Name: 使用流细胞测定量化人类诺如病毒样颗粒与准细菌结合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 了解如何使用流式细胞术量化人类诺如病毒样颗粒与革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的结合。该方法无需活病毒即可研究病毒与细菌的相互作用，适用于评估共生细菌如何影响病毒感染机制。

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我们感谢 Sutonuka Bhar 和 Chanel Mosby-Haundrup 对文稿撰写的宝贵审阅意见，同时感谢 Alfonso Carrillo 在生成细菌标准曲线方面的协助。本工作部分由美国国立卫生研究院资助（项目编号：R21AI140012）以及佛罗里达大学食品与农业科学研究所种子基金资助。

注意：本方案中所述的细菌培养条件是阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）和加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）的标准培养条件。若需对其他细菌种类进行病毒-细菌结合实验，应根据所选细菌的标准培养条件进行培养。
1. 准备细菌培养基
<ol>
	<li>Enterobacter cloacae 培养基
	<ol>
		<li>通过将 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物和 10 g 氯化钠（NaCl）溶解于 1 L 去离子水（DI 水）中来制备液体培养基（参见材料表）。充分混合所有培养基成分，并在高压灭菌器中灭菌 30 分钟。</li>
		<li>通过将 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、10 g NaCl 和 15 g 琼脂溶解于 1 L 去离子水中来制备固体培养基。充分混合所有培养基成分，并在高压灭菌器中灭菌 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lactobacillus gasseri 培养基
	<ol>
		<li>通过将 55 g 脱曼-罗戈萨-夏普（MRS；参见材料表）粉末溶解于 1 L 去离子水中来制备液体培养基。培养基应在配制后一个月内使用。灭菌时，先加热培养基 15 分钟至沸腾，随后进行高压灭菌 15 分钟。</li>
		<li>通过将 55 g MRS 粉末和 15 g 琼脂溶解于 1 L 去离子水中来制备固体培养基。灭菌时，先加热培养基 15 分钟至沸腾，随后进行高压灭菌 15 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 建立光学密度（OD）与细菌浓度相关性的标准曲线
<ol>
	<li>从琼脂平板（E. cloacae）上挑取单个分离菌落，或直接从冻存的甘油菌种（L. gasseri）中接种5 mL适宜的液体培养基。</li>
	<li>在适当的气体环境下培养细菌过夜（Enterobacter cloacae：37 °C、有氧、200 rpm振荡培养；L. gasseri：37 °C水浴，密闭容器中静置培养）。</li>
	<li>将过夜培养物各取2 × 1.3 mL分装至两个独立的1.5 mL离心管中，在10,000 × g 条件下离心5分钟，收集菌体。</li>
	<li>弃去上清液，用1 mL无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤菌体沉淀。重复此洗涤步骤，共洗涤2次。</li>
	<li>再次在10,000 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液后将菌体重悬于1.3 mL无菌1× PBS中。</li>
	<li>以0.5 mL洗涤后的菌液为起始，用1× PBS对菌液进行连续10倍系列稀释，稀释梯度从10-1至10-4。</li>
	<li>使用分光光度计测定洗涤后未稀释菌液及四个稀释梯度菌液在600 nm处的光密度（OD600）。</li>
	<li>对步骤6中各稀释液继续在1× PBS中进行10倍系列稀释。取每一系列最后3个稀释度的菌液各100 µL，分别涂布于适宜的固体培养基上，以测定各样品的每毫升菌落形成单位数（CFU/mL）。每个稀释度设三个重复。</li>
	<li>将平板在室温下静置干燥5分钟，倒置后置于适宜的气体条件下培养（E. cloacae：37 °C有氧培养，过夜；L. gasseri：37 °C厌氧培养，在密闭容器中加入厌氧空气袋培养48小时（见材料表））。 
	注意：每2.5 L培养罐使用1个厌氧空气袋，或每7.0 L培养罐使用3个厌氧空气袋（见材料表）。</li>
	<li>根据平板计数结果确定5个样品（即未稀释液、10-1、10-2、10-3、10-4）的CFU/mL值。绘制OD600与CFU/mL之间的标准曲线。该标准曲线的回归方程将用于病毒样颗粒-细菌结合实验中，根据OD600推算CFU/mL。</li>
</ol>
3. VLP-细菌结合实验
警告：人诺如病毒样颗粒（VLPs）属于生物安全二级（BSL-2）危害，所有涉及VLPs的操作均应在生物安全柜中进行。在进行黏附实验前的细菌培养制备，应根据所用生物体采取相应的安全操作条件。
<ol>
	<li>试剂准备
	<ol>
		<li>1x 磷酸盐缓冲液（PBS）
		<ol>
			<li>将一整包试剂溶解于 1 L 去离子水中，配制 10x PBS 溶液 1 L。</li>
			<li>将溶液高压灭菌 30 分钟。</li>
			<li>用去离子水将上述 10x 溶液按 1:10 比例稀释，得到 1x 溶液。</li>
			<li>通过 0.22 μm 滤膜过滤除菌，并于室温保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>5% BSA
		<ol>
			<li>将 5 g 牛血清白蛋白（BSA）粉末加入 100 mL PBS 中，配制成 5%（w/v）溶液。</li>
			<li>通过涡旋振荡或使用金属搅拌子在搅拌器上搅拌，直至团块完全溶解。</li>
			<li>使用 0.22 μm 滤膜过滤除菌。</li>
			<li>将溶液于 4 °C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>流式细胞术染色缓冲液（FCSB）
		<ol>
