Name: 双电穿孔，以定时和空间分离的细胞群 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 了解双子宫内电穿孔技术，用于研究哺乳动物大脑皮层发育过程中不同时空神经元群体的相互作用。该方法通过荧光蛋白可视化细胞互作，有助于揭示自闭症和精神分裂症等神经发育疾病的神经环路改变机制。

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作者感谢瓦伦西亚大学动物护理设施的 Cristina Andrés Carbonell 及其成员提供的技术协助。我们还要感谢 Isabel Fariñas 和 Sacramento R. Ferrón 提供试剂并共享设备。I.M.W 由瓦伦西亚教育委员会的青年保障合同（GJIDI/2018/A/221）资助，D.dA.D 由西班牙科学、创新与大学部（MICINN）&#160;（FPI-PRE2018-086150）资助。C.Gil-Sanz 持有西班牙科学、创新与大学部（MICINN）授予的 Ramón y Cajal 奖项（RYC-2015-19058）。本研究由 RYC-2015-19058 和 SAF2017-82880-R（MICINN）项目资助。

本文所述实验程序已获得瓦伦西亚大学动物福利伦理委员会及瓦伦西亚自治区农业、农村发展、气候紧急情况与生态转型部的批准，并遵循国际&#160;国际实验动物科学理事会（ICLAS）已列入西班牙法律《皇家法令 53/2013》以及欧洲议会和理事会《2010/63/EU 指令》中予以审议。
注意：本方案包含两个不同的研究目的：1）第一项研究，称为“策略A”，用于分析同一脑半球内 Cajal-Retzius 细胞（CR细胞）与早期生成的皮层投射神经元之间的相互作用；2）第二项研究，即“策略B”，旨在研究上层胼胝体投射神经元对新皮层对侧的神经支配情况。
1. 术前准备
<ol>
	<li>DNA制备
	<ol>
		<li>转化化学感受态或电转感受态 E. coli 将含有目的质粒的DH5α细胞接种于添加适当抗生素的LB琼脂平板上，37 °C过夜培养。 
		注意：此处使用的所有质粒均包含驱动荧光报告蛋白表达的鸡β-肌动蛋白通用启动子（CAG）（策略A使用CAG-mCherry和CAG-EGFP，策略B使用CAG-BFP和CAG-nEGFP-2A-mtdTomato）。所有质粒均含有氨苄青霉素抗性基因（AMP）。</li>
		<li>从每次质粒转化中挑取单个菌落，于细菌培养管中加入2 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基（LB+AMP），在37 °C、剧烈振荡（200 rpm）条件下培养3−4小时，启动预培养液态培养。随后，将1 mL预培养液转接至含有200 mL LB+AMP培养基的500 mL锥形瓶中，于37 °C、200 rpm振荡培养过夜。</li>
		<li>使用无内毒素大提物试剂盒（材料表按照制造商说明，从液体培养物中提取纯度高且浓缩的质粒DNA。用约50−100 µL无内毒素的Tris-EDTA（TE）缓冲液重悬DNA，使其浓度至少达到5 µg/µL。</li>
		<li>每次手术前，配制终体积为10 µL的溶液，其中包含1 µL快绿染料、目的质粒DNA溶液（每种质粒终浓度为1 µg/µL）以及无内毒素TE缓冲液。例如，将1 µL快绿染料、2 µL浓度为5 µg/µL的质粒DNA溶液和7 µL TE缓冲液混合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>玻璃微电极拉制
	<ol>
		<li>使用垂直显微拉制仪拉制硼硅酸盐玻璃毛细管（外径/内径：1/0.58 mm），直至尖端长度达到1−1.5 cm，然后在解剖显微镜下用解剖镊以约30°的角度剪切尖端。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术室设置
	<ol>
		<li>将所有器械放置于手术台上（即镊子、剪刀、止血钳、微量移液器、针头和持针器）。打开加热垫，并覆盖无菌外科吸收垫。确保吸入麻醉机的储液罐中已装满异氟烷，氧气瓶中有足够的氧气，且系统功能正常。 
		注意：手术室和所有耐受材料必须尽可能保持无菌（即所有材料在手术前须经高压灭菌，表面须用70%乙醇消毒）。铂电极在手术前需先用杀菌肥皂仔细消毒，再用70%乙醇消毒。</li>
		<li>配制 100 mL 含青霉素-链霉素 1:100 的 0.9% (w/v) 无菌生理盐水溶液，倒入 10 cm 培养皿中。将培养皿置于加热垫上，以温热溶液。</li>
