Name: 测量组织肿瘤组织切片的实时药物反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学习器官型肿瘤组织切片实时药物反应测量技术，用于加速临床前药物开发与肿瘤学研究。该方法支持中等通量药物筛选，可直接在患者来源样本上评估药物对完整组织存活率的影响，兼容多种分子分析技术，为癌症生物学和神经科学研究提供可靠平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本工作由美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（NIH/NCI）[K22CA201229, P30CA015704]、Sidney Kimmel 基金会 [Kimmel 学者奖] 及肺癌发现奖（LCD-505536）资助。我们感谢 Alana Welm 博士（犹他大学）提供乳腺癌患者来源的异种移植（PDX）肿瘤。同时感谢 Fred Hutchinson 癌症研究中心（FHCRC）比较医学部门工作人员对 PDX 模型的维护，以及 Gujral 实验室成员提供的有益讨论。N.N.A. 受日本学术振兴会海外研究奖学金及 FHCRC 跨学科培训基金资助。A.J.B. 受 FHCRC 染色体代谢与癌症培训基金资助。

所有小鼠实验均按照《动物福利法》中《实验动物护理和使用指南》以及美国国立卫生研究院关于生物医学研究中动物护理和使用的指南建议进行。
1. 肿瘤组织切片的制备
<ol>
	<li>根据表1中的配方配制组织切片培养（TSC）培养基。使用0.45 µm真空滤器过滤培养基以实现灭菌。</li>
	<li>对于24孔板，每孔分装250 µL TSC培养基；对于6孔板，每孔分装1 mL培养基。将培养板置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中备用。 
	注意：培养基及添加剂可根据组织类型和实验目的进行优化。培养基的用量应恰好浸润培养插件的多孔膜，切勿超过膜的水平面。若培养基液面过高或过低，需调整体积。若研究人员正在测试免疫调节剂，建议在培养基中添加IL-210。</li>
	<li>若使用小鼠来源的肿瘤组织，采用推荐方法处死小鼠，用70%乙醇喷洒暴露的皮肤进行消毒，并在无菌条件下解剖获取肿瘤组织。将肿瘤组织置于含有冰浴Hank’s平衡盐溶液（HBSS）的离心管中保存。</li>
	<li>若使用新鲜的患者肿瘤组织，短期保存可置于冰浴HBSS中，长期保存（最长24小时）则建议使用冰浴Belzer威斯康星大学（UW）溶液，以维持组织活性。 
	注意：已成功制备过经冰浴UW溶液隔夜运输的PDX组织切片。</li>
	<li>将肿瘤组织转移至含有冰浴HBSS的10 cm培养皿中。在冰浴HBSS中用手术刀将肿瘤切成两半，使用直径为6 mm的活检打孔器将组织修整为圆柱形，并修剪一侧使其形成平坦表面。将处理后的组织保存于冰浴HBSS中备用。 
	注意：应避免包含组织中的坏死区域，该区域通常位于中心，呈不透明且脆弱的外观。</li>
	<li>设置振动切片机。使用70%乙醇对所有设备进行消毒。将覆盖有丙烯酸玻璃盖的振动切片机缓冲槽置于振动切片机冰浴中心位置。向冰浴中加入冰块，并向缓冲槽中注满冷却的HBSS，以确保切片过程中组织保持低温。将刀片安装至刀架上。 
	注意：尽管将振动切片机置于半无菌环境中未影响以往实验结果，但建议如有条件，应将其存放于生物安全柜内。</li>
	<li>使用齿状镊子小心从HBSS中取出打孔后的肿瘤组织，并用无绒纸巾轻拭以去除多余缓冲液。</li>
	<li>在标本台上滴加一滴医用级氰基丙烯酸酯胶水，将组织放置于胶滴上。室温下晾干胶水2–3分钟，然后将标本台放入缓冲槽中。补充适量HBSS，直至组织完全浸没于缓冲液中。 
	注意：将组织以直立、稳定的方式固定是获得均匀切片的关键。若固定后的组织不稳定，可选择在组织周围添加更多胶水以维持直立状态，或卸下组织、修平底部后重新粘贴。弹性较强的组织在切片过程中更容易被推挤或弯曲，此时可采用较短长度（&lt;5 mm）并进行多次切割。对于极为脆弱的组织，纸巾可能造成损伤；此时可将组织置于塑料表面以吸除部分多余的HBSS。</li>
	<li>调整振动切片机参数。以下为推荐设置：切片厚度 = 250 µm，振幅 = 3.00 mm，切片速度 = 0.01–0.25 mm/s，刀片角度 = 15°–21°。 
	注意：应根据组织硬度优化切片参数。较软的组织在较低速度和较大刀片角度下更易切割。对于小鼠4T1和PDX HCI010肿瘤组织，18°刀片角度、0.10–0.18 mm/s切片速度及3.00 mm振幅效果良好。较硬组织可采用更高的刀片速度进行切割。</li>
