Name: 多能干细胞人类巨噬细胞的产生与表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 了解从人诱导多能干细胞生成巨噬细胞并进行功能表征的完整实验方案。该方法通过流式细胞术和吞噬实验验证细胞表型，为疾病建模和细胞治疗研究提供可扩展的细胞来源。

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感谢 Fiona Rossi 和 Claire Cryer 在流式细胞术方面的协助，感谢 Eoghan O’Duibhir 和 Bertrand Vernay 在显微镜技术方面的帮助。本工作由 CONACYT（M.L.-Y.）、Wellcome Trust（102610）&#160;和 Innovate UK（L.M.F）、Wellcome Trust 博士生奖学金（A.M）、MRC 精准医学博士生奖学金（T.V）资助。L.C. 和 J.W.P. 得到 Wellcome Trust（101067/Z/13/Z）、英国医学研究理事会（MR/N022556/1）以及 COST Action BM1404 Mye-EUNITER（http://www.mye-euniter.eu）的支持。

注意：本实验方案中使用的所有试剂和设备均列于材料表中。细胞培养用培养基应预热至37 °C。分化实验步骤中所用的培养基和试剂必须无菌。
1. 人类iPSC细胞系的解冻与维持
<ol>
	<li>制备细胞维持培养基、生长因子及其他试剂。
	<ol>
		<li>制备hESC无血清培养基（hESC-SFM；参见 材料表通过补充DMEM/F12培养基 (DMEM/F12 培养基，添加 hESC 补充剂、1.8% w/v 牛血清白蛋白（BSA）和 0.1 mM 2-巯基乙醇。</li>
		<li>配制人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）储备液（10 μg/mL）：将bFGF溶解于无菌的0.1%人血清白蛋白（HSA）-磷酸盐缓冲液（PBS）溶液中。将储备液分装至冻存管中，每管200 μL。储备液可在-20 °C保存长达1年。解冻后，bFGF储备液可在4 °C保存7天。</li>
		<li>配制Rho激酶抑制剂（ROCK抑制剂）Y27632储存液（1 mg/mL），将Y27632溶于无菌水中。将储存液分装为每管50 μL的等份，置于冻存管中。储存液可在-20 °C保存长达1年。解冻后，ROCK抑制剂储存液可在4 °C保存7天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>稀释干细胞基质（参见 材料表1:50 稀释于含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline）中。</li>
	<li>将稀释后的干细胞基质溶液加入培养板中，使每平方厘米表面积的终体积为78 μL/cm2在6孔板的孔中加入750 μL溶液以包被孔壁。</li>
	<li>将包被好的培养板在37 °C、5% CO₂的湿润环境中孵育1小时2.</li>
	<li>吸除干细胞基质包被液，加入1 mL添加了20 ng/mL bFGF和10 μM ROCK抑制剂的hESC培养基。</li>
	<li>将一管冻存的人iPSC细胞置于37 °C水浴中解冻，待细胞完全融化后，转移至5 mL hESC-SFM培养基中。</li>
	<li>以 100 x g 离心细胞 g 3 分钟。</li>
	<li>用0.5 mL添加有20 ng/mL bFGF和10 μM ROCK抑制剂的hESC-SFM重悬细胞，将细胞转移至包被的孔中。</li>
	<li>培养细胞24小时。</li>
	<li>更换为添加了20 ng/mL bFGF但不含ROCK抑制剂的hESC-SFM培养基。</li>
	<li>为维持细胞生长，每隔一天更换一次培养基，直至细胞达到80%融合度。未分化的iPSCs通常需要3–4天达到80%融合度。</li>
	<li>当细胞达到80%融合度时，进行传代。
	<ol>
		<li>更换为 1.5 mL 新鲜的 hESC-SFM 培养基，其中添加 20 ng/mL bFGF（不含 ROCK 抑制剂）。</li>
		<li>一手持培养容器，另一手滚动一次性细胞传代工具（参见 材料表沿一个方向（即从左到右）在整个培养皿表面滚动涂布棒。滚筒中的所有刮板必须均与培养皿表面接触。滚动过程中应保持压力均匀。</li>
		<li>沿同一方向重复滚动，直至覆盖整个孔板。</li>
		<li>将培养容器旋转90°，并按照步骤1.12.2和1.12.3所述重复滚动操作。</li>
		<li>使用后丢弃传代工具。</li>
		<li>使用无菌移液管，利用孔中的培养基将切割的菌落冲下。</li>
		<li>以1:4的比例将细胞接种至预先包被的干细胞基质孔中（步骤1.2–1.5），每孔加入终体积为1.5 mL的培养基（hESC-SFM添加20 ng/mL bFGF）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 人iPSC细胞系冻存
<ol>
	<li>冻存iPSC细胞时，将6孔板中70%–80%汇合度孔内的培养基更换为添加了20 ng/mL bFGF和10 μM ROCK抑制剂的hESC-SFM培养基。</li>
	<li>将孔板置于37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。</li>
	<li>使用细胞传代工具切割细胞集落，并将分离的集落转移至离心管中。</li>
	<li>以100 × g离心3分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL细胞冻存液中（参见材料表）。</li>
	<li>将细胞均等分装至两个冻存管中，放入预冷的细胞冻存盒内，置于4 °C。</li>
	<li>于-80 °C保存24–48小时。</li>
	<li>将冻存管转移至-135 °C超低温冰箱或液氮罐中长期保存。</li>
</ol>
3. 人iPSC向巨噬细胞的分化
注意：巨噬细胞分化方案的示意图总结见图1。
<ol>
	<li>准备细胞分化生长因子及其他试剂
	<ol>
		<li>制备hESC-SFM培养基（参见前一节）。</li>
		<li>将明胶溶解于无菌水中，配制成0.1% w/v的猪明胶溶液。明胶溶液可在4 °C保存长达2年。</li>
		<li>将BMP4溶解于含4 mM盐酸（HCl）和0.2% BSA的PBS溶液中，配制成人BMP4储备液（25 μg/mL）。将储备液分装至冻存管中，每管50 μL。储备液可在-20 °C保存长达1年。解冻后，BMP4储备液可在4 °C保存5天。</li>
		<li>将VEGF溶解于0.2% BSA的PBS溶液中，配制成人VEGF储备液（100 μg/mL）。将储备液分装至冻存管中，每管10 μL。储备液可在-20 °C保存长达1年。解冻后，VEGF储备液可在4 °C保存7天。</li>
		<li>将SCF溶解于0.2% BSA的PBS溶液中，配制成人SCF储备液（100 μg/mL）。将储备液分装至冻存管中，每管5 μL。储备液可在-20 °C保存长达1年。解冻后，SCF储备液可在4 °C保存10天。</li>
		<li>将IL3溶解于0.2% BSA的PBS溶液中，配制成人IL3储备液（10 μg/mL）。将储备液分装至冻存管中，每管500 μL。储备液可在-20 °C保存长达2年。解冻后，SCF储备液可在4 °C保存15天。</li>
		<li>将CSF1溶解于0.2% BSA的PBS溶液中，配制成人CSF1储备液（10 μg/mL）。将储备液分装至冻存管中，每管1 mL。储备液可在-20 °C保存长达2年。解冻后，SCF储备液可在4 °C保存15天。</li>
		<li>将干扰素-γ（IFNg）、白细胞介素4（IL4）和白细胞介素10（IL10）分别溶解于0.2% BSA的PBS溶液中，配制成各自10 μg/mL的储备液。将脂多糖（LPS）溶解于0.2% BSA的PBS溶液中，配制成100 U/mL的储备液。将每种储备液分装为35 μL/管，于-80 °C保存，最长可达2年。解冻后，储备液可在4 °C保存7天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>阶段1：类胚体的形成（第0天至第3天）
	<ol>
		<li>在第0天，向超低吸附6孔板的两个孔中各加入2.25 mL阶段1培养基（hESC-SFM添加50 ng/mL BMP4、50 ng/mL VEGF和20 ng/mL SCF）。</li>