		<li>用1 mL注射器吸取150 µL镇痛溶液（例如，0.1 mg/kg布托啡诺）。</li>
		<li>用步骤1.1.4中制备的最终质粒DNA溶液将拉制好的移液毛细管上样5 µL。将毛细管连接至口控吸液管。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 首次子宫内电穿孔手术
<ol>
	<li>将一只 E11.5（策略 A）或 E13.5（策略 B）的 C57BL/6 孕鼠放入密闭诱导室中，以 0.8 L/min 的流速通入 2.5%（v/v）异氟烷，直至其麻醉。将小鼠转移至加热垫上，并将其鼻部置于面罩中以持续输送异氟烷。通过检查足底反射是否消失来确认麻醉效果。 
	注意：胚胎发育天数以观察到阴道栓的当天记为 E0.5 进行计算。</li>
	<li>对孕鼠皮下注射镇痛溶液（0.1 mg/kg 布托啡诺）。为防止手术过程中眼睛干涩，使用棉签在每只眼睛中各涂抹一滴眼膏。</li>
	<li>使用电动剃刀剃除小鼠腹部毛发，并依次用 70%（v/v）乙醇擦拭纸清洗两次，再用碘伏擦拭纸清洗一次，最后再用乙醇擦拭纸清洗一次。</li>
	<li>使用剪刀在动物右侧皮肤做一条长约 30 mm 的切口，用钝头刮勺小心将皮肤与肌肉层分离。随后，在腹壁上做第二道切口。</li>
	<li>用一张预先用含 70% 乙醇消毒、中央开有 40 mm 长切口的折叠滤纸覆盖腹部。使用环形镊子小心将子宫从腹腔中拉出。 
	注意：在整个操作过程中，必须使用步骤 1.3.2 中配制的温热生理盐水保持子宫湿润。</li>
	<li>将步骤 1.1.4 中配制的 DNA 溶液预先吸入移液管中。使用口控吸管将约 0.5 µL DNA 溶液注入目标半球胚胎的侧脑室，直至在脑室内可见亮绿染料。</li>
	<li>将钳形铂电极置于注射后胚胎头部两侧（如 图 1A 和 图 2A 所示），调整电极方向以靶向目标脑区。将正极朝向内侧壁，以电穿孔标记皮层楔形区（策略 A），或朝向外侧皮层（策略 B），以标记该区域生成的细胞。 
	注意：在所有操作中，必须避免损伤心脏和胎盘，以确保胚胎存活。</li>
	<li>使用方波电穿孔仪，按照 表 1 所示参数施加特定序列的电脉冲（策略 A 的 E11.5 胚胎：4 次 25 V、40 ms 的脉冲，间隔 950 ms；策略 B 的 E13.5 胚胎：5 次 35 V、60 ms 的脉冲，间隔 950 ms）。</li>
	<li>使用镊子小心将子宫放回腹腔，注入温热生理盐水，并用 6-0 缝合针线缝合腹壁。使用 6-0 缝合线或缝合夹闭合皮肤上的初始切口。</li>
	<li>将动物保持在加热垫上，持续监测直至其从麻醉中恢复。在其饲养笼中提供额外剂量的镇痛剂（150 µL）&#160;溶于水凝胶溶液中。</li>
	<li>术后 24 小时，再次给予额外剂量的镇痛剂（150 µL）。通过肉眼观察每日监测动物是否出现疼痛或痛苦迹象，观察其行为表现，检测后肢正常的反射功能，并检查缝合部位是否有因舔舐或抓挠造成的损伤迹象。</li>
</ol>
3. 第二次子宫内电穿孔
<ol>
	<li>在初次手术两天后，重复步骤 2.1−2.3。尽管怀孕雌鼠术后恢复情况良好，但在进行第二次手术前，需确认其行为正常，且无疼痛或痛苦迹象（策略 A 使用 E13.5 胚胎，策略 B 使用 E15.5 胚胎）。</li>
	<li>沿皮肤做一条长约 30 mm 的切口，操作同步骤 2.4，并在腹壁做第二条切口，此次位于动物左侧。按照步骤 2.5 所述，将子宫小心暴露于消毒过的组织之上。 
	注意：注意避免干扰此前在另一侧所做的切口。</li>
	<li>对于策略 A，将 DNA 溶液注入先前已进行电穿孔的一侧大脑半球的侧脑室；对于策略 B，则注入对侧大脑半球的侧脑室，每个胚胎注射量约为 0.5 µL。 
	注意：仅使用发育正常、无再吸收迹象的胚胎。</li>
	<li>按照步骤 2.7 所述，将电极置于胚胎头部周围，使正极指向外侧皮层，并根据表 1所示参数施加适当的电脉冲（策略 A 的 E13.5 胚胎：5 次 35 V、60 ms 的脉冲，间隔 950 ms；策略 B 的 E15.5 胚胎：5 次 50 V、80 ms 的脉冲，间隔 950 ms）。</li>
	<li>继续并完成步骤 2.8−2.10 所述的手术操作。</li>
</ol>
4. 组织采集与切片
<ol>
	<li>策略 A
	<ol>
		<li>第二次电穿孔后第四天（E17.5），对怀孕雌鼠实施颈椎脱位，并将其置于仰卧位。</li>
		<li>使用剪刀进行腹侧切口以取出子宫角，并用镊子将其转移至一个盛有冰上预冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。 