	<li>设定刀片的起始与终止位置，并调整载物台高度。以连续模式运行仪器，进行多轮切片，直至组织被均匀切割。</li>
	<li>继续切片操作。使用宽口移液器吸取少量HBSS缓冲液连同切片一起转移至含培养基的细胞培养插件中，利用负压完整提起切片。每个24孔板插件放置一个切片。6孔板插件可容纳最多四个切片用于重复实验。 
	注意：若组织切片末端仍与未切割组织相连，应停止振动切片机，使用两把精细镊子小心分离切片，避免触碰或戳破组织切片。使用单独的刀片有助于去除残留组织。</li>
	<li>使用细口移液器去除多余的缓冲液。</li>
	<li>当刀片接近已粘贴的组织时，停止仪器运行，降低载物台，用另一把刀片移除硬化组织，并安装新的组织样本。继续切片，直至收集到足够数量的切片。</li>
	<li>将培养板置于设定为37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养。组织切片位于细胞培养插件的气液交界面进行培养。初始切片制备后24–48小时，组织切片即可用于实验。如需长期培养，应每隔2–3天更换一次培养基。</li>
</ol>
2. 活性测定
<ol>
	<li>为测定组织切片的活力，按照制造商说明书，将培养基更换为含有荧光素酶和前体底物的发光法活力检测试剂，该试剂用TSC培养基以1:1,000比例稀释。该试剂通过检测活细胞将代谢的前体底物还原为荧光素的能力来评估细胞活力11。在每块组织切片上加入50 µL酶-底物混合液。</li>
	<li>将样本置于设定为37 °C、5% CO2的湿润培养箱内的旋转摇床上，轻柔振荡孵育过夜。</li>
	<li>可使用微孔板读数仪或活体成像仪器检测在24孔板中培养的组织的发光信号。若需在6孔板上分别测定多个组织的个体活力，应使用活体成像系统。
	<ol>
		<li>使用微孔板读数仪时，将微孔板去盖后放入仪器。任何能够检测发光强度的微孔板读数仪均适用于本实验。我们采用以下设置：读数时间 = 1 s，从顶部检测，增益 = 200。 
		注意：为提高检测准确性，建议使用白色壁的微孔板进行实验。已测试过白色壁、透明底的24孔板，在大多数情况下，透明孔板也不会影响实验结果。</li>
		<li>使用活体成像系统检测活力时，将培养板置于成像台中央，并移除盖子。先采集普通 photographic 图像，再采集发光图像，成像参数设置为：视野范围 = C，自动曝光时间，光圈 f-stop = 1，物镜模式设为微孔板，样本高度 = 0.0 cm。</li>
		<li>使用活体成像系统配套的图像分析软件对发光强度进行定量分析。在每块组织切片周围划定一致的兴趣区域（ROI）。本方案采用直径1 cm的圆形作为ROI（见图1）。测量该区域的总通量（p/s）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 药物对组织切片作用的评估
<ol>
	<li>按照第2节所述，使用基于发光法的细胞活力检测试剂测定处理前的基线活力。 
	注意：如果某些组织的活力显著低于其他组织，则应从实验中剔除这些组织。</li>
	<li>将药物溶解于二甲基亚砜（DMSO）中以配制储备液。用TSC或其他培养基配制10倍浓度的药物溶液（对于含有250 µL培养基的24孔板，每孔加25 µL），达到所需浓度。对于溶剂对照组，配制含有等体积DMSO的培养基。</li>
	<li>将10倍浓度的药物溶液加入孔底部的培养基中，用移液器吹打混匀，然后取50 µL培养基加至组织表面。 
	注意：若有多个组织切片，建议每种条件设置重复或三重复。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2、湿度充足的培养箱中，置于旋转摇床上轻轻振荡孵育过夜。</li>
	<li>从摇床取出培养板，继续在37 °C、5% CO2、湿度充足的培养箱中静置孵育。</li>
	<li>在预定时间点，使用微孔板读数仪或活体成像系统检测组织的发光强度。通常，药物效应在处理后1–6天内可被检测到。 
	注意：基于发光法的细胞活力检测试剂在培养条件下至少稳定3天。然而，底物可能因组织代谢活性而被消耗。如果观察到先前信号较高的组织出现显著信号下降，应在所有孔中补充底物。</li>
	<li>使用以下公式计算经处理肿瘤组织的剩余活力： 
	<img alt="使用发光变化计算细胞活力；实验数据分析公式。" src="/files/ftp_upload/61036/61036eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
	处理组组织的活力以其基线活力及对照肿瘤组织的活力变化进行归一化处理。</li>
</ol>