		<li>将一个6孔板中80%融合度的iPSC孔中的维持培养基更换为1.5 mL阶段1培养基。</li>
		<li>使用细胞传代工具切割集落，并用移液器将切割后的集落转移至超低吸附6孔板的两个孔中（参见材料表）。</li>
		<li>在第2天，使用0.5 mL hESC-SFM培养基将细胞因子补充至终浓度为50 ng/mL BMP4、50 ng/mL VEGF和20 ng/mL SCF。 
		注意：iPSC集落将形成类胚体（EB）（图2A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>阶段2：悬浮液中造血细胞的出现
	<ol>
		<li>在第4天，用0.1% w/v明胶包被6孔组织培养板中的4个孔，孵育至少10分钟。</li>
		<li>去除明胶，每孔加入2.5 mL阶段2培养基（X-VIVO15添加100 ng/mL CSF1、25 ng/mL IL-3、2 mM GlutaMAX、1%青霉素-链霉素和0.055 mM 2-巯基乙醇）。</li>
		<li>将形成的类胚体收集至50 mL离心管中，静置使其自然沉降至管底，小心吸除上清液。</li>
		<li>用2 mL阶段2培养基重悬类胚体。</li>
		<li>将10–15个类胚体（不超过15个）转移至含2.5 mL阶段2培养基的明胶包被孔中。</li>
		<li>将类胚体在37 °C、5% CO2 条件下孵育。</li>
		<li>每3–4天更换一次贴壁类胚体的培养基，持续2–3周。</li>
		<li>2–3周后，类胚体开始释放非贴壁的造血细胞至悬浮液中。 
		注意：悬浮细胞释放的时间可能有所不同，且依赖于细胞系。该悬浮液中的细胞可被收集并进一步成熟为巨噬细胞（见阶段3）（图2A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>阶段3：巨噬细胞终末成熟
	<ol>
		<li>收集悬浮的造血细胞，并向类胚体培养板中补充新鲜培养基（阶段2培养基）。</li>
		<li>在200 x g条件下离心悬浮细胞3分钟。</li>
		<li>用阶段3培养基（X-VIVO15添加100 ng/mL CSF1、2 mM GlutaMAX和1%青霉素-链霉素）重悬细胞。</li>
		<li>将收集并离心后的细胞以0.2 x 106 细胞/mL的密度接种至未处理的10 cm细菌级塑料培养皿（10 mL）或未包被的6孔组织培养板（3 mL）中。</li>
		<li>在阶段3培养基中培养细胞9–11天，每5天更换一次培养基。 
		注意：阶段3中的步骤3.4.1–3.4.5可每3–4天重复一次，并可持续从原始类胚体板中收集悬浮细胞，最长可达3个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>巨噬细胞极化
	<ol>
		<li>为将巨噬细胞激活为M(LPS + IFNg)表型，使用LPS（终浓度：100 ng/mL）和IFNg（终浓度：10 U/mL）刺激细胞48小时。为诱导M(IL4)表型，使用IL4（终浓度：20 ng/mL）刺激细胞。为诱导M(IL10)表型，使用IL10（终浓度：5 ng/mL）刺激巨噬细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 诱导多能干细胞来源的巨噬细胞质量控制检测
<ol>
	<li>使用血细胞计数板计数每6孔板EBs所产生的造血悬浮细胞数量。</li>
	<li>按照先前所述方法评估巨噬细胞形态（例如，商用试剂盒染色）8,9。</li>
	<li>采用基因表达分析和流式细胞术检测巨噬细胞特异性标志物及极化标志物的表达，方法同前文所述8,9。
	<ol>
		<li>对6孔板中一孔巨噬细胞进行流式细胞术实验时，吸除其成熟培养基，用2 mL PBS洗涤一次，随后加入2 mL无酶细胞解离缓冲液，在室温（RT）孵育5分钟。反复吹打以解离并收集巨噬细胞。</li>
		<li>使用血细胞计数板计数细胞，并将其重悬于80 μL含2% BSA和0.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS溶液中。</li>
		<li>加入20 μL MACS人源FC阻断剂。</li>
		<li>冰上孵育20分钟，并避光保护。</li>
		<li>加入适量的含2% BSA和0.5 mM EDTA的PBS溶液，将细胞浓度调整至1 × 106 个巨噬细胞/mL。</li>
		<li>取1 × 105 个细胞，重悬于100 μL含2% BSA和0.5 mM EDTA的PBS溶液中，加入相应抗体（见下文注释），在室温避光孵育15分钟。</li>
		<li>用至少100 μL含2% BSA和0.5 mM EDTA的PBS溶液洗涤一次。</li>
		<li>将细胞重悬于200 μL含2% BSA和0.5 mM EDTA的PBS溶液中。</li>
		<li>加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，稀释比例为1:1,000）作为活/死细胞染料，孵育3分钟。</li>
		<li>进行流式细胞术分析时，依次设门选择主细胞群、单细胞群和活细胞群。在活细胞群中可观察到巨噬细胞相关标志物的表达（图3A）。 
		注：应针对每种用于诱导巨噬细胞的细胞系仔细进行抗体滴定。结果部分所用抗体详见材料表。SFCi55来源巨噬细胞流式细胞术检测的抗体稀释比例亦已提供。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 高通量吞噬作用检测
<ol>
	<li>通过吸除培养基，加入冰浴的无酶细胞解离缓冲液，并在冰上孵育5分钟，收集诱导多能干细胞来源的巨噬细胞（iPSC-DMs）。通过反复吹打收集巨噬细胞。</li>
	<li>在成像用组织培养级96孔板（例如，Cellcarrier Ultra，Perkin Elmer）中，每孔接种8 × 104个iPSC-DMs，加入200 μL第3阶段培养基，至少在高通量成像前2天完成接种。</li>
	<li>通过将一管pHrodoGreen Zymosan-A生物颗粒用2 mL PBS重悬，制备pHrodoGreen Zymosan-A生物颗粒悬液（“溶液1”）。涡旋振荡10秒。</li>
	<li>用更多PBS将2 mL PBS珠悬液按1:5比例稀释（“溶液2”）。</li>
	<li>将溶液2超声处理8秒，再涡旋振荡10秒。置于4 °C保存。该溶液将在步骤5.11中使用。</li>
	<li>移除已接种iPSC-DMs的培养孔中的培养基，并用PBS洗涤。</li>
	<li>用含Hoechst 33342（按1:20稀释）的PBS溶液对iPSC-DMs进行染色，在37 °C孵育20分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞。</li>
	<li>用含深红色细胞质膜染料（按1:1,000稀释）的PBS溶液进行染色（参见材料表）。在37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞。</li>
	<li>向每孔iPSC-DMs中加入100 μL保存在4 °C的珠悬液。此时，板即可用于成像。</li>
	<li>使用高内涵成像系统对板进行成像，每孔采集三个或更多视野，以充分代表整个孔的情况。</li>
	<li>使用Columbus软件（高内涵成像分析系统软件）定量吞噬作用。可开发特定算法以实现明确的批量图像分析：
	<ol>
		<li>测量蓝色荧光强度，并在软件中定义蓝色信号代表细胞核。</li>
		<li>测量红色荧光强度，并在软件中定义红色信号代表细胞质。</li>
		<li>定义细胞核与细胞质共同构成一个完整细胞。</li>
		<li>测量细胞内的绿色荧光强度，并设定严格的截断值/阈值，以判断细胞是否具有吞噬活性。</li>
		<li>定量吞噬性细胞的比例及每个细胞的平均吞噬指数。由于珠子荧光强度与珠子数量成正比，吞噬活性可通过细胞摄入珠子的数量来衡量。</li>
		<li>将该算法/分析流程应用于所有时间点、所有视野中的全部图像，从而实现稳健且无偏倚的批量分析，以评估细胞的吞噬能力。 
		注意：Columbus是一种高内涵分析软件，可提供细胞分割分析功能，用于细胞表型分析和功能检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明无利益冲突。

