑料袋中，并在下方垫一张湿润的滤纸。每检测 10 只线虫制备一张载玻片，额外多准备三张。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从 25 °C 培养箱中取出转基因 C. elegans，挑选 10 只转基因 C. elegans 放入玻璃凹面载玻片中含 10 mM 左旋咪唑的 100 µL 液滴中。孵育 10 分钟，直至动物完全麻痹。</li>
	<li>从塑料袋中取出一对载玻片，小心地将其分开。在带有琼脂糖的载玻片上标记基因型，并在琼脂糖中央加入 2 µL 的 10 mM 左旋咪唑。将 10 只动物转移至琼脂糖垫上的左旋咪唑液滴中，盖上 #1 厚度的盖玻片。</li>
	<li>选择成像时使阴门朝向位于动物右侧的个体。若阴门位于头部左侧，则运动神经元的联合支将位于动物体下方，难以清晰观察，从而影响准确量化。此类个体应排除在量化分析之外。在此取向下，运动神经元的联合支最靠近盖玻片，在倒置宽场荧光显微镜下清晰可见。使用 Leica DMI4000B 倒置宽场荧光显微镜，配备 63X 1.4X NA 油镜和 Leica L5 GFP 滤光片组（激发光 480/40 nm；发射光 527/30 nm），观察表达 GFP 的神经元联合支。若神经元联合支表达的是 RFP 而非 GFP，则使用 Leica TX2 RFP 滤光片组（激发光 560/40 nm；发射光 645/75 nm）。
	<ol>
		<li>使用配备 63x 1.4x NA 油镜和 GFP 滤光片组（Ex480/40 nm；Em527/30 nm）的倒置宽场荧光显微镜观察表达 GFP 的神经元联合支。若神经元联合支表达 RFP，则使用红色荧光蛋白（RFP）滤光片组（Ex560/40 nm；Em645/75 nm）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在盖玻片覆盖动物后 45 分钟内完成成像，以尽量减少因固定造成的毒性影响。</li>
	<li>对每只线虫，统计可见联合支的数量。野生型动物中通常有 16 条可见联合支。同时统计联合支中出现大颗粒（即泡状结构，blebs）的数量以及断裂联合支的数量。为确认联合支是否断裂，需通过调节焦平面，追踪其从背侧神经索至腹侧神经索的连续性。 
	注：若 unc-47p::GFP 荧光在联合支中出现断裂间隙，则视为断裂。断裂处通常在两侧伴有泡状结构，有助于判断断裂。对 20 只线虫分别统计泡状结构和断裂的数量。</li>
	<li>计算每只动物中具有泡状结构或断裂的联合支占所有观察到的联合支总数的比例。也可测量每只动物中实际计数的联合支总数（包括野生型、有泡状结构和断裂的事件）。</li>
	<li>对每一类数据，计算均值 ± 标准差（SD），并采用 Student's t 检验对两个群体进行比较，或采用单因素方差分析（one-way ANOVA）对三个或更多群体进行统计分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文报道了可用于检测在 C. elegans 肌肉或神经元中模拟的 RAN 肽毒性的实验方法。尽管神经退行性蛋白在人类患者中表现为年龄依赖性的表型，但在模型系统中过表达时，也可能表现出发育毒性。过表达虽存在显著的解释局限性，但它为开展遗传学或药理学筛选提供了有力的起点，可用于鉴定能够逆转毒性表型的基因或药物。这一点尤为重要，因为大多数精确的动物疾病模型要么无表型，要么表型较弱，不适合用于无偏倚的筛选策略24,25,26。我们建立的 C. elegans RAN 肽模型及检测方法，与其他 RAN 肽模型系统（如酵母和 Drosophila）互为补充，是研究这些新发现蛋白毒性相关细胞通路的有力工具。
肌肉表达的 RAN 多肽的条件性毒性 
测量 RAN 多肽的毒性需要一段追踪期，以消除 gfp(R...

