一种简化的反向遗传学方法用于拯救表达报告蛋白的重组轮状病毒

本方案描述了一种可靠且高效的反向遗传学系统，用于制备重组轮状病毒。同时介绍了如何制备表达荧光标记蛋白的重组轮状病毒。该方法简便，仅需少量质粒，即可生成表达独立荧光蛋白以及病毒蛋白的重组轮状病毒。

首先将 BHKT7 细胞接种至 12 孔板中。用 PBS 冲洗新近达到汇合的单层细胞，随后用胰蛋白酶-EDTA 溶液消化单层细胞，并将细胞重悬于 5 mL GMEM 完全培养基中。

使用台盼蓝和自动细胞计数仪测定BHKT7活细胞的浓度。随后将1×10⁵个细胞接种至12孔细胞培养板的每个孔中，每孔加入1毫升GMEM。将培养板置于37°C、5%二氧化碳培养箱中过夜培养。

第二天，根据手稿说明准备用于转染的质粒混合物。然后向每种质粒混合物中加入110微升预热的低血清培养基，轻轻吹打混匀。向混合物中加入32微升转染试剂。

涡旋振荡后进行短暂离心，并在室温下孵育20分钟。同时，用2毫升GMEM不完全培养基冲洗BHKT7细胞。每孔加入1毫升SMEM不完全培养基，然后将培养板放回培养箱中。

孵育20分钟后，使用200微升移液器将转染混合物逐滴加入每个孔中。轻轻摇动培养板，然后将其放回孵育箱。转染两天后，用PBS冲洗一层新近融合的MA104细胞单层。

用胰蛋白酶-EDTA溶液消化单层细胞，并将细胞重悬于5 mL DMEM完全培养基中。计数细胞，并用DMEM不完全培养基调整细胞浓度至8 × 10⁵ 个细胞/mL。向转染了BHKT7细胞的孔中逐滴加入0.25 mL MA104细胞。

通过向每孔中加入0.8微升浓度为1毫克/毫升的胰蛋白酶储备液，将胰蛋白酶浓度调整至0.5微克/毫升。用完全DMEM培养基将剩余的MA104细胞稀释至浓度为1.5 × 10⁵个细胞/毫升，并将2毫升细胞悬液加入6孔板的每孔中。转染后第六天，从转染的细胞中回收重组病毒。

在无菌条件下，将 BHKT7 MA104 细胞进行三次冻融循环，将培养板在负 20 摄氏度冰箱与室温之间转移。将裂解液转移至 1.5 毫升离心管中。在 4 摄氏度、500 × g 条件下离心 10 分钟，以沉淀细胞碎片。

收集上清液，并在4 °C下保存。向100 µL澄清的细胞裂解液中加入胰蛋白酶，使其终浓度为10 µg/mL，将混合物于37 °C孵育1小时。然后在DMEM不完全培养基中制备10倍系列稀释液，稀释范围从10⁻¹至10⁻⁷。

用两毫升 PBS 将 MA104 单层细胞冲洗两次，再用不含血清的 DMEM 培养基冲洗一次。将 400 微升裂解液稀释物以复孔方式加入培养板中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育，每隔 10 至 15 分钟轻轻摇动培养板，使稀释液在单层细胞表面重新分布。通过将预热的 2 倍浓度 EMEM 与 1.5% 已融化并冷却的琼脂糖按等体积混合，制备琼脂糖 MEM 覆盖液。

将该溶液在42摄氏度的水浴中保存，并在施加于细胞前立即调整胰蛋白酶浓度至0.5微克/毫升。从六孔板中吸出裂解液稀释液。然后用2毫升不完全培养基冲洗细胞一次。

在每个孔的细胞单层上轻轻加入三毫升琼脂糖 MEM 覆盖液。在室温下静置，使琼脂糖凝固。然后将培养板放回培养箱中。

三天后，按先前所述方法制备琼脂糖 MEM 覆层溶液，并在使用前立即加入中性红，使其终浓度为每毫升 50 微克。在六孔板中已有琼脂糖的表面加入 2 毫升覆层溶液。待琼脂糖凝固后，将培养板放回培养箱，并注意避免含中性红的培养板暴露于光照。

在接下来的六小时内，借助光源箱识别轮状病毒蚀斑。使用一次性移液管挑选轮廓清晰的蚀斑，回收完全延伸至细胞层的琼脂糖凝胶块。将凝胶块排入含有0.5毫升DMEM不完全培养基的1.5毫升离心管中，并将样品涡旋振荡30秒。

将斑块分离的病毒接种于MA104单层细胞或AT25培养瓶中，使用不含血清的DMEM培养基并添加0.5微克/毫升胰蛋白酶进行扩增。向1.5毫升微量离心管中加入600微升澄清的感染细胞裂解液和400微升硫氰酸胍。涡旋混匀30秒，室温孵育5分钟。

然后加入 200 µL 氯仿。涡旋振荡溶液 30 秒，孵育 3 分钟。在 13,000 ×g 和 4 °C 条件下离心 5 分钟后，将 550 µL 上层水相转移至新离心管中。

加入两倍体积的冷异丙醇，倒置离心管4到6次。将样品在室温下孵育10分钟，然后在4摄氏度、13,000 ×g条件下离心10分钟。

弃去上清液，保留RNA沉淀。向离心管中加入1毫升75%乙醇，轻轻颠倒混匀一次，然后在7,500 × g、4 °C条件下离心5分钟，以洗涤RNA。小心去除乙醇后，将RNA置于室温下晾干5至10分钟。

然后将沉淀溶解于15 µL无核酸酶的水中。取10 µL溶解后的RNA样品，加入2 µL 6X DNA上样缓冲液。将其上样至预浇制的10%聚丙烯酰胺微型凝胶中。

在恒定16毫安电流下，使用Tris-甘氨酸电泳缓冲液进行电泳，运行2小时以分离RNA。电泳结束后，将凝胶浸泡于含有1微克/毫升溴化乙锭的水中5至10分钟，然后用紫外透射仪检测轮状病毒基因组片段。该反向遗传学实验方案用于构建重组SA11病毒，这些病毒可在MA104细胞上通过空斑实验轻松识别，从而实现空斑分离。

采用含苯酚和硫氰酸胍的溶液提取噬斑纯化的rSA11野生型和SA11-UnaG病毒的双链RNA（dsRNA）基因组，通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色检测。正如预期，由于含有2A-3xFLUnaG序列，rSA11-UnaG的第七基因片段（即NSP3 dsRNA）迁移速度明显慢于rSA11野生型。为检测UnaG荧光蛋白的表达，用野生型和重组病毒感染MA104细胞，并使用活细胞成像仪进行观察。

分析结果显示，rSA11-UnaG 产生绿色荧光，而在感染 rSA11 野生型的细胞中未检测到荧光。通过免疫印迹分析检测 rSA11-NSP3-2A-xflUnaG 中的 2A 元件是否促进两种独立蛋白的表达。分析结果表明，NSP3-2A 和 3xFL-UnaG 确实以独立蛋白的形式表达，说明 2A 元件具有功能活性。

为了成功回收重组轮状病毒，转染时使用高质量且状态良好的BHKT7细胞、传代培养时使用MA104细胞，以及精确量取高纯度质粒，均至关重要。尽管本方案阐述了如何利用反向遗传学系统修饰轮状病毒的NSP3基因，但相同方法也可用于修饰其他基因，例如SP1。