本文所述的iPSC-DMs生成方案具有良好的稳健性，能够从相对少量的iPSCs高效地产生大量均一的细胞。在初始分化约1 × 106&#160;iPSCs后，后续培养物可每4天收获一次，持续达2–3个月，期间总共可产生至少6.5 × 107个巨噬细胞。这些体外生成的人巨噬细胞在形态上与原代人巨噬细胞相似，表达关键的巨噬细胞表面标志物，并具备吞噬活性。巨噬细胞分化方案具有可重复性，可应用于其他hiPSC和hESC细胞系，但不同iPSC细胞系之间，巨噬细胞前体的首次收获时间以及可获得的细胞绝对数量可能存在差异。
已有研究表明，可从经过基因改造的诱导多能干细胞（iPSCs）生成巨噬细胞。例如，将一个包含在组成型 CAG 启动子控制下的荧光报告基因 ZsGreen 的转基因盒插入 SFCi55 iPSC 细胞系的 AAVS1 位点，随后证明该 iPSC 细胞系可分化为表达 ZsGreen 的巨噬细胞8。这些荧光标记的巨噬细胞未来可用于追踪治疗性巨噬细胞在疾病模型中的迁移和稳定性。在另一项研究中，研究人员利用经过基因改造、可表达他莫昔芬诱导型转录因子 KLF1 的 iPSC 细胞系生成了巨噬细胞。在 iPSC 来源的巨噬细胞中激活 KLF1 后，产生的巨噬细胞表型与红细胞岛中的巨噬细胞相似9。该策略有望用于将 iPSC 来源的巨噬细胞通过基因编程定向为其他组织特异性巨噬细胞群体的表型，例如肝脏中的库普弗细胞或皮肤中的朗格汉斯细胞。一旦确定了决定这些细胞类型的关键转录因子，这一目标即可实现。
就实验方案而言，必须特别注意起始iPSC群体的状态对成功分化至关重要。人类iPSC培养物在多次传代后可能被核型异常的亚群所占据，因此建议对iPSC库存进行严格筛选，并建立经过基因组质量控制的大批量主细胞库。根据我们的经验，此处所述的维持培养方案可使核型正常的iPSC在连续培养中维持长达2个月，但不同细胞系和不同实验室之间可能存在差异。如果遇到问题，建议每次分化实验均使用新解冻的未分化iPSC冻存管。此外，起始的未分化iPSC培养物汇合度不应超过80%。在拟胚体（EB）接种阶段，每孔6孔组织培养板应仅接种10–15个EB，且这些EB必须在孔内均匀分布。EB数量过多和/或EB在孔中央聚集会显著影响所生成巨噬细胞的数量。在更换培养基以及从EB培养物中收获类似单核细胞的前体悬浮细胞时，应格外小心，避免干扰EB与包被培养板表面的贴附。造血悬浮细胞的产量随每次收获逐渐增加，在分化第40–72天达到最佳产量（图2）。分化第68天后产量逐渐下降，通常在2.5个月后培养板趋于耗竭，但具体时间可能因iPSC细胞系而异。
本方案的一个局限性在于，无法对第二阶段结束时产生的造血悬浮细胞进行冷冻保存。依赖外源性激活WNT信号通路的方案在冻存后报告约40%的细胞回收率，但这些方案仅报告一次细胞收获，因此生成的巨噬细胞绝对数量较低30。本文所述的方案通过拟胚体（EB）形成诱导内源性信号通路，可每两周收获一次，从而获得更高的巨噬细胞总产量。
综上所述，我们提供了一种详细的方案，用于制备具有功能性的诱导多能干细胞（iPSC）来源的巨噬细胞。与使用单核细胞来源的巨噬细胞（MDM）相比，采用iPSC来源的巨噬细胞进行体外实验以研究健康和疾病状态下巨噬细胞生物学具有诸多优势。这些优势包括材料获取便捷（例如，无需供体）、可大量生产巨噬细胞，以及能够可行且相对简便地生成基因修饰的巨噬细胞。此外，iPSC来源的巨噬细胞可能是研究组织驻留型巨噬细胞生物学的更优资源。

胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）是一类可自我更新的细胞来源，能够分化为三个胚层谱系的所有细胞类型。允许对人类多能干细胞（PSCs）进行遗传操作的技术，如锌指核酸酶（Zinc Finger Nuclease）、TALENs 和 CRISPR-Cas9，已彻底改变了医学研究。1,2,3,4人类PSCs的基因操作是一种极具吸引力的策略，尤其当目标原代细胞在体外难以扩增和/或维持时, 或难以进行遗传操作，例如巨噬细胞的情况5,6,7,8,9由于人类诱导多能干细胞（iPSCs）可来源于任何体细胞，因此避免了与胚胎干细胞（ESCs）相关的伦理限制，并为实现个性化医疗提供了策略。这包括患者特异性的疾病建模、药物筛选，以及免疫排斥和感染风险降低的自体细胞治疗。6,8,10,11.
从诱导多能干细胞（iPSCs）生成巨噬细胞的实验方案包括三个步骤：1）形成拟胚体；2）悬浮培养中造血细胞的出现；3）巨噬细胞的终末成熟。
三维细胞聚集体（称为拟胚体，embryoid bodies, EBs）的形成可启动诱导性多能干细胞（iPSCs）的分化。添加骨形态发生蛋白（BMP4）、干细胞因子（SCF）和血管内皮生长因子（VEGF）可促进中胚层特化，并支持新生造血细胞的发育7,8,9,11,12。EBs内的不同化细胞还会启动内源性信号通路（如Wnt和Activin通路）的激活。某些分化方案不经过EB形成阶段；在此类情况下，将Wnt和Activin信号调节剂（如重组人Activin A和/或Chiron）添加至单层培养的iPSCs中以诱导分化13,14,15。本文重点介绍一种采用EB形成步骤的分化方案。在分化的第二阶段，将EBs接种至黏附性培养表面，随后暴露于细胞因子中，以促进悬浮细胞（包括造血和髓系祖细胞）的出现。在此类体外培养条件下，白细胞介素-3（IL3）可能支持造血干/祖细胞的形成与增殖16,17，以及髓系前体细胞的增殖与分化18。巨噬细胞集落刺激因子（CSF1）则支持髓系细胞的生成及其向巨噬细胞的分化19,20。在分化的第三阶段，这些悬浮细胞在CSF1存在下继续培养，以支持巨噬细胞的终末成熟。
人iPSCs在体外分化为巨噬细胞的过程模拟了发育过程中巨噬细胞生成的早期阶段。组织驻留型巨噬细胞在胚胎发生期间建立，其发育谱系与成体单核细胞截然不同。多项研究表明，iPSC-DMs的基因表达特征更接近胎肝来源的巨噬细胞，而非血液来源的单核细胞，提示iPSC-DMs更类似于组织驻留型巨噬细胞。iPSC-DMs表达更高水平的编码参与组织重塑和血管生成相关蛋白的基因，而编码促炎性细胞因子分泌及抗原呈递功能的基因表达水平则较低21,22。此外，iPSC-DMs在转录因子需求方面与组织驻留型巨噬细胞相似23,24。Buchrieser等利用缺乏转录因子RUNX1、SPI1（PU.1）和MYB的基因敲除iPSC细胞系，证明iPSC-DMs的生成依赖于SPI1和RUNX1，但不依赖于MYB。这表明它们在转录水平上类似于发育过程中造血第一波所生成的卵黄囊来源巨噬细胞23。因此，目前普遍认为iPSC-DMs是研究组织驻留型巨噬细胞（如小胶质细胞14,25和库普弗细胞11）更为合适的细胞模型，也是潜在可用于组织修复治疗的更理想细胞来源。例如，已有研究显示，在体外由小鼠ESCs产生的巨噬细胞在体内CCl4诱导的肝损伤模型中能有效缓解纤维化11。此外，在小鼠中使用脂质体氯膦酸盐耗竭巨噬细胞后，这些ESCs来源的巨噬细胞在重建库普弗细胞区室方面比骨髓来源的巨噬细胞更高效11。
本文介绍了无需血清和饲养层的培养方案，用于人诱导性多能干细胞（iPSC）的维持、冻存与复苏，以及将这些iPSC分化为功能性巨噬细胞的方法。本方案与Van Wilgenburg等人12所描述的方法非常相似，仅做了若干细微调整，包括：1）iPSC维持培养基；2）在拟胚体（EB）形成阶段不使用ROCK抑制剂；3）采用机械法而非酶解法从iPSC克隆生成均一的拟胚体；4）拟胚体的收获与接种方法不同；5）悬浮细胞每周收获两次，而非每周一次；6）收获的悬浮细胞在集落刺激因子1（CSF1）条件下培养9天以促进巨噬细胞成熟，而非7天。此外，我们还介绍了用于表征iPSC来源巨噬细胞表型与功能的实验方案，包括基因表达分析（qRT-PCR）、细胞表面标志物表达分析（流式细胞术），以及评估吞噬功能和极化状态的功能性实验。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇（50 mM）</td><td>Invitrogen</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>抗体 CD64-APC-CY7</td><td>Biolegend</td><td>305026</td><td>稀释倍数：1:100</td></tr><tr><td>抗体 25F9-EFLUOR 660</td><td>Ebioscience</td><td>15599866</td><td>稀释倍数：1:20</td></tr><tr><td>抗体 CCR2-PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>357212</td><td>稀释倍数：1:100</td></tr><tr><td>抗体 CCR5 PE</td><td>Biolegend</td><td>313707</td><td>稀释倍数：1:100</td></tr><tr><td>抗体 CCR8 PE</td><td>Biolegend</td><td>360603</td><td>稀释倍数：1:100</td></tr><tr><td>抗体 CD11b-PE</td><td>Biolegend</td><td>301305</td><td>稀释倍数：1:50</td></tr><tr><td>抗体 CD14-APC</td><td>Ebioscience</td><td>10669167</td><td>稀释倍数：1:20</td></tr><tr><td>抗体 CD163-PE-CY7</td><td>Biolegend</td><td>333614</td><td>稀释倍数：1:25</td></tr><tr><td>抗体 CD169-APC</td><td>Biolegend</td><td>346007</td><td>稀释倍数：1:25</td></tr><tr><td>抗体 CD206-PE</td><td>Biolegend</td><td>321106</td><td>稀释倍数：1:100</td></tr><tr><td>抗体 CD209-PE-CY7</td><td>Biolegend</td><td>3310114</td><td>稀释倍数：1:100</td></tr><tr><td>抗体 CD274-PE-CY7</td><td>Biolegend</td><td>329718</td><td>稀释倍数：1:100</td></tr><tr><td>抗体 CD43-PE</td><td>Ebioscience</td><td>10854419</td><td>稀释倍数：1:100</td></tr><tr><td>抗体 CD45-APC</td><td>Ebioscience</td><td>15577936</td><td>稀释倍数：1:20</td></tr><tr><td>抗体 CD86-APC</td><td>Biolegend</td><td>305412</td><td>稀释倍数：1:100</td></tr><tr><td>抗体 CD93-PE</td><td>Ebioscience</td><td>10804637</td><td>稀释倍数：1:100</td></tr><tr><td>抗体 CX3CR1-PE</td><td>Biolegend</td><td>307650</td><td>稀释倍数：1:100</td></tr><tr><td>抗体 HLA-DR-BV650</td><td>Biolegend</td><td>307650</td><td>稀释倍数：1:100</td></tr><tr><td>抗体 CD115-PE</td><td>Biolegend</td><td>347308</td><td>稀释倍数：1:40</td></tr><tr><td>细胞解离缓冲液，无酶</td><td>Thermofisher</td><td>13151014</td><td></td></tr><tr><td>细胞解离缓冲液，无酶，PBS</td><td>Gibco</td><td>13151014</td><td></td></tr><tr><td>CellCarrier-96 Ultra 微孔板，组织培养处理，黑色，96孔</td><td>PerkinElmer</td><td>6055302</td><td></td></tr><tr><td>CellMask 深红色细胞膜染料</td><td>Thermofisher</td><td>C10046</td><td>冻存培养基</td></tr><tr><td>Cryostor CS10</td><td>Sigma</td><td>C2874</td><td></td></tr><tr><td>CTS CELLstart 基质</td><td>Invitrogen</td><td>A1014201</td><td>干细胞基质</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542-1MG</td><td>终浓度 1 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>DPBS，含钙、镁（500 mL）</td><td>Thermofisher</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>人FcR封闭试剂</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>FGF-Basic（AA 10-155）重组人蛋白</td><td>Thermofisher</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 添加剂</td><td>Thermofisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>人重组 IFNY</td><td>Thermofisher</td><td>14-8319-80</td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白</td><td>Irvine Scientific</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>来自大肠杆菌的脂多糖（LPS）</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue（Hoechst33342）</td><td>Thermofisher</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Green Zymosan 生物颗粒偶联物（用于吞噬作用）</td><td>Thermofisher</td><td>P35365</td><td></td></tr><tr><td>猪皮明胶</td><td>Sigma</td><td>G9136</td><td></td></tr><tr><td>重组人 BMP4 蛋白</td><td>R&amp;amp;D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL10</td><td>Preprotech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL3</td><td>Preprotech</td><td>200-03-10</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL4</td><td>Preprotech</td><td>200-04</td><td></td></tr><tr><td>重组人 MCSF（无载体）100 &amp;mu;g</td><td>Biolegend</td><td>574806</td><td></td></tr><tr><td>重组人 VEGF 蛋白</td><td>R&amp;amp;D</td><td>293-VE-010</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 抑制剂 Y-27632</td><td>Merck</td><td>SCM075</td><td></td></tr><tr><td>SCF（C-Kit 配体）重组人蛋白</td><td>Thermofisher</td><td>PHC2111</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC SFM</td><td>Thermofisher</td><td>A1000701</td><td></td></tr><tr><td>StemPro EZPassage 一次性干细胞传代工具</td><td>Thermofisher</td><td>23181010</td><td></td></tr><tr><td>超低吸附板：细胞培养多孔板，6孔，Cell Star 抗细胞黏附表面</td><td>Greiner</td><td>657970</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo 15 500 mL 瓶装</td><td>Lonza</td><td>BE02-060F</td><td></td></tr></tbody></table>