		注意：低温条件可实现胚胎的麻醉。</li>
		<li>使用镊子将胚胎从羊膜囊中取出，并在解剖显微镜下用镊子转移至另一个盛有PBS的培养皿中。用镊子小心夹住胚胎头部，使用镊子进行脑组织解剖，先去除头部皮肤，再去除颅骨。使用刮勺将暴露的脑组织取出。</li>
		<li>用小勺收集脑组织，并将其置于含有固定液（4% [w/v] 多聚甲醛 [PFA] 溶于1×PBS）的48孔板中。可通过倒置荧光显微镜等方法立即检测两次电穿孔是否成功。</li>
		<li>将胚胎脑组织在4 °C条件下于旋转摇床上固定过夜。用1×PBS洗涤以去除残留的PFA。随后将其转移至含抗真菌防腐剂的PBS中（1×PBS-0.05% [w/v] 叠氮化钠）。 
		警告：PFA和叠氮化钠为细胞毒性化合物，使用时需采取特殊防护措施。</li>
		<li>将固定后的脑组织包埋于含4% (w/v) 低熔点琼脂糖的1×PBS中，静置约10分钟直至凝固。使用氰基丙烯酸酯胶水将脑组织固定于振动切片机的组织夹持器上，嗅球朝上，以便获得冠状切片。</li>
		<li>启动振动切片机并设定所需参数：切片厚度100 µm，切片速度0.60 µm/s，振幅0.60 mm。</li>
		<li>将脑组织牢固固定于振动切片机容器内，注入1×PBS溶液，使用毛刷收集冠状连续切片，并置于盛有1×PBS-0.05% (w/v) 叠氮化钠的48孔板中，以完整覆盖整个脑组织（例如，每孔约7片切片，每胚胎6孔）。</li>
		<li>使用细毛刷将所需切片转移至显微镜载玻片上，加盖盖玻片。如需长期保存，可加入封片剂以防止荧光淬灭和光氧化。在正置荧光显微镜下观察切片，评估电穿孔效率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>策略 B
	<ol>
		<li>让在E13.5和E15.5时期已进行电穿孔的幼鼠出生，并饲养至P15，使用与步骤4.1.4相同的固定液进行经心灌注。</li>
		<li>灌注前，腹腔注射75/1 mg/kg剂量的氯胺酮/美托咪啶。当足底反射消失后，将小鼠固定于仰卧位，沿中线使用剪刀进行腹侧切口，暴露肋骨和膈肌。</li>
		<li>剪开膈肌并打开胸腔以暴露心脏。用止血钳固定肋骨，用精细剪刀在右心房做一切口。</li>
		<li>将连接柔性导管的针头插入左心室，并连接至蠕动灌注泵。开始经心灌注，以5.5 mL/min的恒定流速灌注至少25 mL的4% PFA（总时间约5分钟）。</li>
		<li>解剖灌注后动物的脑组织。首先使用剪刀和镊子去除头部皮肤。用剪刀开始剪开颅骨，并小心剥离颅骨碎片直至完全去除。最后借助刮勺取出脑组织。</li>
		<li>将脑组织转移至24孔板中，在4 °C条件下于旋转摇床上用4% PFA固定过夜。用含0.05% (w/v) 叠氮化钠的PBS替换PFA以终止固定。 
		注意：如步骤4.1.5所述，建议在更换溶液前用1×PBS进行中间洗涤。</li>
		<li>重复步骤4.1.6−4.1.9，但调整振动切片机参数以适应出生后脑组织（切片厚度40 µm，速度1.20 µm/s，振幅0.5 mm）。 
		注意：可进行免疫组织化学或免疫荧光染色，以检测特定细胞标志物或增强电穿孔中使用的荧光蛋白信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 共聚焦荧光成像与分析
<ol>
	<li>打开共聚焦显微镜，将载有已封片脑切片的玻片放置于显微镜载物台，并选择用于采集荧光图像的通道（例如，BFP 为 420−460 nm，GFP 为 490−540 nm，mCherry 和 tdTomato 为 570−620 nm）。</li>
	<li>对样品进行扫描，以两种不同波长获取每张脑切片的概览图，从而全面观察双重电穿孔的结果。完成后，选择 10x 物镜和多区域Z堆栈-时间序列观察模式，以便程序化自动采集脑切片内不同 XYZ 位置的荧光图像。</li>
	<li>在每个选定的区域（XY）中，根据样品中荧光可见的焦平面，设置合适的成像参数（例如激光强度、光电倍增管灵敏度，以及不低于 1,024 × 1,024 的分辨率），并设定扫描深度（Z）。</li>
	<li>获取所有选定区域的低倍率（10x）图像，并使用显微镜查看软件将图像从 OIF 格式导出为 TIFF 格式。</li>
	<li>切换至 60x 物镜，重复步骤 5.3，采集高倍率图像以更详细地观察细胞间相互作用。按步骤 5.4 所述方式导出图像。</li>
	<li>使用任意图像分析软件（例如 Fiji）打开所获取的图像，进行后续分析。</li>
</ol>