DNA重复序列的异常扩增是多种神经退行性疾病（如肌萎缩侧索硬化症（ALS）、额颞叶痴呆（FTD）和亨廷顿病（HD））的遗传基础1。尽管已有成熟的细胞和动物模型用于研究这些疾病，但其潜在的发病机制仍不明确。例如，亨廷顿病是由亨廷顿蛋白（Htt）编码序列中的CAG重复序列扩增所致2。由于CAG编码氨基酸谷氨酰胺，CAG重复扩增导致在Htt蛋白中插入一段多聚谷氨酰胺（polyGlutamine，简称polyQ）序列。扩增后的polyQ蛋白会以长度和年龄依赖的方式形成蛋白聚集体，并与细胞毒性相关3,4。然而，最近两项研究表明，polyQ序列的长度并非驱动亨廷顿病发病的主要因素，提示polyQ非依赖性因素也可能参与疾病的发生5,6。
一种可能的非多聚谷氨酰胺（polyQ）机制涉及一种新发现的蛋白质翻译方式，称为Repeat Associated Non-AUG-dependent（RAN）翻译7。顾名思义，RAN翻译仅在存在扩增的重复序列时发生，且不需要经典的起始密码子。因此，RAN翻译可在重复序列的所有三个阅读框中进行，产生三种不同的多肽。此外，由于许多基因还会产生包含扩增重复序列反向互补链的反义转录本，RAN翻译同样可在反义转录本的全部三个阅读框中发生。综上所述，RAN翻译使得含有扩增重复序列的DNA片段所产生的蛋白质数量从一种肽增加至六种肽。迄今为止，已在至少八种不同的重复序列扩增疾病中观察到RAN翻译现象8。在患者死后组织样本中可检测到RAN多肽，且仅出现在携带扩增重复序列的患者中9,10。尽管这些多肽明确存在于患者细胞中，但其在疾病病理生理过程中的作用尚不明确。
为了更明确地界定与RAN多肽相关的潜在毒性，多个研究团队已在多种模型系统（如酵母、果蝇、小鼠和组织培养细胞）中分别表达了每种多肽11,12,13,14,15,16。这些模型并未使用重复序列进行表达，而是采用密码子变异策略，即在消除重复序列的同时保留其氨基酸序列。翻译起始通过经典的ATG启动，且多肽通常在N端或C端与荧光蛋白融合，而这种融合似乎不会干扰RAN多肽的毒性。因此，每个构建体均可过表达一种单一的RAN多肽。在多细胞生物中建立不同RAN产物的模型，并结合简单的检测方法来评估RAN多肽的毒性，对于理解每种致病性重复序列扩增所产生的不同RAN产物如何导致细胞功能障碍和神经退行性变具有至关重要的意义。
与其他模式系统一样，C. elegans 提供了一个灵活且高效的实验平台，可用于研究新的疾病机制，例如 RAN 多肽毒性。线虫具有一些在其他 RAN 多肽毒性模型中目前尚不具备的独特实验特性。首先，C. elegans 从出生到死亡始终具有光学透明性，这使得研究人员能够简便地观察 RAN 多肽的表达与定位，并在活体动物中进行神经退行性变的体内分析。其次，构建表达 RAN 多肽的转基因模型的方法成本低且速度快。鉴于 C. elegans 短达三天的生命周期，可在一周内获得以细胞类型特异性方式表达任意给定 RAN 多肽的稳定转基因品系。第三，简单的表型输出可与遗传筛选方法（如化学诱变或 RNAi 筛选）相结合，从而快速鉴定对 RAN 多肽毒性至关重要的基因。最后，C. elegans 较短的寿命（约 20 天）使研究者能够探究衰老——大多数重复序列扩增疾病的最大风险因素——如何影响 RAN 多肽毒性。综上所述，这种实验特性的组合在其他任何模型系统中均无与伦比，为研究 RAN 多肽毒性提供了一个强大的平台。
本文介绍了多种利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）实验优势的检测方法，用于评估RAN多肽的毒性，并鉴定影响该毒性的遗传修饰因子。通过改变密码子、由ATG起始的RAN多肽与绿色荧光蛋白（GFP）融合，分别在肌细胞（在myo-3启动子驱动下）或GABA能运动神经元（在unc-47启动子驱动下）中单独表达。在肌细胞中表达时，重要的是将有毒性的RAN多肽标记上绿色荧光蛋白（GFP）或其他可用RNAi饲喂载体靶向的荧光蛋白（FP）标签，因为有毒RAN多肽的表达通常会阻断生长，导致菌株无法存活。通过条件性使用gfp(RNAi)可暂时抑制RAN多肽的表达，从而实现菌株的保种、遗传杂交等操作。在进行检测时，将动物从gfp(RNAi)环境中移除，即可恢复RAN多肽的表达并观察其表型效应。除了描述设计密码子变异RAN多肽表达载体的分子策略外，本文还介绍了用于检测发育毒性（幼虫运动能力与生长检测）、发育后年龄相关毒性（麻痹检测）以及神经元形态缺陷（连合神经纤维检测）的实验方法。

