由多能干细胞生成并表征人类巨噬细胞

由于人类巨噬细胞生物学研究依赖于从供体采集细胞，其发展一直受到限制。本实验方案展示了一种在实验室中利用多能干细胞诱导生成人类巨噬细胞的方法。该方案稳定可靠，可放大用于大量生产巨噬细胞，适用于细胞治疗或科学研究。

多能干细胞可以进行基因操作。因此，在本方案中，我们可以生成具有特定表型、荧光标记的巨噬细胞，以及用于模拟疾病状态的巨噬细胞。本方案的可视化演示非常有用，因为许多研究人员对使用简易传代工具并不熟悉。

此外，换液和收获细胞时所需的操作精细程度难以用语言描述。当培养的细胞达到80%融合度时，将耗尽的培养基更换为1.5毫升新鲜培养基。用一只手握住培养容器，将一次性细胞传代工具沿一个方向在培养板表面滚动。

滚轮中的所有刀片必须与平板接触。滚动时保持均匀压力。沿同一方向重复滚动，直至覆盖整个孔板。

将培养容器旋转90度并重复滚动。使用无菌移液管，利用孔中的培养基将切割的菌落冲下。吸出CELLstart，并更换培养基。

按照1:4的比例将细胞接种至按照文中所述方法预先包被的培养孔中。在第0天开始分化过程时，向超低吸附六孔板的两个孔中各加入2.25毫升第一阶段培养基。然后，对于六孔板中一个达到80%融合度的iPSC培养孔，将维持培养基更换为1.5毫升第一阶段培养基。

使用新的细胞传代工具切割克隆。用移液器将切割后的克隆转移至超低吸附六孔板的两个孔中。在第2天，通过向含有第2天拟胚体的六孔板中加入0.5毫升hESC SFM培养基，调整细胞因子浓度。

第四天，在六孔细胞培养板中包被四个孔，每孔加入0.1%明胶。孵育至少10分钟后，吸除明胶溶液，并向每孔加入2.5毫升第二阶段培养基。收集六孔板中两个孔内形成的类胚体，转移至50毫升离心管中。

让其依靠重力沉降至管底。然后小心吸去管中的培养基，并将拟胚体重悬于2毫升第二阶段培养基中。将10至15个拟胚体转移至含有2.5毫升第二阶段培养基的明胶包被孔中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。

持续两到三周，每隔三至四天更换一次培养基。EB的接种至关重要。若每个培养皿中EB数量少于10个或多于15个，或分布不均，均可能导致巨噬细胞产量偏低。

经过两到三周后，类胚体开始释放非贴壁的造血细胞进入悬浮液中。使用40微米滤网将这些细胞收集到50毫升离心管中，然后补充新鲜培养基。以200 × g离心悬浮的造血细胞3分钟。

将造血细胞重悬于第三阶段培养基中，然后以每毫升0.2 × 10⁶个细胞的密度接种细胞。每五天更换一次第三阶段培养基。

培养9至11天后，巨噬细胞将完全分化并具备完整功能。将8×10⁴个iPSC来源的巨噬细胞加入200 µL第三阶段培养基中，接种至96孔板的每孔。向含有iPSC来源巨噬细胞的每孔中加入100 µL磁珠溶液。

使用高内涵成像系统对培养板进行成像。每个孔采集三个或更多视野，以获得良好的代表性图像。诱导多能干细胞集落、类胚体、造血悬浮细胞和成熟巨噬细胞在形态上具有明显区别。

iPSC 分化而来的巨噬细胞体积较大，具有单个较小的卵圆形细胞核，以及含有大量囊泡的丰富胞质。通过流式细胞术评估巨噬细胞表型。成熟的 iPSC 分化巨噬细胞表达谱系标志物 CD45 和巨噬细胞成熟标志物 25F9，而不表达单核细胞/未成熟巨噬细胞标志物 CD93。

iPSC 分化而来的巨噬细胞表达多种髓系谱系标志物，并对免疫调节标志物 CD86 呈阳性。少量巨噬细胞表达趋化因子受体 CX3CR1、CCR2、CCR5 和 CCR8。采用生物颗粒和高内涵成像系统评估 iPSC-DM 的吞噬能力。

将生物颗粒加入巨噬细胞培养物时无荧光，但在被吞噬后，由于细胞内酸性pH环境而发出明亮的绿色荧光。吞噬分数代表吞噬了生物颗粒的巨噬细胞所占的比例，吞噬指数则用于衡量每个巨噬细胞摄入的生物颗粒数量。巨噬细胞可根据环境信号改变其表型。

采用RT-PCR检测基因mRNA表达的上调情况。经LPS和干扰素γ或IL4处理的巨噬细胞，其吞噬细胞百分比显著低于未刺激的巨噬细胞。经IL10处理的巨噬细胞，其吞噬细胞百分比及吞噬指数均有所增加。

该方案可用于提供即用型细胞来源，以治疗慢性肝病等疾病，因为在动物模型中已证明巨噬细胞对这些疾病具有治疗作用。诱导多能干细胞来源的巨噬细胞可用于研究与多种疾病状态相关的巨噬细胞。例如，我们利用这些细胞研究与乳腺癌肿瘤相关的巨噬细胞。

我们通过使用一种名为 KLF1 的单一转录因子进行基因编程，改造了由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的巨噬细胞的表型。由此产生的巨噬细胞类似于红细胞岛巨噬细胞，并为红细胞的生成与成熟过程提供了新的研究见解。