			<li>将购买的 FCSB（见材料表）通过 0.22 μm 滤膜过滤。</li>
			<li>将剩余溶液于 4 °C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>5% 封闭缓冲液（BB） 
		注意：每次均需新鲜配制。
		<ol>
			<li>将 0.5 g BSA 加入 10 mL 无菌 FCSB 中。</li>
			<li>涡旋振荡使样品充分混匀，并置于冰上直至使用。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗体偶联
	<ol>
		<li>使用 R-PE 抗体标记试剂盒，按照制造商说明书将人诺如病毒 GII 抗体（见材料表）与 R-藻红蛋白（PE）进行偶联（见材料表）。</li>
		<li>将偶联后的抗体避光保存于 4 °C，用于后续 VLP-细菌结合实验分析。 
		注意：在进行 VLP-细菌结合实验前，应先对一抗进行滴定，以确定流式细胞术分析所需的合适浓度。每次进行偶联反应以及在结合实验中使用不同细菌时，均应重新进行抗体滴定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗体滴定
	<ol>
		<li>将偶联的人诺如病毒 GII 抗体进行 100 倍稀释，起始稀释度为 1:100，终末稀释度为 1:600（共六种稀释度）。</li>
		<li>按以下所述进行病毒结合实验，唯一例外是：在步骤 3.5.7 中，将细菌沉淀重悬于 350 µL 的 5% BB 中。</li>
		<li>将样品分为七份，每份 50 µL。</li>
		<li>向其中六个管中分别加入 50 µL 不同稀释度的抗体溶液。</li>
		<li>向第七个管中加入 50 µL 的 5% BB，作为空白对照（未染色对照）。</li>
		<li>按以下所述对所有样品进行流式细胞术检测。</li>
		<li>将各稀释度的抗体样品与未染色对照及其他样品相互比较。应选择不会导致阳性信号减弱或丢失的最低抗体浓度，用于后续实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细菌制备
	<ol>
		<li>在适当的液体培养基中，于适宜的大气条件下培养细菌 40 mL，直至进入稳定期。
		<ol>
			<li>将E. cloacae 培养物在 LB 肉汤中于 37 °C、200 rpm 摇床条件下需氧培养过夜，以达到稳定期。</li>
			<li>将L. gasseri 培养物置于 MRS 肉汤中，装入黑色螺旋盖管，在 37 °C 水浴中静置培养 18 小时，以达到稳定期。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将处于稳定期的培养物转移至洁净的 50 mL 圆锥形离心管中，在 2,288 x g 条件下离心 10 分钟，使细菌沉淀。</li>
		<li>弃去上清液，加入 13 mL 无菌 1x PBS 重悬菌体。重复此洗涤步骤，共洗涤两次。</li>
		<li>再次离心样品，弃去上清液，用 20 mL 1x PBS 重悬样品。 
		注意：若菌体沉淀量较少，可适当减少重悬体积。</li>
		<li>测定菌液在 OD600 处的吸光度。</li>
		<li>利用先前制备的标准曲线，确定洗涤后菌液的每毫升菌落形成单位（CFU/mL）。</li>
		<li>根据需要，用 1x PBS 稀释细菌，调整菌液浓度至 1 x 108 CFU/mL。</li>
		<li>将 1 mL 浓度为 1 x 108 CFU/mL 的细菌培养物转移至所需数量的 1.5 mL 离心管中。</li>
		<li>在 10,000 x g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>将细菌沉淀重悬于 1 mL 无菌 5% BSA 中。</li>
		<li>在 37 °C 条件下持续旋转孵育 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>病毒结合
	<ol>
		<li>在 BSL-2 生物安全柜内操作，向每管含有 PBS 重悬细菌的离心管中加入 10 µg HuNoV VLPs（见材料表），并通过移液充分混匀。 
		注意：每批 VLP 制备物的浓度可能不同，因此加入细菌的 VLP 体积会因批次而异，应相应调整，确保每管实验中加入 10 µg VLP。对于仅含细菌的对照组（例如不含 VLP 的样品），应加入与实验组 VLP 体积相等的 PBS。</li>
		<li>在 37 °C 条件下持续旋转孵育 1 小时。 
		注意：孵育过程中使用转管仪（见材料表），设定转速为 40 rpm。</li>
		<li>孵育结束后，在 10,000 x g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细菌沉淀重悬于 1 mL PBS 中。</li>
		<li>重复步骤 3.5.3 和 3.5.4 的洗涤步骤。</li>
		<li>在 10,000 x g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细菌沉淀重悬于 150 µL 的 5% BB 中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗体染色
	<ol>
		<li>新鲜配制 5% BB。 
		注意：所有使用荧光标记抗体的操作均应在避光条件下进行，且抗体、BB 和 FCSB 应始终置于冰上。</li>
		<li>将人诺如病毒 GII 抗体用 5% BB 分别按 1:125（用于E. cloacae 样品）和 1:150（用于L. gasseri 样品）稀释，每份样品准备 50 µL 稀释抗体。</li>
		<li>将同型对照抗体以相同方式在 5% BB 中稀释，每份样品准备 50 µL 稀释后的同型对照抗体。</li>
		<li>将步骤 3.3.7 中的每个结合实验样品均分为三份，每份 50 µL，转移至洁净的 1.5 mL 离心管中。</li>
		<li>向第一组样品中加入 50 µL BB。该组作为未染色（Uns）对照。</li>
		<li>向第二组样品中加入 50 µL GII 抗体稀释液。最终抗体浓度为E. cloacae 样品 1:250，L. gasseri 样品 1:300。该组为染色（AB）样品。</li>
		<li>向第三组样品中加入 50 µL 稀释的同型抗体。该组作为同型对照（IC）。通过移液充分混匀。将所有样品置于冰上并避光孵育 30 分钟。</li>