<table><tbody><tr><td>35毫米 × 10毫米无菌培养皿</td><td>CELLTREAT Scientific Products</td><td>50-202-036</td><td>线虫生长平板和RNAi</td></tr><tr><td>琼脂颗粒，2千克</td><td>BD DIAGNOSTIC SYSTEMS</td><td>DF0145070</td><td>线虫生长平板和RNAi</td></tr><tr><td>超纯琼脂糖</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td>16500500</td><td>显微注射以构建RAN肽转基因品系</td></tr><tr><td>羧苄青霉素，5克</td><td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td><td>BP26485</td><td>线虫生长平板和RNAi</td></tr><tr><td>1号盖玻片，22毫米，1盎司/包</td><td>THERMO SCI ERIE</td><td>12542B</td><td>联合束实验成像</td></tr><tr><td>一次性显微注射针头，20盒</td><td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td><td>E5242952008</td><td>显微注射以构建RAN肽转基因品系</td></tr><tr><td>1号方形盖玻片，40×22毫米，1盎司/包</td><td>THERMO SCI ERIE</td><td>125485C</td><td>显微注射以构建RAN肽转基因品系</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>THERMO SCI ERIE</td><td>12-550-15</td><td>联合束实验成像</td></tr><tr><td>Gibco&amp;nbsp;Bacto蛋白胨&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>DF0118-17-0</td><td>线虫生长平板和RNAi</td></tr><tr><td>卤代烃油700</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>H8898-50ML</td><td>显微注射以构建RAN肽转基因品系</td></tr><tr><td>IPTG生物技术级，10克</td><td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td><td>BP162010</td><td>线虫生长平板和RNAi</td></tr><tr><td>Leica高级荧光成像软件</td><td>Leica Microsystems</td><td>LAS-AF</td><td>用于视频速度分析和联合束实验的图像采集软件</td></tr><tr><td>Leica浸油型N（油）</td><td>W NUHSBAUM INC</td><td>NC9547002</td><td>联合束实验成像</td></tr><tr><td>盐酸左旋咪唑，10克</td><td>THERMO SCI ACROS ORGANICS</td><td>AC187870100</td><td>联合束实验成像</td></tr><tr><td>MICROLOADER加样头，2×96个</td><td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td><td>E5242956003</td><td>显微注射以构建RAN肽转基因品系</td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; 培养皿，60×15毫米，500个/箱</td><td>CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC</td><td>FB0875713A</td><td>线虫生长平板和RNAi</td></tr><tr><td>组织培养板，24孔，50个/箱</td><td>CORNING LIFE SCIENCES DL</td><td>87721</td><td>线虫生长平板和RNAi</td></tr></tbody></table>

在 c. elegans 中测量 ran 肽的毒性

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans 常被用于模拟由重复序列扩增突变引起的年龄相关性神经退行性疾病，例如肌萎缩侧索硬化症（ALS）和亨廷顿病。最近研究表明，含有重复序列扩增的 RNA 可作为一类新型蛋白质翻译的底物，该过程被称为非 AUG 起始密码子依赖性重复序列相关翻译（RAN 翻译）。与经典的翻译方式不同，RAN 翻译不需要起始密码子，仅在重复序列长度超过某一阈值时发生。由于缺乏起始密码子来确定阅读框，RAN 翻译可在含有重复序列扩增的正义和反义 RNA 模板上，以所有三种阅读框进行。因此，RAN 翻译将可能与疾病相关的毒性多肽种类从一种增加到六种。迄今为止，已在八种不同的重复序列扩增相关的神经退行性和神经肌肉疾病中观察到 RAN 翻译现象。在每种情况下，明确哪些 RAN 翻译产物具有毒性，以及其毒性作用机制，是理解这些多肽如何参与疾病病理生理过程的关键步骤。本文中，我们介绍了在模式系统 C. elegans 中评估 RAN 多肽毒性的策略。首先，我们描述了检测 RAN 多肽对发育中 C. elegans 生长和运动能力影响的实验方法。其次，我们详细说明了一种用于评估 RAN 多肽在发育完成后随年龄增长而产生的运动功能影响的检测方法。最后，我们介绍了一种用于评估 RAN 多肽对神经元形态影响的神经毒性检测方法。这些检测方法可全面评估 RAN 多肽的毒性效应，有助于开展大规模的遗传学或小分子筛选，以揭示疾病机制或发现潜在治疗手段。