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<li>Thomson, A. M., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlaminar+Connections+in+the+Neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Interlaminar Connections in the Neocortex.</a> Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).</li>
<li>Zarrinpar, A., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+connections+to+specific+types+of+layer+6+neurons+in+the+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).</li>
<li>Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+Transcallosal+Projections+Are+Present+throughout+the+Mouse+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36(2017).</li>
<li>DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+the+brain%2C+the+human+nature+of+cortical+circuits%2C+and+intellectual+creativity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29(2011).</li>
<li>Velmeshev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genomics+identifies+cell+type%E2%80%93specific+molecular+changes+in+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism.</a> Science. 364, 685-689 (2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在细胞密度较高的区域（如大脑皮层）体内研究细胞间相互作用是一项复杂的任务。传统的研究方法包括使用抗体标记神经突，但由于缺乏针对不同细胞群体的特异性标记物，这些方法并不适用。利用转基因小鼠模型，使特定细胞类型表达荧光蛋白，有助于观察神经元的突起结构，但该方法依赖于此类模型的可获得性。当需要在干扰目标基因后观察两种特定细胞类型之间相互作用的可能差异时，这一任务变得更加复杂，因为这涉及使用其他动物模型（如基因敲除小鼠）。由于经济和时间成本较高，上述种种问题在过去使这类研究变得困难。
新型体外转基因技术（如子宫内电穿孔）的出现，使得设计本方案中所述的实验策略成为可能，从而避免了使用或培育报告基因与基因敲除动物的双重需求，使此类实验更具可行性。本研究发表的结果以及先前已发表的研究8表明，该方案能够：1）成功靶向具有不同时间和空间来源的细胞群体；2）实现细胞间接触的高分辨率可视化；3）有效检测功能实验后细胞接触的差异。
尽管在体电穿孔技术被广泛应用，但该技术需要经过大量训练，才能安全地实施手...

