从癌细胞培养物中收集的介质光谱分析的选定金核素的同步量化
May 9th, 2020
这里描述的是一个协议，用于确定从液体色谱分析的癌细胞培养物中收集的介质中产生的四种不同的色氨酸代谢物（金黄素、3-羟基核素、Xanthurenic酸、3-羟基苯甲酸）。
犬尿氨酸与包括癌症在内的多种疾病的免疫反应调节有关。鉴定多种犬尿氨酸的可靠且经过验证的方法有助于开发更有效的疗法。我们的方案使用液相色谱法与质谱法相结合来鉴定从癌细胞培养物中收集的培养基中犬尿氨酸途径产生的不同色氨酸代谢物。
在样品制备或数据采集和解析步骤中，没有经验的用户可能会遇到一些困难。通过遵循我们的协议和建议，可以避免错误并获得可靠的数据。要制备试剂的储备液，请在小瓶中称取 0.3 毫克每种试剂至最高准确度，并将每种试剂溶解在 300 微升适当的溶剂中，以获得每种试剂的每升 1 克储备液。
要制备经木炭处理的培养基，请在锥形管中称取 280 毫克活性炭，并加入 5 毫升制备用于培养目标细胞的液体培养基。在跷跷板摇杆上摇动装有培养基和木炭的试管，在室温下每分钟振荡 50 次 2 小时。在孵育结束时，通过离心沉淀木炭，小心收集上清液，不要干扰木炭，然后使用 0.45 微米注射器过滤器过滤培养基。
为了制备校准溶液，在木炭处理的培养基中加入 0.75 微升 0.1 克/升 3NT 溶液，并添加 3-H 犬尿氨酸、3-HAA 犬尿氨酸和黄藤酸至至少六种不同的浓度，以覆盖所有校准范围，最终体积为每样品 150 微升。涡旋后，向每根试管中加入 150 微升零下 20 摄氏度的冷甲醇，补充有 1% 甲酸进行样品脱蛋白，然后再次盖紧并涡旋试管。在零下 20 摄氏度下孵育 40 分钟后，离心样品并使用自动移液器将 270 微升每种上清液转移到单独的平底玻璃瓶中。
将样品瓶放入蒸发器中，使用适用于水甲醇馏分的程序轻轻蒸发挥发性组分约 30 分钟。试管干燥后，将每个样品放入 60 μL 0.1% 甲酸的水中复溶，涡旋样品，然后将每种溶液转移到单独的 1.5 mL 试管中进行离心。在不干扰沉淀物的情况下，将上清液转移到带有锥形玻璃插件的色谱样品瓶中，然后将样品瓶放入 LC-MS 自动进样器中。
在运行样品之前，使用流动相吹扫液相色谱系统以去除气泡并灌注所有溶剂通道。接下来，用100%乙腈冲洗保护柱和分析柱约30 min，然后用100%溶剂A冲洗系统，直到观察到色谱柱中的压力稳定，然后在数据采集软件中设置适当的液相色谱参数，并构建一个工作列表，以便在液相色谱系统上运行样品。为了构建校准曲线，在数据采集软件中，将校准标准品添加到工作列表中，一式三份运行标准品，然后积分并测量对应于 3-羟基犬尿氨酸、犬尿氨酸、3-羟基邻氨基苯甲酸、3-硝基酪氨酸和黄藤酸的峰面积，保留时间分别约为 4.4、10、16、21 和 30 分钟。
为了从体外细胞培养物中收集上清液样品，在对目标细胞进行标准细胞培养 48 小时后，将每个孔中的 500 微升上清液转移到单独的 1.5 毫升试管中，并通过离心去除细胞碎片，然后将培养基上清液转移到新试管中，在零下 80 摄氏度下储存直至分析，并将细胞沉淀保持在零下 20 摄氏度，直至蛋白质估计分析。为了制备用于 LC-MS 分析的样品，将 149.25 μL 解冻的培养基样品转移到新的 1.5 μL 试管中，并向每试管中加入 0.75 μL 0.1 g/L 3NT 溶液。如图所示制备样品后，向每个试管中加入 150 微升零下 20 摄氏度的甲醇，并补充有 1% 甲酸，并制备样品用于 LC-MS 分析，如图所示。
工作列表完成后，测量每种分析物的峰面积，并使用专用于每种分析物的单独线性校准方程来计算每个实验样品中存在的分析物的浓度。为了评估与培养基样品相对应的细胞蛋白含量，将每个细胞沉淀重悬于 100 微升 PBS 中，并将样品在零下 20 摄氏度下冷冻一小时，然后在冰上解冻。将样品冻融 3 次后，通过离心收集细胞裂解物，并将上清液转移到新试管中，而不会干扰沉淀。
用新鲜 PBS 将样品稀释 10 倍，并将适当体积的牛血清白蛋白标准溶液一式两份添加到 96 孔板的相应孔中。将 10 至 15 μL 的每种细胞裂解物样品上清液上清液上样到 96 孔板的相应孔中，并填充标准孔和样品孔，使每孔的最终体积为 50 μL PBS。接下来，向每个孔中加入 200 微升用超纯水稀释 5 次的 Bradford 试剂，并在室温下孵育板至少 5 分钟。
孵育结束时，将板加载到酶标仪上并测量 595 纳米处的吸光度，然后构建校准曲线以允许计算每个样品中的蛋白质量，并将每个犬尿氨酸的浓度除以总蛋白质含量，以标准化每个样品中的犬尿氨酸含量每一微克蛋白质。以下是在分析每升含有 4.5 克 D-葡萄糖和 10% 胎牛血清的培养基时获得的单四极杆质谱结果。请注意小峰，表明样品中存在犬尿氨酸。
在需要实际样品数据之前运行质量控制样品，以确认分析物的适当保留时间，因为可能会观察到 LC 信号的变化或失配。共洗脱基质组分可以生成为目标分析物选择主电荷比的离子。例如，在该分析中，来自未知化合物的峰出现在监测主电荷比 206 的离子的扫描周期中。
由于保留时间的不相容性，信号与分析物不对应。尽管色氨酸同位素与主电荷比 206 共享相同的离子，但色谱分析显示色氨酸信号与黄素酸信号分离良好，表明测试癌细胞培养基中存在的色氨酸水平不会影响黄素酸的定量。对来自两种癌细胞系的培养基的分析表明，评估的人上皮乳腺癌细胞释放不同量的色氨酸代谢物，而测试的人卵巢癌细胞产生明显更高水平的犬尿氨酸。
在样品制备过程中使用内标有助于实现可靠的数据采集。将数据标准化为蛋白质含量可校正单个孔内的细胞数量变化。我们的方案可以进一步扩展以确定其他分析物，但可能会在不同的实验条件下在培养基中积累。
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概述
本协议概述了一种确定癌细胞培养物中来自犬尿氨酸途径的四种色氨酸代谢物的方法。利用液相色谱与质谱联用技术，为研究人员提供了一种可靠的方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 癌症研究
背景
- 犬尿氨酸在免疫反应调节中发挥作用。
- 它们与各种疾病相关，包括癌症。
- 识别犬尿氨酸可以带来更好的治疗策略。
- 可靠的识别方法对研究至关重要。
研究目的
- 建立一个经过验证的方法来识别犬尿氨酸代谢物。
- 帮助研究人员从癌细胞培养物中获得准确的数据。
- 在样品制备和数据解释过程中最小化错误。
使用的方法
- 液相色谱与质谱联用。
- 样品制备涉及精确称量和溶解试剂。
- 收集癌细胞培养物的培养基进行分析。
- 逐步建议以确保可靠性。
主要结果
- 成功识别了犬尿氨酸代谢物。
- 验证了协议的可重复性。
- 为用户提供避免常见陷阱的指导。
- 增强了对犬尿氨酸途径代谢物的理解。
结论
- 该协议提供了一种可靠的代谢物识别方法。
- 它支持有效癌症治疗的开发。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上进行进一步的洞察。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of kynurenine metabolites in cancer cell culture medium enables mechanistic de-risking of tryptophan pathway targets in immuno-oncology. This LC-SQ method provides predictive confidence for target validation by delivering reproducible, quantitative readouts of pathway activity. It supports early discovery decisions by linking metabolite profiles to cellular phenotypes in a scalable, cost-effective format.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tryptophan catabolite generation to assess pathway modulation in cancer models.