由多能干细胞生成并表征人类巨噬细胞

Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells

巨噬细胞存在于大多数脊椎动物组织中，是一类分布广泛且具有异质性的细胞群体，功能多样。它们在健康与疾病中均发挥关键作用，在免疫防御中作为吞噬细胞，并介导营养支持、组织维持和修复功能。尽管已有可能研究人类巨噬细胞功能中涉及的部分分子过程，但将基因工程技术应用于原代人类巨噬细胞仍存在显著困难。这极大地限制了我们对巨噬细胞生物学中复杂遗传通路的深入探究，以及构建特定疾病状态模型的能力。因此，若能获得一种现成的、适用于多种基因操作技术的人类巨噬细胞来源，将为该领域提供一种极为有价值的工具。本文介绍了一种经过优化的实验方案，可在体外由人类诱导性多能干细胞（iPSCs）诱导生成巨噬细胞。这些由iPSC衍生的巨噬细胞（iPSC-DMs）表达人类巨噬细胞表面标志物，包括CD45、25F9、CD163和CD169；通过活细胞成像功能检测，证实其具有较强的吞噬活性。培养中的iPSC-DMs可通过添加LPS和IFNg、IL4或IL10，被激活为不同&#160;的巨噬细胞状态，表现出不同的基因表达谱和吞噬活性。因此，该体系为构建携带特定人类疾病相关遗传改变的巨噬细胞模型提供了平台，同时也为药物筛选或细胞治疗提供了稳定的细胞来源。