我们采用此处描述的实验方法，评估了不同基因抑制对肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者中携带G4C2重复扩增所产生的RAN二肽毒性的影响。通过生长实验检测发育毒性，我们分析了在全基因组RNAi筛选中鉴定出的多个基因敲除突变体对肌肉表达PR50-GFP毒性的抑制作用。单独表达PR50-GFP即可导致完全外显的生长停滞，而多个基因的功能缺失突变可使PR发育毒性抑制程度达到12–94%（图1A）。
我们还采用视频速度分析方法，检测了特定基因敲低对表达PR50的动物发育运动能力的影响。结果与预期一致， gfp(RNAi) 与对照组相比，运动能力显著增强 空载体（RNAi） 由于PR50-GFP表达受到抑制。我们还发现，针对蛋白酶体亚基的RNAi rpn-7 导致PR50运动能力显著增强（图1B).
肌萎缩侧索硬化症（ALS）与许...

与重复序列相关的非ATG依赖性翻译产物正逐渐被认为是多种重复序列扩增疾病中的致病特征。本方案旨在利用模式生物线虫C. elegans的行为学和细胞学检测方法，评估这些多肽所引起的毒性作用。

在 C. elegans 中测量 RAN 肽的毒性

秀丽隐杆线虫常被用于建立由重复序列扩增突变引起的年龄相关性神经退行性疾病的模型，例如肌萎缩侧索硬化症……

RAN多肽是亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆等重复序列扩增性神经退行性疾病的重要特征。这些实验方案为在秀丽隐杆线虫（C.elegans）模型系统中定量评估RAN多肽的毒性提供了重要的标准化方法。所述技术易于掌握、成本低廉、操作快速，并可利用秀丽隐杆线虫系统中运动和繁殖等可重复的生物学特征。在尝试本方案时，主要挑战在于获得稳定的RAN肽毒性和表达水平。需要控制的主要因素包括药物温度、温度变化的时间点以及检测板的制备。在这一依赖年龄的过程检测中，实验人员对动物表型进行一致分类至关重要。该技术的可视化演示展示了其分类标准。首先，将含有1毫摩尔IPTG和25微克/毫升羧苄青霉素的标准线虫生长培养基倒入24孔板中。将RNAi诱导克隆在HT115菌株中接种于LB羧苄青霉素琼脂平板上，并在37摄氏度下培养24小时。第二天，挑取单克隆接种于1 mL含羧苄青霉素的LB液体培养基中，于37摄氏度、250 rpm振荡培养18小时。按照文本手稿中的描述，将过夜培养的菌液各20微升分别点种到NGM RNAi 24孔板的四个独立孔中，使RNAi细菌在过夜期间诱导双链RNA的产生。采用标准次氯酸钠法，从表达整合型RAN肽转基因的C.elegans成虫第一天个体中分离卵。然后将约30枚卵接种至24孔板的每个孔中，于20°C下孵育7天。为进行视频速度分析，使用配备单色相机的体视解剖显微镜，从每种RNAi条件下两个独立的孔中各获取两段视频。确保各孔之间的图像采集参数设置保持一致。每段视频的持续时间设为10秒，时间间隔设为76毫秒。图像曝光时间设为4毫秒，使用1.49倍的缩放设置。然后选择2×2像素合并模式。确认分辨率为 800 × 600 像素，然后开始录制。采集完成后，立即使用菌株、RNAi 条件和孔号对每个视频进行标记。随后，对每个视频中的 20 只不同动物测量其移动距离和体长，每种 RNAi 条件共检测约 40 只线虫。在软件中，选择注释工具按钮，然后选择绘制文本工具。在视频第一帧中被测线虫的中心位置单击，并用一个数字标记该点。在视觉上追踪线虫的同时，将视频推进至末尾。然后点击线虫，并用下一个相应的编号标记它。使用绘制比例尺工具，从第一个编号画一条线到第二个编号，并在电子表格中记录所移动的距离。在视频中对另外19条线虫重复此测量过程，并在分析窗口中保留每一条线虫的个体测量数据。完成所有测量后，截取最终视频帧的快照，以显示所有测量线，确保数据可追溯至其来源个体。接下来，使用一个四列电子表格分析数据，其中第一列为线虫标识符，第二列为运动速度。每个视频的时间可以通过在实验下方的视频上单击右键并查看属性找到。