		<li>将所有样品在 10,000 x g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将样品重悬于 100 µL FCSB 中。</li>
		<li>将所有样品在 10,000 x g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，将样品重悬于 100 µL FCSB 中。</li>
		<li>将所有样品在 10,000 x g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将样品重悬于 150 µL FCSB 中。</li>
		<li>将每份样品转移至含有 400 µL FCSB 缓冲液的 FCSB 管中，总体积为 550 µL。</li>
		<li>将样品于 4 °C 保存，直至进行流式细胞术分析。 
		注意：抗体染色后应在 4 小时内完成流式细胞术检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 流式细胞术
注意：以下所述的电压设置基于材料表中列出的流式细胞仪和软件，不同流式细胞仪的设置可能有所差异。每种细菌的检测条件均需进行优化。确保所有图表的坐标轴均处于双指数相位。
<ol>
	<li>设置工作区 
	注意：用于建立工作区的图谱设置与门控和数据分析中使用的设置不同。设置工作区的目的是可视化细胞群体，确保细菌细胞没有过度聚集而影响后续分析，并在数据采集过程中区分染色与未染色细胞。
	<ol>
		<li>为确保细菌不发生聚集，需建立一系列密度图。
		<ol>
			<li>生成前向散射面积（FSC-A）对侧向散射面积（SSC-A）的图谱，以观察总细胞群体。</li>
			<li>通过创建两个图谱来评估单细胞与细胞团簇：分别将前向散射宽度（FSC-W）和侧向散射宽度（SSC-W）与前向散射高度（FSC-H）和侧向散射高度（SSC-H）进行比较。</li>
			<li>创建一个仅显示PE阳性群体的图谱（PE-A 对 SSC-A）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将 E. cloacae 的基线电压设为 500，L. gasseri 的基线电压设为 340。这些参数将在后续进一步调整。</li>
		<li>将总采集事件数设为 10,000 个事件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行样本
	<ol>
		<li>创建三个独立的直方图，分别显示计数与 SSC-A、FSC-A 或 PE-A 的关系。</li>
		<li>将未染色样本上机进行流式细胞仪检测并采集事件数据，确保 SSC-A 直方图的最大峰位于 x 轴 102 至 103 范围内，FSC-A 直方图的最大峰位于 x 轴 104 至 105 范围内。若峰值不在指定范围内，则相应调整 FSC 和 SSC 电压。</li>
		<li>将染色样本（AB）上机，调整 PE 电压，使最大峰值超过 x 轴 103。</li>
		<li>根据上述测量结果，设定 PE 阳性门，并在 PE-A 对 SSC-A 的密度图上设置门控。</li>
		<li>在确定的设置条件下，以低速或中速运行所有样本。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+global+burden+of+noroviruses+and+opportunities+for+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).</li>
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<li>Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GII.4+Human+Norovirus%3A+Surveying+the+Antigenic+Landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape.</a> Viruses. 11 (2), (2019).</li>
<li>Prasad, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallographic+structure+of+the+Norwalk+virus+capsid%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid.</a> Science. 286 (5438), New York, N.Y. 287-290 (1999).</li>
<li>Baric, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+self-assembly+of+norwalk+virus+capsid+protein+from+venezuelan+equine+encephalitis+virus+replicons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons.</a> Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).</li>
<li>Rubio-del-Campo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noroviral+p-particles+as+an+in+vitro+model+to+assess+the+interactions+of+noroviruses+with+probiotics%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics.</a> PLOS One. 9 (2), 89586(2014).</li>
<li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+modifications+of+norovirus+P+domain+resulted+in+a+new+type+of+subviral+particles%2C+the+small+P+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles.</a> Virology. 410 (2), 345-352 (2011).</li>
</ol>

