利用大分子拥挤效应构建人皮肤增生性瘢痕的体外模型
2020年5月1日
本方案描述了利用大分子拥挤效应构建体外人增生性瘢痕组织模型的方法，该模型可模拟体内环境。在大分子拥挤的环境中培养时，人皮肤成纤维细胞会表现出类似于瘢痕组织的表型、生物化学特性、生理特征及功能特性。
我们利用大分子拥挤技术构建了一种富含胶原蛋白的个体化模型，以模拟细胞在体内所经历的微环境。皮肤是一种高度拥挤的环境，不同于我们目前用于体外培养细胞的液体环境。与传统的单层细胞培养系统相比，该模型能够重现细胞在体内所处的分子拥挤环境，尤其是在瘢痕组织中，大量细胞外基质取代了液态水。
除了增生性瘢痕外，这种大分子拥挤技术还可用于细胞外基质丰富的研究，例如肺纤维化。按照论文所述方法培养瘢痕来源和正常成纤维细胞，然后将其以每毫升培养基接种于24孔板中，每孔50,000个细胞。
将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。通过将Ficoll 70、Ficoll 400和抗坏血酸加入含10%胎牛血清的DMEM中，制备大分子拥挤（MMC）培养基。将培养基置于水浴中孵育，以使拥挤剂充分分散于溶液中。
然后使用 0.2 微米滤器对其进行灭菌。吸除成纤维细胞的旧培养基，并更换为新配制的 MMC 培养基。将细胞在 37 °C 条件下孵育 6 天，每 3 天更换一次 MMC 培养基。
将 0.2 克直接红 80 粉末溶于 200 毫升去离子蒸馏水中，并加入 1 毫升乙酸，配制 Sirius Red 溶液。吸除细胞中的 MMC 培养基，每孔加入 300 微升 Sirius Red 溶液。然后将细胞放回培养箱中孵育 90 分钟。
孵育结束后，用自来水轻轻冲洗茜素红溶液，并将培养板置于空气中过夜晾干。次日，通过向每孔加入200微升0.1摩尔氢氧化钠溶液，并将培养板振荡5至10分钟，以提取茜素红染料。取100微升提取的染料转移至透明的96孔板中，使用酶标仪在620纳米波长处测定吸光度。
每孔加入 200 µL PBS 洗涤，随后在 4 °C 条件下用甲醇固定细胞 10 分钟。然后向每孔加入 3% BSA，室温孵育 30 分钟。吸去封闭液后，向每孔加入 200 µL 抗 I 型胶原抗体。
将酶标板孵育90分钟。然后吸去抗体，用PBS洗涤3次，每次5分钟。向每孔中加入200微升山羊抗兔FITC二抗和DAPI。
用铝箔覆盖培养板，在室温下孵育 30 分钟。弃去二抗和 DAPI，用 PBS 重复洗涤。然后在显微镜下直接观察荧光。
用 PBS 洗涤细胞两次后，向每孔中加入 40 µL 裂解缓冲液，并用移液器枪头刮取细胞层。然后将蛋白裂解液转移至微量离心管中，测定蛋白浓度。每孔上样 10 µg 蛋白至 4%–12% Bis-Tris 蛋白凝胶，于 200 伏电压下电泳 30 分钟，进行 SDS-PAGE。
实验完成后，以90伏电压进行90分钟的蛋白质印迹，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，注意避免凝胶与膜之间产生气泡。用10毫升封闭缓冲液封闭膜，随后在4摄氏度下与一抗孵育过夜。
第二天，用含0.1% TBS Tween 20的溶液将膜清洗五次，每次五分钟。然后在室温下用合适物种的二抗孵育膜一小时。重复清洗步骤，并使用成像系统检测荧光信号。
使用商业RNA提取试剂盒纯化总RNA后，采用微量分光光度计测定RNA浓度。然后利用cDNA合成试剂盒进行第一链DNA合成。将cDNA与10微升SYBR Green Supermix混合，并将样品转移至预先包被寡核苷酸引物的定制96孔板中。
用水调整每孔总体积至20微升，并根据文稿说明进行RT-PCR。与使用PVP或对照组相比，经Ficoll培养后，增生性瘢痕来源的人皮肤成纤维细胞的细胞密度显著增加。与其它配方相比，Ficoll在9%体积分数下通过大分子拥挤效应显著增强了胶原蛋白（包括I型胶原）的沉积。
通过定量分析进一步证实了这一点。在含丝裂霉素C（MMC）的环境中培养的瘢痕来源成纤维细胞和正常真皮成纤维细胞被发现可调控细胞外基质（ECM）成分（除胶原蛋白外）的表达。值得注意的是，与正常组织相比，增生性瘢痕组织中基质金属蛋白酶（MMPs）的表达水平显著升高。
观察到在大分子拥挤条件下培养的两种细胞系中，MMP2、MMP9 和 MMP13 的表达均显著上调。基质金属蛋白酶（MMPs）在伤口愈合和瘢痕形成过程中发挥重要作用，可调控细胞外基质（ECM）的组装与重塑。白细胞介素-6 和血管内皮生长因子的合成在 Western 印迹中未检测到。
但RT-PCR分析显示，在MMC条件下培养的成纤维细胞中，白细胞介素6的表达显著上调，而血管内皮生长因子的表达则下调。在实施该方案时，非常重要的一点是选择皮肤成纤维细胞时应确保其携带的CO病原体极少。我们还须注意，抗坏血酸是MMC培养基中的必需成分。