分化进程、巨噬细胞数量及形态学 
本研究结果基于SFCi55人源诱导多能干细胞系的分化，该细胞系已在多项研究中被描述和使用8,9,10,26。通过光学显微镜可监测诱导多能干细胞向巨噬细胞分化的进程。诱导多能干细胞集落、类胚体（EBs）、造血悬浮细胞以及成熟巨噬细胞在形态上具有明显区别（图2A）。通过离心制备的细胞涂片染色可进一步验证成熟巨噬细胞的形态。诱导多能干细胞来源的巨噬细胞体积较大，具有单个较小的卵圆形细胞核，以及富含大量囊泡的丰富胞质（图2B）。
在EBs的一个完整6孔板中，造血悬浮细胞在前2周的收获期（第16–28天）平均含有2.59 x 106 ± 0.54个细胞。第28天之后，每6孔板EBs平均产生4.64 x 106 ± 0.94个悬浮细胞。从第80天开始，随着EBs逐渐耗尽，悬浮细胞数量开始下降（图2C）。建议当每次收获的每6孔板EBs中前体细胞数量降至3 x 106以下时，停止分化方案。
iPSC来源的巨噬细胞表面标志物表达 
流式细胞术仍是评估人巨噬细胞表型最常用的方法。评估细胞表面标志物表达的设门策略包括：首先根据细胞大小和颗粒度等物理参数设门以确定主要细胞群，随后对单细胞进行设门，最后选择活细胞（图3A）。成熟的iPSC来源巨噬细胞应表达谱系标志物CD45和巨噬细胞成熟标志物25F9，并且不表达单核细胞/未成熟巨噬细胞标志物CD93。这与我们的观察结果一致（图3A）。iPSC来源的巨噬细胞还表达髓系谱系标志物CD11b、CD14、CD43、CD64、CD115、CD163和CD169（图3B）。这些细胞表达免疫调节标志物CD86，在静息状态下有小部分细胞表达趋化因子受体CX3CR1、CCR2、CCR5和CCR8（图3B）。这些图谱数据来自本实验室先前发表的研究8。
iPSC来源的巨噬细胞的吞噬作用与极化 
巨噬细胞在宿主防御和组织稳态中的一个关键特征是其吞噬病原体、凋亡细胞和碎片的能力27。吞噬速率与特定的表型状态密切相关28。为了评估iPSC-DM的吞噬能力，我们采用了一种高内涵成像系统方法8,9,11，该方法使用PerkinElmer Operetta显微镜以及pHrodo标记的Zymosan生物颗粒（pH敏感性染料偶联物）。在加入培养物时，这些生物颗粒不具荧光（图4A），但在细胞内酸性pH环境中会发出明亮的绿色荧光（图4B）。活细胞成像的Operetta显微镜设置为在加入颗粒后每5分钟拍摄一次图像，持续总时长为175分钟。随后，在Columbus平台上使用高通量且无偏倚的图像分析流程，以量化吞噬活性，包括“吞噬分数”（即吞噬颗粒的细胞所占比例）和“吞噬指数”（反映每个细胞摄入颗粒数量的指标）。
巨噬细胞可根据环境信号作出响应并改变其表型。为评估其对环境刺激的反应与表型转变能力，可使用LPS联合IFNg、IL4或IL10处理iPSC-DMs。经48小时处理后，细胞表型发生改变，分别称为M(LPS + IFNg)、M(IL4)和M(IL10)29基因表达分析是检测巨噬细胞极化状态的有用工具。在LPS和IFNg刺激下，巨噬细胞上调了基因的mRNA表达水平 CD40 VCAM1，以及 TNFA (图5A。在IL4刺激下，细胞上调了基因的mRNA表达水平 CD68, CD84，以及 MRC1 (图5B。在IL10刺激下，iPSC-DMs上调了表达 MRC1 (图5B）。在吞噬作用方面，经LPS + IFNg或IL4处理的巨噬细胞与未受刺激的巨噬细胞相比，吞噬细胞百分比显著降低。经IL10处理的iPSC-DMs表现出吞噬细胞百分比和吞噬指数的增加图5C–E).
<img alt="iPSC 分化过程示意图；类胚体、培养基、巨噬细胞前体、干细胞方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61038/61038fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：iPSC 分化为成熟功能性巨噬细胞的图示概要。 示意图使用 Biorender 绘制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61038/61038fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="干细胞分化过程；显微镜图像（A，B），生长曲线（C），细胞增殖分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61038/61038fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2：iPSC向巨噬细胞分化及iPSC-DM的数量与形态学特征。（A）明场图像，从左至右分别为：iPSC克隆、拟胚体（EBs）、收集的悬浮细胞以及成熟巨噬细胞。比例尺 = 100 μm。（B）使用Kwik-diff试剂盒染色的巨噬细胞细胞离心涂片图像。比例尺 = 25 μm。（C）每轮收获从一个6孔板EB培养物中收集的悬浮细胞数量。图表显示均值 + 标准误（SEM）；（n = 6次生物学独立实验）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61038/61038fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="免疫细胞标志物流式细胞术分析示意图；直方图显示谱系及调节标志物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61038/61038fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：巨噬细胞表面标志物表型。（A）成熟诱导多能干细胞来源巨噬细胞的设门策略。首先对单细胞活细胞进行设门，随后分析细胞表面标志物CD45、CD93和25F9的表达情况。细胞表面标志物的设门依据荧光减一（FMO）对照设定。（B）iPSC-DMs（蓝色）及其同型对照（灰色）针对谱系与髓系标志物、免疫调节标志物、成熟标志物以及趋化因子受体的单染流式细胞术代表性直方图。所有谱系与髓系标志物的图示代表n = 5次生物学独立实验的结果，CD105和CD206除外（n = 3）；成熟标志物（n = 5）；免疫调节标志物（n = 3）；趋化因子受体（n = 3）。图表使用了先前发表的数据8。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61038/61038fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="吞噬作用过程；显微图像和生长曲线；随时间追踪吞噬活性的检测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61038/61038fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：iPSC-DM极化与吞噬作用检测。 iPSC-DMs的代表性图像：（A）加入Zymosan pHrodo绿色珠子后立即拍摄，以及（B）加入珠子后175分钟。蓝色表示细胞核，红色表示细胞质，绿色表示被吞噬的珠子（比例尺 = 20 μm）。（C）处于初始状态的吞噬性巨噬细胞比例，以及（D）每个吞噬性巨噬细胞的吞噬指数/绿色荧光强度随时间的变化（n = 6个生物学独立实验）。图中显示均值，误差线表示标准误（SEM）。数据引用自已发表的研究8。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61038/61038fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因表达分析；图A和B；显微镜图像C；吞噬作用数据D和E；科学数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61038/61038fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：iPSC-DM 极化状态的评估。 对未极化和极化的 iPSC-DM 进行 RT-PCR 分析的相对定量，以检测（A）M(LPS+IFNϒ)；（B）M(IL4) 和 M(IL10) 相关基因的表达（n = 6 个生物学独立实验；单因素方差分析，Holm-Sidak 多重比较检验。仅将极化组与未极化组进行统计学比较）。图中显示均值，误差线表示标准差。图中 ND 表示未检测到转录本。这些图的数据此前已发表8。（C）添加 pHrodo 微球后 175 分钟的 iPSC-DM 代表性图像，iPSC-DM 分别经以下处理（从左至右）：无细胞因子、LPS+IFN-Y、IL-4 和 IL-10（比例尺 = 20 μm）。（D）吞噬性巨噬细胞的比例，以及（E）添加微球后 175 分钟，未极化和极化巨噬细胞处理中每个吞噬性巨噬细胞的吞噬指数/绿色荧光强度（n = 12 个生物学独立实验，单因素方差分析，Holm-Sidak 多重比较检验。仅将极化组与未极化组进行统计学比较）。图中显示均值，误差线表示标准差（*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.01，***p &lt; 0.001，****p &lt; 0.0001）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61038/61038fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本方案描述了从人诱导性多能干细胞高效生成巨噬细胞的方法，以及对这些细胞进行后续表征的技术。通过细胞表面标志物表达、基因表达分析和功能检测，评估由诱导性多能干细胞衍生的巨噬细胞的表型与功能特性。