<ol><li>Klemm, F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+therapeutic+response+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer.</a> Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).</li>
<li>Horvath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+out+irrelevant+cell-based+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Screening out irrelevant cell-based models of disease.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).</li>
<li>Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failures+in+Phase+III%3A+Causes+and+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Failures in Phase III: Causes and Consequences.</a> Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+approaches+to+study+cell-cell+interactions+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment.</a> Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).</li>
<li>van der Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6, 86(2006).</li>
<li>Nagaraj, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+Analysis+of+Tumor+Slice+Explants+As+a+Prerequisite+for+Diagnostic+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58569(2018).</li>
<li>Naipal, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+slice+culture+system+to+assess+drug+response+of+primary+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer.</a> BMC Cancer. 16, 78(2016).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210(2017).</li>
<li>Sivakumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+tumor+slice+cultures+provide+a+versatile+platform+for+immuno-oncology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery.</a> Oncoimmunology. 8 (12), 1670019(2019).</li>
<li>Duellman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Viability+Assay+and+Use+in+Inhibitor+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li>
<li>Lazaro, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment%2C+characterization%2C+and+long-term+maintenance+of+cultures+of+human+fetal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes.</a> Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).</li>
<li>Chadwick, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brain+Tumor%2FOrganotypic+Slice+Co-culture+System+for+Studying+Tumor+Microenvironment+and+Targeted+Drug+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2015).</li>
<li>Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Glioblastoma+Organotypic+Slice+Culture+Model+for+Study+of+Tumor+Cell+Migration+and+Patient-specific+Effects+of+Anti-Invasive+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本方案中，我们展示了一种用于类器官肿瘤组织切片中定量且实时评估药物疗效的研究平台。与传统的基于细胞的体外方法相比，组织切片培养系统能够保留原发肿瘤微环境中的细胞异质性和生理特性，因而具有显著优势。该平台还可实现更高通量的药物疗效检测，有助于弥合细胞培养研究与体内实验之间的差距。
为了获得准确且一致的结果，必须在制备过程中尽量减少组织损伤。应使用宽口塑料移液管操作组织切片，以避免因物理接触造成的损伤。培养基的体积必须保持适当，以确保组织切片在整个实验过程中同时接触空气和培养基。
培养基应根据组织类型和实验目的进行优化。本方案中使用的TSC培养基是一种无血清培养基，最初为原代肝细胞培养而开发13。该培养基也已被用于维持多种类型的肿瘤，包括乳腺、肝脏、结肠和胰腺肿瘤10。此外，我们已证明使用优化的DMEM基础培养基可增强免疫细胞的存活率10。应根据组织质地优化振动切片机的设置，以获得完整且...