大脑皮层是一个非常复杂且高度有序的结构。为了实现这种高度的组织性，皮层投射神经元必须经历一系列复杂的发育过程，包括在特定时间生成、迁移至皮层板中的最终位置，以及建立短程和远程连接1,2。长期以来，研究皮层发生的经典方法依赖于对目的基因构建小鼠的基因敲除或基因敲入模型。然而，这种策略，尤其是条件性基因敲除小鼠的使用，耗时较长且成本高昂，有时还会因基因冗余的存在或缺乏特异性的CRE驱动工具等原因带来其他问题。为应对上述挑战而发展起来的一种方法是子宫内电穿孔技术，该方法目前已被广泛用于研究皮层发育3,4。子宫内电穿孔是一种用于体细胞转基因的技术，可实现对神经干细胞及其子代细胞的体内靶向。该方法可用于通过表达荧光蛋白标记细胞5,6，进行体内基因操作（例如基因功能获得或功能缺失实验）7,8,9，以及体外分离电穿孔后的皮层组织并进行细胞培养8,10。此外，子宫内电穿孔还能实现对靶向区域的时间和空间特异性控制。该技术具有多种应用，已被广泛用于研究神经元迁移、干细胞分裂、神经元连接性等课题8,9,11,12。
本文描述了一种子宫内电穿孔技术的变体，称为双重子宫内电穿孔，用于分析具有不同时间和空间起源的细胞在大脑皮层中的相互作用。当使用小鼠模型时，这些研究极为复杂，因为需要联合使用多个转基因品系。本论文所述方案的一些应用包括研究邻近细胞之间的紧密相互作用，以及通过长距离投射实现的远距离细胞之间的相互作用。该方法要求在同一胚胎上进行两次独立的子宫内电穿孔手术，这两次手术在时间和空间上均有所分离，以靶向不同的目标细胞群体。该方法的优势在于可以利用野生型动物对一种或两种类型的神经元中的基因功能进行操控。此外，这些功能实验可与细胞质或膜标记的荧光蛋白表达相结合，以可视化靶向细胞的精细形态，包括树突和轴突，并分析其细胞相互作用与对照组（即仅标记荧光蛋白的细胞）相比可能存在的差异。
本文所述方案主要聚焦于新皮层内细胞相互作用的研究，但该策略也可用于研究通过胎内电穿孔技术可靶向的皮层外区域之间的相互作用，例如亚脑室区或丘脑13,14，或用于研究其他结构中的细胞间相互作用，例如小脑15。靶向不同脑区依赖于电极的放置方向以及DNA注射所进入的脑室（侧脑室、第三脑室或第四脑室）。采用本文所述策略，可标记大量细胞，适用于在功能实验中评估连接性或神经支配的整体变化。然而，若需研究连接性的细微变化，可采用改良的胎内电穿孔方法，实现更稀疏的标记，从而识别单个细胞16。总之，双重胎内电穿孔是一种多功能技术，可实现对时间和空间上分离的细胞群体进行靶向，并在对照条件或结合功能实验的条件下详细研究它们之间的相互作用，显著降低时间和经济成本。