巨噬细胞存在于大多数脊椎动物组织中，构成广泛分布且具有不同功能的异质性细胞群体。它们是……

由于人类巨噬细胞生物学研究依赖于从供体采集细胞，其发展一直受到限制。本实验方案展示了一种在实验室中利用多能干细胞诱导生成人类巨噬细胞的方法。该方案稳定可靠，可放大用于大量生产巨噬细胞，适用于细胞治疗或科学研究。多能干细胞可以进行基因操作。因此，在本方案中，我们可以生成具有特定表型、荧光标记的巨噬细胞，以及用于模拟疾病状态的巨噬细胞。本方案的可视化演示非常有用，因为许多研究人员对使用简易传代工具并不熟悉。此外，换液和收获细胞时所需的操作精细程度难以用语言描述。当培养的细胞达到80%融合度时，将耗尽的培养基更换为1.5毫升新鲜培养基。用一只手握住培养容器，将一次性细胞传代工具沿一个方向在培养板表面滚动。滚轮中的所有刀片必须与平板接触。滚动时保持均匀压力。沿同一方向重复滚动，直至覆盖整个孔板。将培养容器旋转90度并重复滚动。使用无菌移液管，利用孔中的培养基将切割的菌落冲下。吸出CELLstart，并更换培养基。按照1:4的比例将细胞接种至按照文中所述方法预先包被的培养孔中。在第0天开始分化过程时，向超低吸附六孔板的两个孔中各加入2.25毫升第一阶段培养基。然后，对于六孔板中一个达到80%融合度的iPSC培养孔，将维持培养基更换为1.5毫升第一阶段培养基。使用新的细胞传代工具切割克隆。用移液器将切割后的克隆转移至超低吸附六孔板的两个孔中。在第2天，通过向含有第2天拟胚体的六孔板中加入0.5毫升hESC SFM培养基，调整细胞因子浓度。第四天，在六孔细胞培养板中包被四个孔，每孔加入0.1%明胶。孵育至少10分钟后，吸除明胶溶液，并向每孔加入2.5毫升第二阶段培养基。收集六孔板中两个孔内形成的类胚体，转移至50毫升离心管中。让其依靠重力沉降至管底。然后小心吸去管中的培养基，并将拟胚体重悬于2毫升第二阶段培养基中。将10至15个拟胚体转移至含有2.5毫升第二阶段培养基的明胶包被孔中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。持续两到三周，每隔三至四天更换一次培养基。EB的接种至关重要。若每个培养皿中EB数量少于10个或多于15个，或分布不均，均可能导致巨噬细胞产量偏低。经过两到三周后，类胚体开始释放非贴壁的造血细胞进入悬浮液中。使用40微米滤网将这些细胞收集到50毫升离心管中，然后补充新鲜培养基。以200 × g离心悬浮的造血细胞3分钟。将造血细胞重悬于第三阶段培养基中，然后以每毫升0.2 × 10⁶个细胞的密度接种细胞。每五天更换一次第三阶段培养基。培养9至11天后，巨噬细胞将完全分化并具备完整功能。将8×10⁴个iPSC来源的巨噬细胞加入200 µL第三阶段培养基中，接种至96孔板的每孔。向含有iPSC来源巨噬细胞的每孔中加入100 µL磁珠溶液。使用高内涵成像系统对培养板进行成像。每个孔采集三个或更多视野，以获得良好的代表性图像。诱导多能干细胞集落、类胚体、造血悬浮细胞和成熟巨噬细胞在形态上具有明显区别。iPSC 分化而来的巨噬细胞体积较大，具有单个较小的卵圆形细胞核，以及含有大量囊泡的丰富胞质。通过流式细胞术评估巨噬细胞表型。成熟的 iPSC 分化巨噬细胞表达谱系标志物 CD45 和巨噬细胞成熟标志物 25F9，而不表达单核细胞/未成熟巨噬细胞标志物 CD93。iPSC 分化而来的巨噬细胞表达多种髓系谱系标志物，并对免疫调节标志物 CD86 呈阳性。少量巨噬细胞表达趋化因子受体 CX3CR1、CCR2、CCR5 和 CCR8。采用生物颗粒和高内涵成像系统评估 iPSC-DM 的吞噬能力。将生物颗粒加入巨噬细胞培养物时无荧光，但在被吞噬后，由于细胞内酸性pH环境而发出明亮的绿色荧光。吞噬分数代表吞噬了生物颗粒的巨噬细胞所占的比例，吞噬指数则用于衡量每个巨噬细胞摄入的生物颗粒数量。巨噬细胞可根据环境信号改变其表型。采用RT-PCR检测基因mRNA表达的上调情况。经LPS和干扰素γ或IL4处理的巨噬细胞，其吞噬细胞百分比显著低于未刺激的巨噬细胞。经IL10处理的巨噬细胞，其吞噬细胞百分比及吞噬指数均有所增加。该方案可用于提供即用型细胞来源，以治疗慢性肝病等疾病，因为在动物模型中已证明巨噬细胞对这些疾病具有治疗作用。诱导多能干细胞来源的巨噬细胞可用于研究与多种疾病状态相关的巨噬细胞。例如，我们利用这些细胞研究与乳腺癌肿瘤相关的巨噬细胞。我们通过使用一种名为 KLF1 的单一转录因子进行基因编程，改造了由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的巨噬细胞的表型。由此产生的巨噬细胞类似于红细胞岛巨噬细胞，并为红细胞的生成与成熟过程提供了新的研究见解。