癌细胞与周围间质组织的物理和生化特性之间的相互作用构成了肿瘤微环境（TME）。TME 可促进肿瘤生长、转移，并调节肿瘤对治疗的反应1。在传统的临床前药物开发中，候选药物通常首先通过培养的癌细胞系进行筛选，而这种检测平台的关键缺陷在于缺乏TME2。在基于细胞的初筛阶段缺失生理性的TME，可能限制在荷瘤动物模型中有效药物的发现，并可能导致许多有前景的肿瘤药物在后续临床开发阶段的高淘汰率3。
尽管肿瘤微环境（TME）在调控肿瘤药物反应中具有重要作用，但实验条件的限制使得在药物发现和开发的早期阶段难以应用更具生理相关性的系统。在动物模型或患者肿瘤样本上筛选数百种治疗药物是不现实的。事实上，手术获取的肿瘤样本资源稀缺且遗传背景各异，而在动物模型中筛选数千种候选分子也因实验规模、成本以及动物福利问题而不可行。
肿瘤组织切片培养技术通过在体外培养精确切割的薄层肿瘤组织，可克服药物筛选实验中生理肿瘤微环境（TME）的局限性。历史上，神经科学领域率先开发并广泛优化了脑组织的切片培养方法4。近年来，多项研究已成功制备了来自多种肿瘤组织的切片，包括细胞系来源的肿瘤、自发性肿瘤模型、患者来源的异种移植瘤（PDX）以及原发性患者肿瘤。体外组织切片培养结合了体内和体外培养的优势5。肿瘤组织切片能够保持完整的组织结构和多样化的细胞组成，从而可在TME背景下研究癌细胞的行为。
本方案介绍了一种结合实时、高灵敏度活力检测的器官型肿瘤组织切片培养系统，用于评估药物反应。先前方案中对器官型肿瘤组织切片进行药物疗效测试，依赖于荧光染料掺入、免疫组织化学（IHC）或MTT（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴盐）法来测量细胞活力的变化6,7,8,9。然而，这些方法均为终点检测，存在灵敏度低、处理时间长、数据分析复杂、信号范围窄以及实验误差高等缺点。我们基于发光反应的、适用于活细胞的试剂通过提供宽广的信号范围和无需预处理、仅需极少后续处理的即时（约5分钟）检测，显著改进了上述检测方法。该试剂具有高度灵敏性，并可在细胞培养基中稳定共存，从而实现对细胞活力的连续性和时间序列监测。该检测系统适用于临床前药物研发中对组织切片上的候选药物进行高通量筛选。