<table><tbody><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-25G</td><td></td></tr><tr><td>吸液管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>婴儿米泽止血钳（灌注用）</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>WPI</td><td>1B100-6</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺（BUPREX 0.3 mg/ml）</td><td>Rb Pharmaceuticals Limited</td><td>921425</td><td></td></tr><tr><td>CAG-BFP 质粒</td><td>由 U.M&amp;uuml;ller 实验室惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CAG-EGFP 质粒</td><td>由 U.M&amp;uuml;ller 实验室惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CAG-mCherry 质粒</td><td>由 U.M&amp;uuml;ller 实验室惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CAG-mtdTomato-2A-nGFP 质粒</td><td>由 U.M&amp;uuml;ller 实验室惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV10i</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>BFHCVDF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水</td><td>B. Braun Surgical</td><td>1050044</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Zeiss</td><td>stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 精细镊子</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>ECM830 方波电穿孔仪</td><td>BTX</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>电动剃须刀</td><td>Oster</td><td>76998</td><td></td></tr><tr><td>无内毒素 TE 缓冲液</td><td>QIAGEN</td><td>1018499</td><td></td></tr><tr><td>乙醇擦拭巾</td><td>BFHCVDF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超精细格拉夫镊</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>眼药膏</td><td>Alcon</td><td>682542.6</td><td></td></tr><tr><td>快绿染料</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14069-09</td><td></td></tr><tr><td>荧光 LED 光源</td><td>CoolLED</td><td>pE-300-W</td><td></td></tr><tr><td>Genopure 质粒大提试剂盒</td><td>Roche</td><td>3143422001</td><td></td></tr><tr><td>哈尔斯特德-蚊式止血钳（缝合用）</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>91308-12</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>UFESA</td><td>AL5514</td><td></td></tr><tr><td>倒置落射荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE2000-S</td><td></td></tr><tr><td>碘伏擦拭巾</td><td>Lorsoul</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器</td><td>Flow-Meter</td><td>A15B5001</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Karizoo</td><td>586259</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮（Anastemine）</td><td>Fatro Ib&amp;eacute;rica SL</td><td>583889-2</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech 精密擦拭巾</td><td>Kimberly-Clark</td><td>7252</td><td></td></tr><tr><td>LB（Lennox）琼脂培养基 GEN</td><td>Labkem</td><td>AGLB-00P-500</td><td></td></tr><tr><td>LB（Lennox）肉汤培养基 GEN</td><td>Labkem</td><td>LBBR-00P-500</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>美托咪啶（Sedator）</td><td>Dechra</td><td>573749.2</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Menel-Gl&amp;auml;ser</td><td>15747592</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Labbox</td><td>SLIB-F10-050</td><td></td></tr><tr><td>封片介质</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>多孔板（24 孔）</td><td>SPL Life Sciences</td><td>32024</td><td></td></tr><tr><td>多孔板（48 孔）</td><td>SPL Life Sciences</td><td>32048</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（用于生理盐水溶液）</td><td>Fisher Scientific</td><td>10112640</td><td></td></tr><tr><td>25G 针头（BD Microlance 3）</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床 S150</td><td>Stuart Scientific</td><td>5133</td><td></td></tr><tr><td>P Selecta 培养箱</td><td>J. P. Selecta, s.a.</td><td>0485472</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>PanReac AppliedChem</td><td>A3813</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>蠕动灌注泵</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07522-30</td><td></td></tr><tr><td>铂金镊状电极，直径 5 mm</td><td>Btx</td><td>45-0489</td><td></td></tr><tr><td>Reflex 皮肤闭合系统 - 7 mm 夹子，每盒 100 个</td><td>AgnThos</td><td>203-1000</td><td></td></tr><tr><td>Reflex 皮肤闭合系统 - 7 mm 夹子施加器</td><td>AgnThos</td><td>204-1000</td><td></td></tr><tr><td>环形镊</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>PanReac AppliedChem</td><td>122712-1608</td><td></td></tr><tr><td>外科吸收垫（无菌）</td><td>HK Surgical</td><td>PD-M</td><td></td></tr><tr><td>缝合线（Surgicryl PGA 6-0）</td><td>SMI Suture Materials</td><td>BYD11071512</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器（BD plastipak）</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿 100 × 20 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>垂直式微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>直立式显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ni</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