作者不存在任何利益冲突。

定量分析肠道病毒与细菌结合的能力，是阐明这些细菌如何改变病毒感染机制的关键第一步。本文所述方法已优化用于检测人诺如病毒病毒样颗粒（VLP）与阴性菌 E. cloacae 以及阳性菌 L. gasseri 之间的相互作用，但也可根据需要调整用于其他任何感兴趣的哺乳动物病毒与细菌。尽管VLP在黏附实验中是活病毒的理想替代物，并且可通过流式细胞术轻松定量，但P颗粒也已被用于研究人诺如病毒与细菌之间的相互作用24。在本研究中，定量的是结合到细菌上的病毒量，而非细菌群体数量，后者如本文所报告。P颗粒相较于VLP的优势在于其更易于制备，同时在抗原性上与VLP及野生型病毒均具有相似性24,25。然而，人诺如病毒VLP目前可商业化获取，为不具备VLP或P颗粒生产能力的实验室提供了便利。P颗粒与VLP的不同之处在于：VLP保持了野生型病毒颗粒的大小，而P颗粒更小，且具有四面体对称性而非二十面...

人诺如病毒（HuNoVs）是全球胃肠道疾病的首要病因，每年导致约6.85亿例感染和超过20万例死亡1。与其他肠道病毒类似，已有研究表明，共生细菌的存在可增强该病原体及其替代病毒——小鼠诺如病毒的感染能力2,3。然而，也有相互矛盾的报道指出，细菌可能抑制人诺如病毒的感染4,5,6。对于多种病毒而言，病毒与细菌之间的直接相互作用似乎是影响病毒感染机制的基础2,7,8,9,10，并且通过电子显微镜已证实人诺如病毒可直接结合到细菌表面11,12。因此，表征这些相互作用对于阐明细菌影响病毒感染的机制至关重要。此类表征通常始于量化病毒对宿主微生物组中多种细菌物种的结合能力7,12,13。这些黏附实验不仅能够揭示结合至细菌的病毒量，还有助于确定这种相互作用对病毒适应性与存活的影响。
为了定量病毒的吸附作用，传统方法包括基于PCR的检测，用于定量病毒基因组12，或制备放射性标记的病毒并结合闪烁计数法来定量病毒颗粒7,8,9,13。这些方法通常需要高滴度的病毒储备液，以及相应的体外培养技术来制备病毒。尽管目前已建立多种人诺如病毒的培养系统2,14,15，但尚无一种系统能够支持高效复制以产生所需的高浓度病毒储备液，这限制甚至无法实现利用PCR或闪烁计数法来定量人诺如病毒与细菌之间的相互作用。
为解决这一问题，可使用病毒样颗粒（VLPs）作为活病毒的替代物，以研究人诺如病毒与细菌之间的相互作用16,17。VLPs 是非感染性颗粒，其形态与来源病毒高度相似。对于人诺如病毒而言，这些颗粒由 VP1（有时还包括 VP2）蛋白表达产生，这些蛋白可自我组装形成完整的病毒衣壳，但不含遗传物质（即诺如病毒的 RNA）。这些 VLPs 已被充分表征，其结构和抗原性与来源的野生型病毒高度相似18,19,20,21,22,23。因此，VLPs 是研究人诺如病毒与共生细菌表面相互作用的理想替代模型。由于 VLPs 不含遗传物质，基于 PCR 的检测方法无法用于量化病毒结合。此前已有研究描述了一种基于抗体的流式细胞术方法，可半定量地检测 VLPs 与细菌的低水平结合16。该方法已得到优化，能够准确量化人诺如病毒 VLPs 与革兰氏阴性及革兰氏阳性共生细菌的结合情况16。

