植物组织细胞壁中阿拉伯半乳聚糖蛋白和果胶的荧光免疫定位

仅一次实验所产生的信息量就极为庞大。我们能够检测到这些细胞壁多糖的存在，并精确了解它们在细胞和组织中的分布情况，甚至还能确定其丰度。该方法的设计使其几乎可应用于任何需要分析的植物物种的各类组织。

植物组织中的免疫定位涉及大量精细操作，若不实际观察操作过程则难以解释清楚。在采集植物组织样品前，先用玻璃小瓶装入足量的冷固定液，确保能够完全浸没所有样品。然后选择需要分析的植物组织，并将样品修剪至面积不超过16平方毫米。

立即将样品浸入固定液中。戊二醛和甲醛都是优良的固定剂，但二者均具有危害性，必须在通风橱中操作。将样品管转移至真空室，缓慢施加真空。

当压力达到负60千帕时，小瓶中的漂浮物将开始下沉至底部。保持腔室内的压力不超过负80千帕。下沉过程可能需要长达两个小时。

将样品置于真空室中两小时后，缓慢释放真空。密封玻璃小瓶，并在4°C下冷藏过夜。过夜固定后，弃去未沉至小瓶底部的样品。

用25毫摩尔的PBS缓冲液清洗剩余样品10分钟，然后用25毫摩尔的PIPES缓冲液清洗20分钟。必须彻底清除所有漂浮的样品，因为这些样品很可能尚未被固定剂充分渗透。将样品置于乙醇系列中进行脱水处理，每种浓度的乙醇中浸泡20分钟。

为了灌注样品，需在乙醇中逐步增加LR-white树脂的浓度，起始比例为一份树脂加三份乙醇。每种浓度下均在4°C条件下孵育24小时。随后更换新鲜的LR-white树脂，并在4°C条件下继续孵育样品额外12小时。

准备包埋用明胶胶囊，选择略大于样品的胶囊，以便样品能完全被树脂包埋。使用铅笔在纸质标签上标记，因为墨水会污染树脂。在每个胶囊底部加入一滴新鲜的LR-white树脂。

将样品放入每个胶囊中，然后用新鲜树脂将胶囊填充至最大容量。盖上胶囊盖，轻轻按压以密封。为使树脂聚合，将胶囊在58摄氏度下固化24至48小时，直至完全硬化。

剥去LR-white树脂的明胶胶囊后，将树脂块置于体视显微镜下。使用锋利的剃刀刀片，以与样品成45度角的方向修切LR-white树脂块。旋转样品，再以与第一次切面成90度角的方向进行第二次切割。

按照相同方式继续切割，形成一个棱锥，使棱锥的顶点正好位于样品感兴趣区域的正上方，然后开始沿垂直于主轴方向逐次去除薄层，直至切割面到达样品。理想情况下，目标样品应被包裹成一个梯形结构。将修整好的树脂块放入超薄切片机中。

调整刀刃与树脂块之间的角度。从块中切下厚度为200至700纳米的切片。使用金属丝环小心地从切片机上提起部分样本切片。

将它们置于载玻片上的一滴去离子蒸馏水中。将载玻片放在50摄氏度的加热板上，蒸发水分，然后向切片滴加一滴染色剂。30秒后，洗去染色剂，在显微镜下观察切片，以确认切片的整体状态以及目标植物结构是否可见。

通过在载玻片的每个孔中加入一滴去离子蒸馏水来准备干净的反应载玻片。将一至两个样品切片转移至每滴水中。将载玻片放入直径10厘米的方形培养皿中，盖上盖子，并在50摄氏度下干燥。

为反应载玻片准备孵育室时，将一些润湿的纸巾放在移液器吸头盒底部，并用铝箔包裹该盒子。将载玻片从盒子转移到孵育室中。向每个孔中加入50 µL封闭液。

孵育切片10分钟后，移除封闭液，然后用PBS洗涤所有孔，每次10分钟，共洗两次。按照文稿中所述方法配制一抗溶液后，用去离子水对各孔进行最后一次洗涤，持续5分钟。用移液器将一抗溶液加入反应孔中，再用移液器将封闭液加入对照孔中。

关闭孵育室，室温静置两小时，随后在4°C下冷藏过夜。用封闭液配制1%的二抗溶液。

每孔约需40微升。用铝箔覆盖溶液。用PBS洗涤反应玻片的各孔两次，每次10分钟，再用去离子蒸馏水洗涤一次，每次10分钟。

确保孔中无任何封闭液或沉淀残留。将二抗溶液加入所有孔中。将玻片在室温下避光孵育三至四小时。

再次用 PBS 清洗反应玻片的各孔两次，再用去离子蒸馏水清洗一次，然后向每个孔中加入一滴 Calcofluor White。无需清洗，直接向每个孔中加入一滴封片剂，并用盖玻片覆盖每个孔。使用荧光显微镜观察反应玻片中的样品切片。

每次观察时，使用紫外滤光片检测被Calcofluor染色的细胞壁，同时使用FITC滤光片检测免疫定位。为了更清晰地显示结果，可使用ImageJ或类似的图像分析软件将每个紫外滤光片图像与相应的FITC滤光片图像进行合并。通过精确定位特定表位的位置，该实验方案可实现对细胞壁组分的表征。

例如，1,5-阿拉伯聚糖在发育中的栓皮栎（Quercus suber）花药细胞壁中含量丰富。低度酯化的同型半乳糖醛酸聚糖通常存在于栓皮栎胚胎根尖，决定器官的机械特性。木糖半乳糖醛酸聚糖则存在于退化细胞中，例如栓皮栎橡子成熟末期的胚乳细胞。

在与繁殖相关的结构中可发现被JIM13或JIM8识别的AGP表位，例如拟南芥中与小配子体发生相关的细胞系，以及基部被子植物水丝花（Trithuria submersa）的柱头乳突细胞和珠心组织。在实施本实验方案时常见的错误通常易于检测和识别。若省略洗涤步骤或反应孔干燥，二抗通常会出现弥散的条带。

如果未结合的一抗未被充分洗去，会形成绿色荧光团的聚集体。切片的折叠或脱落通常与粘附不良有关，原因可能是使用了不洁净的载玻片或洗涤过于剧烈。样本制备也至关重要。

树脂包埋块应无裂纹，样品呈浅黄色至浅棕色，清晰可见。包埋效果不佳的样品会出现粉状白色斑点或区域。为确保固定液充分渗透，样品尺寸应控制在8毫米以下。

固定不良的样品会呈现深棕色或近乎黑色。温度过高可能导致树脂开裂，使样品无法切片。免疫定位技术的应用为多个研究方向开辟了可能。

可以进一步采用更具体的技术，例如细胞壁的生物化学分析，甚至采用分子生物学方法。该技术所提供的结果有助于理解细胞壁的组成——这是一种极为复杂的结构，仅通过简单的化学分析很难进行研究。