我们特别感兴趣的是进一步检测该MMC模型中的胶原沉积与排列情况。我们计划采用先进的显微技术，将此体外模型与体内天然瘢痕组织进行比较。我们鼓励其他研究者使用这种大分子拥挤技术，以提高附属模态组织体外模型的真实性。
当然，大分子拥挤效应也可用于在体外重新计算疾病和病理的模型。
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概述
本方案描述了利用大分子拥挤效应构建体外人增生性瘢痕组织模型的方法，该模型可模拟体内环境。在大分子拥挤的环境中培养时，人皮肤成纤维细胞会表现出类似于瘢痕组织的表型、生物化学特性、生理特征及功能特性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 组织工程
背景
- 皮肤是一个拥挤的环境，与传统的液体细胞培养不同。
- 增生性瘢痕具有独特的细胞特征。
- 大分子拥挤效应可模拟成纤维细胞的体内环境。
- 该技术也可能适用于其他疾病，如肺纤维化。
研究目的
- 建立一个能够准确反映瘢痕组织体内环境的模型。
- 研究成纤维细胞在拥挤的细胞外基质中的行为。
- 加深对瘢痕组织形成及相关疾病的理解。
使用的方法
- 利用大分子拥挤技术构建富含胶原的模型。
- 与传统单层细胞培养系统进行比较。
- 将瘢痕来源和正常成纤维细胞接种至24孔板中。
- 根据文献所述条件采用特定的培养环境。
主要结果
- 在拥挤环境中，成纤维细胞表现出类似瘢痕的特征。
- 该模型成功模拟了瘢痕组织的细胞外基质。
- 研究结果提示该模型在研究其他纤维化疾病方面具有潜在应用价值。
- 证实了环境因素在细胞行为中的重要性。
结论
- 大分子拥挤技术在增生性瘢痕建模中具有良好的效果。
- 该方法可为研究纤维化疾病中成纤维细胞的行为提供重要见解。
- 未来的研究可在此模型基础上拓展其在多种组织工程领域的应用。
常见问题
行业重要性概述
大分子拥挤效应（MMC）能够构建出高度模拟人类增生性瘢痕细胞外基质环境的体外模型，弥补了转化性纤维化研究中的关键空白。该方法可提高早期靶点验证的预测可靠性，并支持纤维化疾病研发管线中的机制性风险评估。该模型具有良好的生理相关性和可扩展性，可作为适用于整个研发组合的可重复使用平台，用于纤维化及细胞外基质重塑研究。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在生理相关背景下研究纤维化通路及细胞外基质重塑机制。
- 支持对参与胶原沉积和基质金属蛋白酶调控的靶点进行功能验证。
- 通过模拟体内瘢痕组织特征，有助于提高抗纤维化候选药物开发的预测可靠性。
筛选与检测方法开发
- 提供一种标准化、可重复的系统，用于定量评估胶原蛋白和细胞外基质蛋白的沉积。
- 能够对靶向瘢痕形成和基质重塑的化合物进行高效筛选。
- 支持检测方法的可扩展性及平台重复利用，适用于纤维化反应的高内涵分析。
转化与临床前研究
- 将体外研究结果与疾病相关的生物标志物（如 I 型胶原、MMP2、MMP9 和 MMP13 的表达）进行关联。
- 通过模拟人类瘢痕组织生物学特性，无需使用动物模型，实现从发现到临床前验证的衔接。
- 通过提供关于细胞外基质动态变化和纤维化信号通路的机制性见解，降低转化研究的风险。
流程与工作流整合
这种基于MMC的模型可整合到纤维化和伤口愈合项目的发现至临床前连续流程中。
- Discovery Biology：支持在人成纤维细胞中对细胞外基质（ECM）调控及纤维化通路激活进行假设验证。
- Screening：提供胶原沉积和基质蛋白表达的定量读数，用于化合物评估。
- Analytics：实现在不同实验条件下对ECM相关基因和蛋白表达的统计学比较。
- Translational Research：为与人类病理相关的生物标志物匹配和机制研究提供连续性支持。
- Enterprise Reuse：为多种纤维化疾病研究提供一种可扩展且伦理上更优的动物模型替代方案。
运营与企业影响
- 科学价值：提高纤维化靶点验证中预测的可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：通过可重复、可放大的标准化方案，实现富含细胞外基质组织的体外建模。
- 战略价值：通过早期降低抗纤维化策略的风险，优化决策流程并提升资本使用效率。
- 项目组合影响：支持对纤维化及伤口愈合相关资产进行风险调整后的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备原代人成纤维细胞培养和细胞外基质分析的专业知识。
- 需要具备荧光显微镜、酶标仪和分子生物学仪器的使用条件。
- 要求跨团队对MMC培养基制备和定量检测方案进行标准化。
- 经适当优化后，可适用于其他富含细胞外基质的疾病模型，如肺纤维化。
- 依赖于高质量、低污染的成纤维细胞来源以及精确的试剂操作。