- Operational Value: Provides quantitative biomarker readouts for functional target validation using accessible LC-SQ instrumentation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating kynurenine levels with immunosuppressive phenotypes in vitro.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Delivers standardized, reproducible quantification of four kynurenines in complex cell culture supernatants.
- Scalability: Uses simple sample preparation and internal standardization to enable multi-well plate analysis.
- Analytical Robustness: Employs SIM mode and 3-nitrotyrosine as a universal internal standard to minimize matrix effects and ensure cross-run consistency.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Normalizes metabolite data to total protein content, enabling cross-condition and cross-cell line comparisons.
- Disease-Relevant System: Validated in human ovarian and breast cancer cells, supporting relevance to solid tumor models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed immune modulation correlates with tryptophan metabolite secretion, reducing false-positive target hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, providing metabolic phenotyping that informs target engagement and pathway modulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying pathway flux through measurement of downstream tryptophan catabolites.
- Screening: Enables assay-ready metabolite profiling for compound library screening in immunomodulatory programs.
- Analytics: Generates peak area-based quantification via SIM mode, allowing precise comparison of analyte concentrations across experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro metabolite secretion to immunosuppressive potential, supporting biomarker-aligned preclinical advancement.
- Enterprise Reuse: Leverages widely available LC-SQ platforms, making it a cost-effective, reusable capability across oncology and immunology teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in kynurenine pathway modulation by providing direct metabolite measurements.
- Operational Value: Ensures reproducibility through internal standardization, protein normalization, and QC samples to monitor retention time stability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by quantifying target pathway activity, reducing reliance on surrogate markers.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on metabolite-driven mechanism of action.
Implementation Considerations
- Requires expertise in LC-MS method development, including SIM optimization and mobile phase preparation.
- Dependent on access to LC-SQ systems and capability to perform protein normalization via Bradford assay.
- Necessitates standardization of sample collection timing (e.g., 48-hour culture) and supernatant handling to minimize variability.
- Requires validation of internal standard suitability across diverse cell lines and culture conditions.
- Limited to analytes with compatible ionization and chromatographic separation under the described LC-SQ conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:57
3-Nitrotyrosine (3NT), Kynurenine (Kyn), 3-Hydroxykynurenine (3HKyn), 3-Hydroxyanthranilic Acid (3HAA), Xanthurenic Acid (XA) and Charcoal Treated Culture Medium Preparation
1:58
Calibration Solution Preparation
3:42
Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS) System Setu
4:20
Calibration Curve Construction
4:55
Sample Collection
5:33
Sample Preparation for LC-MS Analysis
6:30
Protein Content Assessment and Data Normalization
8:12
Results: Representative LC-MS Data of Selected KYNURENINES Determination
9:57
Conclusion