<table><tbody><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>Corning</td><td>430293</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7524</td><td></td></tr><tr><td>4T1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>6 mm 直径活检打孔器</td><td>Integra Miltex</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5g</td><td>用于 TSC 培养基</td></tr><tr><td>Belzer UW 冷保存溶液（UW 溶液）</td><td>Bridge to Life</td><td>500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel 基质混合物</td><td>Fisher scientific</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Corning</td><td>MT-25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>双刃不锈钢切割刀片</td><td>TED PELLA</td><td>121-6</td><td>用于切片</td></tr><tr><td>阿霉素（盐酸盐）</td><td>Cayman Chemical</td><td>15007</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>细尖镊子</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4974</td><td></td></tr><tr><td>细尖镊子</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767-500g</td><td>用于 TSC 培养基</td></tr><tr><td>不含钙、镁或酚红的 HBSS</td><td>Gibco</td><td>14-175-103</td><td></td></tr><tr><td>HCI010</td><td>Dr. Alana Welm, University of Utah</td><td>乳腺癌 PDX</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>用于 TSC 培养基</td></tr><tr><td>ITS + 预混液</td><td>Fisher Scientific</td><td>354352</td><td>用于 TSC 培养基</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Leica VT1200S 振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>用于 TSC 培养基</td></tr><tr><td>Millicell 细胞培养插件，12 mm，亲水性 PTFE，0.4 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Millicell 细胞培养插件，30 mm，亲水性 PTFE，0.4 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-500g</td><td>用于 TSC 培养基</td></tr><tr><td>PELCO Pro CA44 组织粘合剂</td><td>TED PELLA</td><td>10033</td><td>胶水</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140163</td><td>用于 TSC 培养基</td></tr><tr><td>RealTime-Glo MT 细胞活力检测</td><td>Promega</td><td>G9711</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 EGF</td><td>BioLegend</td><td>585608</td><td>用于 TSC 培养基</td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875135</td><td></td></tr><tr><td>单刃工业剃须刀片</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>用于去除粘附的组织</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Corning</td><td>25-035-CI</td><td>用于 TSC 培养基</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW13115E</td><td>用于 TSC 培养基</td></tr><tr><td>星形孢菌素</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3510A</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>齿状镊子</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5155</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Fisher scientific</td><td>13-711-7M</td><td>宽头</td></tr><tr><td>移液管</td><td>Samco Scientific</td><td>235</td><td>细头</td></tr><tr><td>William's E 培养基，不含谷氨酰胺</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12551032</td><td>用于 TSC 培养基</td></tr></tbody></table>

在原代肿瘤组织切片中实时测量药物反应

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

肿瘤组织由癌细胞、浸润的免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞以及细胞外基质组成。这一复杂环境构成了肿瘤微环境（TME），可调节体内治疗反应或体外药物反应。传统的抗癌药物筛选通常在单层培养的细胞上进行，而这种体系严重缺乏TME的影响。因此，将灵敏且高通量的检测方法与生理相关的TME相结合的实验系统，将显著增强临床前药物发现过程。本文中，我们介绍了一种用于中高通量药物筛选的体外肿瘤组织切片培养平台。器官型组织切片培养是指利用多孔膜在液-气界面支持下维持精确切割的薄层肿瘤组织切片。在本方案中，我们描述了从小鼠肿瘤及患者来源的异种移植（PDX）模型肿瘤制备和维持组织切片的方法。为了评估药物处理后组织活力的变化，我们采用了一种基于生物相容性发光的活力检测法，可对组织中活细胞进行实时、快速且灵敏的定量检测。利用该平台，我们评估了组织切片对多激酶抑制剂星形孢菌素（staurosporine）和细胞毒性药物阿霉素（doxorubicin）的剂量依赖性反应。此外，我们通过在单个PDX肿瘤来源的组织切片上筛选17种临床及临床前药物，展示了组织切片在体外药理学研究中的应用。我们这一生理相关性强、高度灵敏且稳健的体外筛选平台，将极大促进临床前肿瘤学药物研发及治疗决策的制定。&#160;

本文展示了利用小鼠4T1乳腺肿瘤组织和乳腺癌PDX模型HCI01012制备的肿瘤组织切片进行多药物、时间进程的药效评估方案。我们已成功从小鼠来源的多种肿瘤、PDX模型以及新鲜的患者肿瘤组织中制备出组织切片10。肿瘤组织制备及药效检测的整体工作流程见图1。通常情况下，单个体积为1,000–1,500 mm3的实体肿瘤可制备出20–40片组织切片。
在细胞活性检测中，我们采用了一种基于发光反应、适用于活细胞的细胞活性检测试剂。与经DMSO处理的对照肿瘤组织相比，使用1 µM浓度的多激酶抑制剂星形孢菌素（staurosporine）处理4天后，信号强度降低了100倍（图2A）。来源于4T1肿瘤的组织切片在定期更换培养基的条件下可维持培养至少21天（图2B）。大多数药物反应检测均在组织切片制备后的...