双子宫内电穿孔技术用于时空分离的细胞群体靶向

Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations

子宫内电穿孔是一种广泛用于研究哺乳动物皮层发生的分子和细胞机制的活体DNA转染技术。该方法利用脑室系统导入目的DNA，并通过一对电极将遗传物质定向导入衬于脑室壁的神经干细胞中。该技术使研究人员能够标记特定细胞和/或操控这些细胞中目的基因的表达。其具有多种应用，包括神经元迁移、谱系追踪和轴突导向等实验。该方法的一个重要特点是具有时间和区域特异性控制能力，可规避与胚胎致死性或缺乏特异性CRE驱动小鼠相关的潜在问题。该技术的另一个重要优势在于，可显著减少建立新小鼠品系所需的时间和经济成本，这在研究不同发育阶段起源于大脑远端区域的细胞类型间相互作用时尤为重要。本文介绍一种双重电穿孔策略，可实现对在空间和时间上分离的细胞群体进行靶向操作。通过该方法，我们可在不同位置用选定的荧光蛋白标记不同亚型的细胞以实现可视化，和/或在适当时间调控这些不同细胞中目的基因的表达。该策略拓展了子宫内电穿孔的应用潜力，为研究通过迁移建立紧密接触的时空分离细胞群体以及通过轴突投射实现的长距离相互作用提供了强大工具，同时降低了时间和经济成本。

起源于远端区域且在不同时间产生的邻近细胞之间的相互作用：Cajal-Retzius细胞（CR细胞）与早期迁移的皮层投射神经元（策略A）
先前研究描述，利用双电穿孔策略，CR细胞与早期皮层投射神经元之间的相互作用对于通过nectin和cadherin黏附分子调控胞体迁移是必需的8。CR细胞起源于大脑皮层边缘区域的神经上皮，并沿切向迁移至皮层最表浅的部分——边缘带17,18,19，而皮层投射神经元则在大脑皮层的增殖区生成，并沿径向迁移进入正在形成的皮层板20。这两类细胞的生成存在时间上的差异：CR细胞在胚胎发育极早期（E10.5）即开始生成21,22，而通过...

子宫内双次电穿孔技术可用于靶向空间和时间上分离的细胞群体。该技术可用于在正常条件下通过荧光蛋白观察这些细胞群体之间的相互作用，也可在功能实验干扰目的基因后进行观察。

子宫内电穿孔是一种广泛用于研究哺乳动物发育过程中分子与细胞机制的活体DNA转导技术……

子宫内双次电穿孔是一种强大的方法，可用于研究哺乳动物皮层发生的重要方面，例如在不同位置和发育阶段产生的神经元细胞之间的相互作用。该技术的主要优势在于能够快速、详细且经济地检测这些不同细胞群体之间未受干扰的相互作用。我们方法的一个显著意义在于，它有助于更深入地理解在自闭症和精神分裂症等神经元疾病中，类似的神经连接方式是如何被改变的。本研究不仅限于新皮层，也可用于分析外皮层区域（如隔区或小脑）的细胞间相互作用。其中最具挑战性的步骤之一是将DNA注射到早期胚胎的侧脑室中。成功的注射必须使用高亮度光源。每台手术前，先配制10微升溶液，其中包含1微升快绿染料、每微克/微升目标质粒DNA溶液（针对每个质粒），以及适量的无内毒素TE缓冲液。然后用相应的已配制DNA溶液预装玻璃微毛细移液管。进行首例子宫内电穿孔手术时，将适当麻醉的孕鼠眼睛涂抹眼膏，并用剃须刀剃除腹部毛发。在进行腹部右侧切口前，先用70%乙醇和碘伏擦拭液依次对暴露的皮肤进行两次消毒。一旦子宫可触及，使用环形镊子小心取出该器官。使用口控吸引管，向策略A的E11.5胚胎左侧半球侧脑室注射约0.5 µL溶液，或向策略B的E13.5胚胎右侧半球侧脑室注射，直至在脑室内观察到快绿染料。当所有溶液注射完毕后，将铂金镊状电极从侧面放置于注射后胚胎的头部两侧，策略A时将正极朝向内侧壁以靶向皮层下区，策略B时则将正极朝向外侧皮层，注意避免接触心脏和胎盘。使用方波电穿孔仪，根据下表所示为不同胚胎年龄施加相应序列的电脉冲。当所有胚胎完成注射和电穿孔后，用镊子小心地将子宫放回腹腔，并用温热的生理盐水填充腹腔。使用6-0缝合线缝合腹壁，并仔细缝合皮肤切口。然后将动物放回其饲养笼中，并进行监测直至完全恢复。初次手术两天后，确认小鼠表现出正常行为，且无疼痛或不适迹象。在按照前述方法准备动物进行第二次子宫内电穿孔之前，将0.5微升所需的DNA溶液注射至E13.5胚胎的左侧侧脑室（策略A）或E15.5胚胎的左侧侧脑室（策略B）。每次注射后，放置电极，使正极朝向被注射半脑的外侧皮层（策略A和策略B均如此）。按照表格所示条件对胚胎进行电穿孔。电穿孔完成后，将子宫放回腹腔，并按前述方法完成手术及术后护理。实施策略A时，在第二次电穿孔后的第四天，将妊娠17.5天的雌性小鼠子宫取出，置于冰上含有PBS的培养皿中。在解剖显微镜下，使用镊子将胚胎转移至另一含有PBS的新培养皿中。用镊子小心夹住每个胚胎的头部，以便去除覆盖头部和颅骨的皮肤。使用镊子或刮勺取出暴露的脑组织，然后用勺子将每份脑组织转移至含有约 600 µL 固定液的 48 孔板的单个孔中。待所有脑组织收集完毕后，在 4°C 条件下于旋转摇床上固定过夜，随后用 PBS 洗涤三次，每次十分钟。最后一次洗涤后，将脑组织置于含4%低熔点琼脂糖的PBS中，孵育约十分钟。待琼脂糖完全凝固后，使用氰基丙烯酸酯