为了标准化速度测量，请测量每只动物的长度。使用绘制折线工具，自由地从秀丽隐杆线虫（C.elegans）头部尖端到尾部尖端进行描记。然后截取最终视频帧的快照，以显示所有多段线。线条的长度将在统计结果中记录。在电子表格中添加两列，一列为动物体长，另一列为归一化速度。最后，使用单因素方差分析（one-way ANOVA）对归一化速度数据进行分析，并以空载体RNAi作为对照进行事后检验。将四至六条表达RAN肽段GFP的转基因L4期秀丽隐杆线虫（C. elegans）置于直径六厘米的GFP RNAi平板上，在20摄氏度条件下培养。若实验利用RNAi检测特定基因对RAN肽段毒性的遗传效应，则将10条转基因的成年 gravid 线虫转移至两个分别含有空载体RNAi、GFP RNAi或基因特异性RNAi的平板中。若使用突变体分析RAN多肽毒性中的遗传效应，则将表达相同RAN转基因的10只成年野生型或突变型线虫分别放置于两块空载体RNAi或GFP RNAi平板上。在20摄氏度下培养48小时。从RNAi平板上挑选10组转基因L4期幼虫，每组10只，将每组分别转移至一块3厘米的RNAi平板上。确保用于检测的线虫均具有表面正常的运动能力。将培养皿放入塑料袋中以保持湿度，并在25摄氏度下孵育。24小时后，通过轻敲体视显微镜下的培养皿并观察其运动情况，分析动物的活动能力。如果线虫移动距离超过一个体长，则记为可移动，并将其转移至新的三厘米RNAi平板。用铂金丝挑取剩余线虫的头部和尾部进行轻触。若该个体移动距离超过一个体长，则记为可移动，并将其转移至新的三厘米RNAi平板。如果在第二天时，空载体对照组中未观察到明显的麻痹现象，则终止实验并重新开始。将所有不移动的线虫归为一组，以便于检测其移动是否超过一个体长。计数所有麻痹、产卵袋或死亡的线虫，并丢弃该培养板。每天继续对动物的瘫痪情况进行评分，持续五到七天。采用生长测定法来检测基因抑制对ALS患者中带有G4C2重复扩增所产生RAN二肽毒性的影响。单独表达PR50 GFP导致完全的生长停滞，但多个基因的敲低可抑制这种发育毒性。采用视频速度分析方法，检测了特定基因敲低对表达PR50的动物发育运动能力的影响。与空载体RNAi相比，PR50 GFP表达的抑制导致运动能力显著增强，这与预期结果一致。此外，针对蛋白酶体亚基RPN7的RNAi也导致PR50运动能力显著提高。通过年龄依赖性麻痹实验分析成虫表型时，PR50 GFP 在五天龄时表现出高达 80% 的麻痹率。然而，针对 cul-6 基因的 RNA 干扰显著延缓了麻痹的发生，表明 cul-6 对 PR50 GFP 的毒性作用是必需的。为了确定 RAN 蛋白在秀丽隐杆线虫（C. elegans）神经元中表达时是否引起神经病理学变化，利用神经突触轴突投射检测法（commissure assay）检测了神经元特异性的毒性。在成年两天的个体中，运动神经元中 PR50 GFP 的表达导致运动神经元出芽现象显著增加。这种神经病理学表型可被胰岛素/IGF-1受体基因同源物 DAF-2 的突变显著抑制，该突变可延缓多种神经退行性蛋白的毒性特征。在行为学检测中，RAN 多肽产生高度外显的表型至关重要。这些基因或药物可能为RAN多肽疾病提供新的生物标志物或治疗方案。利用这些检测方法，我们进行了全基因组范围的RNAi筛选，以寻找可抑制C9ORF72相关RAN多肽（脯氨酸-精氨酸）的抑制因子。本筛选鉴定出多个全新且保守的基因，这些基因将成为未来机制研究的重点对象。

measuring-ran-peptide-toxicity-in-c-elegans

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科研

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Biology

生物学

测量在C.elegan的RAN肽毒性

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