我们介绍一种用于测量类器官肿瘤组织切片中实时药物反应的方案。此处概述的实验策略提供了一个平台，可在体外条件下对来自临床或小鼠肿瘤的组织切片进行中高通量药物筛选。

肿瘤组织由癌细胞、浸润的免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞以及细胞外基质组成。这一复杂的微环境……

我们的实验方案与其他分子分析方法兼容，可用于评估药物对完整组织切片活性的影响，并实现中等通量筛选。该技术的主要优势在于，我们能够实时测量整个组织切片的活性，且前处理和后处理步骤极少。该技术通过直接测试来自患者肿瘤组织样本的候选药物或组织切片，加速了临床前药物开发和肿瘤学研究。我们的实时组织活性评估方法具有很高的通用性，可应用于癌症生物学、神经科学和发育生物学研究。制备完整且具有活性的组织切片是该实验成功的关键。应根据组织类型和硬度调整振动切片机的设置及培养基成分。在获取肿瘤组织切片当天，将250微升组织切片培养基分装至24孔板的每个孔中，并在每孔中放入一个组织培养插件。随后将该板置于含5%二氧化碳的37摄氏度湿化培养箱中，待用。为获取肿瘤组织碎片，将肿瘤组织浸入盛有冰冻HBSS的10厘米培养皿中，并使用手术刀将组织切成两半。使用6毫米活检打孔器获取肿瘤组织圆柱体，并修整每个圆柱体的一端以形成平坦表面。将组织块置于新鲜的冰上预冷的HBSS中，并开启振动切片机。用70%乙醇对所有设备进行消毒，并将覆盖有丙烯酸玻璃盖的振动切片机缓冲液托盘置于振动切片机冰浴的中央。将冰加入浴槽中，用冰冷的 HBSS 填充缓冲液托盘。将刀片装入刀片架中，并使用有齿镊子小心选取经活检打孔获得的肿瘤样本。在标本板上滴加一滴医用级氰基丙烯酸酯胶水。用无绒纸巾轻拍组织，去除多余的缓冲液，然后将组织圆柱体垂直稳定地置于液滴中。室温干燥2至3分钟后，将样品盘放入缓冲液托盘中，并向托盘内加入额外的HBSS，直至组织完全浸没于缓冲液中。随后将冰盒与缓冲液托盘组件放置于振动切片机上，固定机械臂，完成装置组装。将振动切片机的切片厚度设为250微米，振幅设为3毫米，切片速度设为0.01至0.25毫米每秒，刀片角度设为15至21度。设定刀片的起始和终止位置，并调节载物台的高度。以连续模式运行仪器，进行多个循环切片，直至组织被均匀切割。使用宽头移液器将切片及少量 HBSS 转移至预先准备好的 24 孔板中每个孔内的独立细胞培养插件中，并使用细头移液器去除孔中多余的缓冲液。当样本末端被切完后，安装新的组织块并继续获取切片，直至获得足够数量的样本。随后将组织切片置于细胞培养孵育箱中培养 24 至 48 小时。为了检测组织切片的活力，根据制造商说明书，将含有荧光素酶和前体底物的发光法活力检测试剂用新鲜的组织切片培养基按1:1000的比例稀释，然后用该混合液替换24孔板中每孔的培养基。向每个组织切片上加入50微升酶-底物混合液，将板置于加湿培养箱内的轨道摇床上，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下轻轻振荡孵育过夜。次日早晨，使用微孔板检测仪并设置适当参数测定每孔的发光信号。在确定组织切片的基础活力后，将感兴趣的药物溶解于组织切片培养基中，配制成10倍浓度的储备液，并将每种10倍药物溶液加入每个组织切片孔底部的培养基中。从

measuring-real-time-drug-response-in-organotypic-tumor-tissue-slices

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

测量组织肿瘤组织切片的实时药物反应

来源：Ciraku, L., et. al．一种用于研究和靶向乳腺癌脑转移肿瘤生长的离体脑切片模型．J. Vis.

