利用流式细胞术定量人诺如病毒样颗粒与共生细菌的结合

病毒与细菌之间的相互作用对于病毒成功感染以及激活宿主免疫反应可能具有重要意义。但目前在实验室中尚无法制备高浓度且高纯度的人诺如病毒储备液。该技术可用于任何能够与细菌结合的病毒，只要存在相应的病毒样颗粒或活病毒即可。

这使我们能够量化这些病毒与细菌之间的相互作用。从琼脂平板上直接挑取一株来自冻存甘油菌种的阴沟肠杆菌单菌落，接种于5 mL液体培养基中。将细菌培养过夜。

第二天，将培养物各1.3毫升分装至两个独立的1.5毫升离心管中。在10,000 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，然后用1毫升无菌1×PBS洗涤样品，每次洗涤重复两次。

将样品再次在10,000 × g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于1.3毫升无菌1×PBS中。从0.5毫升洗涤后的菌液开始，用1×PBS将细菌进行连续稀释，稀释梯度从10⁻¹至10⁻⁴。

使用分光光度计，在600纳米处测定洗涤后未稀释的菌液及四个稀释度菌液的光密度。将前述各稀释度菌液用1×PBS进行10倍系列稀释。将每个系列最后三个稀释度的100微升菌液涂布于琼脂平板，以测定每个样品每毫升中的菌落形成单位数。

将平板在室温下静置干燥5分钟。将平板倒置后放入培养箱中孵育。在按照文稿所述完成试剂、抗体和细菌的准备后，于BSL-2生物安全柜内组装所有材料。

人诺如病毒的病毒样颗粒被列为生物安全等级2级（BSL-2）病原体，所有使用病毒样颗粒（VLP）的操作均须在经过认证的生物安全柜中进行。将10微克的人诺如病毒VLP加入每管细菌中，并用移液器充分混匀。将各管在37°C条件下孵育1小时，同时持续旋转。

孵育后，于10,000 × g离心5分钟。吸除上清液并弃去，将细菌沉淀重悬于1毫升PBS中。重复洗涤步骤一次后，再次于10,000 × g离心5分钟。

弃去上清液，将VLP-细菌沉淀重悬于150微升5%封闭缓冲液中。常见的错误是试管被混淆，导致添加了错误的处理试剂。为避免此问题，应将所有试管按对应的处理方式排成行，并一次性向各试管中加入同一种处理试剂。

针对每种细菌样品，准备 50 微升稀释后的人类诺如病毒 GII 型抗体。使用 5% 封闭缓冲液，将阴沟肠杆菌（E.cloacae）样品的抗体按 1:125 比例稀释。针对每种细菌样品，使用相同的稀释比例，准备 50 微升稀释后的同型对照抗体。

将每个黏附实验样品转移至洁净的1.5毫升离心管中，分成每份350微升的等分试样。为制备未染色对照组，向每份细菌样品的第一个等分试样中加入50微升封闭缓冲液。对于染色样品，向第二组等分试样中加入50微升GII抗体稀释液。

通过向第三组等分试样中加入50微升稀释后的同型抗体来制备同型对照。将所有样品置于冰上并避光孵育30分钟。然后以10,000 × g离心所有样品5分钟。

弃去上清液，并将每个样品重悬于150微升FCSB中。再次以10,000 × g离心所有样品5分钟。再次弃去上清液，并将样品重悬于100微升FCSB中。

将样品最后一次离心并弃去上清液后，用150 µL FCSB重悬样品。将每份样品转移至含有400 µL FCSB的离心管中，终体积为550 µL。将样品置于4 °C保存，直至进行流式细胞术分析。

使用流式细胞术检测VLP的结合情况。首先，利用密度图排除细胞碎片，随后通过点图设门去除细菌双联体和细胞团块。代表性直方图显示，仅含细菌的样本中无PE信号，而VLP:细菌样本中的PE信号强度相较于未染色对照和同型对照均出现明显偏移。

与10微克VLP孵育一小时后，流式细胞术检测到VLP颗粒结合至大肠杆菌（E.colacae）和加氏乳杆菌（L.gasseri）。为确定本实验中结合定量的检测下限，在将VLP加入细菌前，预先制备了VLP的系列稀释液。随着VLP用量的减少，被VLP结合的细菌百分比相应降低。

了解病毒与细菌的比例，并在不同实验之间保持该比例的一致性，对于结果的解读至关重要。可通过构建细菌和病毒的突变体，以特异性确定介导这种相互作用的微生物表面结构。该技术使研究人员能够探究影响诺如病毒与细菌相互作用的各种条件和环境因素，包括病毒基因型的变化、细菌培养条件的改变以及细菌表面结构的变异如何影响病毒的结合能力。