double-utero-electroporation-to-target-temporally-spatially-separated

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

双电穿孔，以定时和空间分离的细胞群

子宫内活体注射与电穿孔转染胚胎小鼠新皮层是一种强大的技术，可用于操控单个神经前体细胞……...

E15小鼠胚胎的子宫内脑室内注射与电穿孔技术

在子宫内 电穿孔是一种用于转染神经前体细胞的有效方法 体内根据电极的位置和电穿孔的发育时间点，可以选择性地靶向特定的皮层细胞亚群。随后可对这些靶向细胞进行分析 体内 或 体外...

在子宫内 电穿孔联合原代神经元培养用于研究皮层神经元亚群中的基因功能

高效基因递送至中枢神经系统多个区域 在子宫内 电穿孔

本文介绍了一种利用独特手术方法和特殊形状电极将基因转入发育中 小鼠大脑...

小鼠 在子宫内 电穿孔：可控时空基因转染

本视频展示了利用子宫内电穿孔技术将质粒DNA递送至小鼠胚胎小脑神经元细胞的方法。该技术有助于理解基因在正常脑发育过程中的体内功能，以及神经元细胞在肿瘤进展过程中基因表达的变化。...

基于子宫内电穿孔的基因递送技术：向小鼠胚胎小脑细胞注射质粒DNA的方法

该方法展示了如何在发育中的小鼠前脑中靶向中间神经元 在子宫内...

皮层中间神经元亚型选择性电穿孔

我们展示了一种将培养细胞移植至早期小鼠胚胎特定部位的方法，以确定其 体内...

精确局部转移细胞或DNA至早期着床后小鼠胚胎的方法

本方案详细描述了如何通过特定方法转染C57BL/6中枢神经系统的不同区域 in utero...

大脑皮层、海马、丘脑、下丘脑、外侧隔核和纹状体特异性 子宫内 C57BL/6小鼠中的电穿孔技术

本文提供了使用以下方案 在子宫内...

子宫内 研究神经元亚群兴奋性及单细胞连接性的电穿孔技术

本文介绍了一种利用子宫内电穿孔技术在雪貂胚胎脑中进行遗传操作的实验方案。该方法可在体内实现对新皮层中神经前体细胞的靶向操作。...

在体电穿孔靶向雪貂新皮层中的神经前体细胞

了解双子宫内电穿孔技术，用于研究哺乳动物大脑皮层发育过程中不同时空神经元群体的相互作用。该方法通过荧光蛋白可视化细胞互作，有助于揭示自闭症和精神分裂症等神经发育疾病的神经环路改变机制。

双子宫内电穿孔技术用于时空分离的细胞群体靶向

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