利用生物发光成像评估类器官小鼠脑切片中的肿瘤生长

通过将脑组织切片与癌细胞进行器官型共培养，可以在癌细胞侵袭脑组织的过程中，利用荧光显微镜以及明场（视频）显微镜观察其形态学变化。该模型系统还支持细胞交换与补充操作，并可进行多种实验干预和分析。...

具有类器官脑切片与癌细胞三维球体的共培养系统

关键词：共培养系统，类器官脑切片，癌细胞，三维球体，肿瘤微环境，脑转移，体外模型

多种人类脑肿瘤局限于脑内的特定区域，且难以在培养条件下生长。本方案旨在研究肿瘤微环境的作用，并通过分析在小鼠脑组织切片中生长的荧光标记原代脑肿瘤细胞，探索新的药物治疗方法。...

一种用于研究肿瘤微环境及靶向药物治疗的脑肿瘤/器官型脑片共培养体系

人胶质母细胞瘤类器官切片培养模型用于研究肿瘤细胞迁移及抗侵袭药物的个体化效应

我们提供了一种用于生成、培养及系统分析源自小鼠肺癌肿瘤的器官型组织切片的方法。同时介绍了如何优化切片厚度，以及如何选择药物浓度以处理肿瘤切片。...

建立和分析肿瘤组织切片外植体作为诊断检测的先决条件

本方案描述了器官型脑片培养物（OTSCs）的制备方法。该技术有助于 离体 完整多细胞组织的培养。OTSCs...

作为原发性胰腺癌及转移癌肿瘤微环境临床前模型的器官型脑片培养

本方案描述了一种用于中高通量类器官药物筛选的半自动化方法，以及一种不依赖显微镜型号的自动化图像分析软件，可用于定量和可视化分析多参数的单个类器官药物反应，以捕捉肿瘤内异质性。...

利用宽场活细胞成像进行大规模及单肿瘤类器官分析的多参数类器官药物筛选

我们描述了一种用于培养、维持及可视化已转移至腹膜表面的人类癌症组织的实验方案。切除的肿瘤标本使用振动切片机进行切割，并在可渗透性插入式培养装置中进行培养，以增强氧气供应并提高细胞存活率，随后通过共聚焦显微镜和流式细胞术进行成像及后续分析。...

培养与成像 离体 从切除的人类肿瘤标本制备类器官型腹膜假黏液瘤组织切片

患者来源的肿瘤类器官是基础与转化研究中一种复杂的模型系统。本文详细介绍了利用多重荧光活细胞成像技术，对不同类器官表型进行同步动力学评估的方法。...

用于癌症患者来源类器官模型中药物反应的多重活细胞成像

我们介绍了一种利用低相干全息层析技术对类器官进行高分辨率、无标记、三维成像的逐步操作方案。本方案详细说明了类器官培养制备、成像采集以及计算图像分析的全过程，可实现对活体类器官结构动态变化及药物反应的实时可视化观察。...

无标记、高分辨率三维成像结合低相干全息层析与机器学习分析肠道类器官

学习器官型肿瘤组织切片实时药物反应测量技术，用于加速临床前药物开发与肿瘤学研究。该方法支持中等通量药物筛选，可直接在患者来源样本上评估药物对完整组织存活率的影响，兼容多种分子分析技术，为癌症生物学和神经科学研究提供可靠平台。

在原代肿瘤组织切片中实时测量药物反应

探索更多视频