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Research

科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

多能干细胞人类巨噬细胞的产生与表征

本视频展示了将原代单核细胞诱导分化为巨噬细胞的过程。可通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）将原代人单核细胞分离并诱导为类似M1型的促炎表型，或通过巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导为类似M2型的抗炎表型。...

原代单核细胞体外培养及向巨噬细胞的分化

人诱导性多能干细胞向巨噬细胞的分化

本视频展示了将人类多能细胞分化为类似小胶质细胞的过程。该过程包括形成类胚体，将其转移至包被的孔板中，并使用特定的生长因子诱导其分化为原始巨噬细胞前体，最终进一步分化为类似小胶质细胞的细胞。...

将人诱导性多能干细胞分化为类似小胶质细胞

巨噬细胞长期以来被认为是先天性和适应性免疫应答的关键组成部分。近年来，关于巨噬细胞与微生物之间在进化、遗传和生化方面相互作用的知识迅速增长，使科学界对巨噬细胞重新给予了高度关注。本文介绍了一种从小鼠骨髓中分化巨噬细胞的方法。...

骨髓来源巨噬细胞的制备

我们介绍一种简单高效的生成人巨噬细胞的方案。通过双密度梯度离心法处理血沉棕黄层，分离单核细胞，随后在特氟龙涂层细胞培养袋中将其分化为巨噬细胞。该方法可最大化巨噬细胞产量，并便于后续实验的细胞收获。...

通过双梯度离心法分离人单核细胞及其在特氟龙涂层细胞培养袋中向巨噬细胞的分化

双梯度离心法，人单核细胞，巨噬细胞分化，特氟龙涂层培养袋，细胞培养，外周血单个核细胞，Ficoll密度梯度，Percoll梯度，单核细胞分离，巨噬细胞

本文介绍了一种巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导分化的人单核细胞来源巨噬细胞的细胞培养方案。该方案采用单核细胞的冷冻保存，并将其大规模分化为巨噬细胞。随后，收获的巨噬细胞可根据实验需求以特定的细胞密度接种至培养孔中进行后续实验。...

集落刺激因子培养分化的人单核细胞来源巨噬细胞

本方案描述了将人诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为小胶质细胞样细胞的过程 体外 实验。我们还包含了一种详细的制备方法，用于从诱导多能干细胞衍生的下运动神经元中生成人突触体，该突触体可作为底物用于 体外...

人源小胶质样细胞：由诱导性多能干细胞分化而来及 体外 使用人突触体的活细胞吞噬作用检测

本方案介绍了从诱导性多能干细胞（iPSCs）分化生成人破骨细胞的方法，并描述了破骨细胞及其前体细胞的表征技术。...

由人诱导性多能干细胞分化与鉴定破骨细胞

本研究阐述了一种建立人单核细胞来源的小胶质细胞样（iMG）细胞的新方法，可用于间接评估脑部炎症。该细胞模型可能有助于针对脑部潜在炎症及相关神经精神疾病的研究。...

用于逆向转化脑科学研究的人源血液诱导小胶质样细胞的构建

现有的多能干细胞（PSC）向功能性细胞分化的体系目前受到严重的细胞系间和批次间变异性的阻碍。本文以心肌细胞分化为主要示例，介绍了一种基于图像的机器学习方法，用于智能监测和调控PSC分化过程的实验方案。...

一种基于活细胞成像的机器学习策略用于监测多能干细胞分化

单核细胞和巨噬细胞是具有高度可塑性和可重编程性的免疫细胞，在健康与疾病中发挥关键作用。它们通过启动特定的分化程序和表型，感知并响应多种多样的刺激。我们已建立了一种标准化的 体外...

人源单核细胞来源巨噬细胞的重编程模型 体外 检测方法

了解从人诱导多能干细胞生成巨噬细胞并进行功能表征的完整实验方案。该方法通过流式细胞术和吞噬实验验证细胞表型，为疾病建模和细胞治疗研究提供可扩展的细胞来源。

由多能干细胞生成并表征人类巨噬细胞

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