<table><tbody><tr><td>5ml 聚苯乙烯圆底带滤网帽试管</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>抗体染色后，样品转移至该试管中用于流式细胞术分析。</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Sigma</td><td>A7002</td><td>用于培养基制备</td></tr><tr><td>AnaeroPack</td><td>Thermo Scientific</td><td>R681001</td><td>用于加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）培养的厌氧气体发生包</td></tr><tr><td>BD FacsDiva 软件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR Fortessa 流式细胞仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1605</td><td>用于流式细胞术</td></tr><tr><td>流式细胞术染色缓冲液（FCSB）</td><td>BD Biosciences</td><td>554657</td><td>用于流式细胞术</td></tr><tr><td>小鼠 IgG2b κ 同型对照抗体（eBMG2b），PE 标记，eBioscience</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12473281</td><td>同型对照抗体。该抗体由厂家提供偶联形式。</td></tr><tr><td>MRS 培养基粉末</td><td>BD Biosciences</td><td>288130</td><td>用于培养基制备及加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）的培养。</td></tr><tr><td>诺如病毒衣壳 G2 单克隆抗体（L34D）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-18241</td><td>诺如病毒 GII 型抗体。该抗体仅以未偶联形式提供，因此在进行所述流式细胞术检测前必须进行荧光标记。本方案中选用 PE 作为荧光素，但研究者可根据所用流式细胞仪的具体情况选择其他合适的荧光分子。</td></tr><tr><td>诺如病毒 GII.4 病毒样颗粒（VLP）</td><td>Creative Biostructure</td><td>CBS-V700</td><td>人诺如病毒病毒样颗粒，通过杆状病毒系统表达并重悬于含 10% 甘油的磷酸盐缓冲液中。作者通过独立的纳米颗粒追踪分析测定 VLP 的颗粒浓度，浓度约为每毫升 10&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt; 个 VLP。根据 VLP 的蛋白浓度，在 VLP 结合实验中，每个细菌大约加入 200 个颗粒。</td></tr><tr><td>PBS 10X</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP665</td><td>使用前稀释至 1X。</td></tr><tr><td>SiteClick R-PE 抗体标记试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S10467</td><td>用于未偶联抗体的荧光标记。</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271</td><td>用于培养基制备</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td>用于培养基制备</td></tr><tr><td>Tube Revolver 混匀仪</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88881001</td><td>用于病毒-细菌结合实验，设置为最高转速（40 rpm）。</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td>用于培养基制备</td></tr></tbody></table>

利用流式细胞术定量人诺如病毒样颗粒与共生细菌的结合

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

共生细菌对真核病毒的感染具有明确的影响。病原体与宿主微生物组之间的直接结合是多种病毒改变感染过程的原因。因此，表征病毒与细菌结合的性质是阐明细菌如何改变病毒感染机制的基础步骤。对于人诺如病毒而言，共生细菌可增强其对B细胞的感染。该病毒可直接结合这些细菌，表明这种直接相互作用参与了感染增强的机制。可采用多种技术定量细菌与病毒之间的相互作用，包括放射性标记病毒的闪烁计数和聚合酶链式反应（PCR）。这两种方法均需使用活病毒，而这类病毒可能需要在实验室中进行制备。目前，尚无足够高效的人诺如病毒体外培养系统可用于制备高浓度的病毒储备液。因此，研究中常使用病毒样颗粒（VLPs）来表征诺如病毒与细菌之间的相互作用。本文介绍了一种基于流式细胞术的方法，利用病毒特异性抗体定量VLP与革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌的结合情况。实验中同时设置了仅含细菌的对照组和同型对照组，以优化检测条件，减少抗体非特异性结合背景信号，从而准确量化VLP在测试细菌上的附着情况。当VLP与细菌的比例较高时，VLP可结合大部分细菌群体；然而，当VLP数量减少时，结合的细菌比例也随之下降。最终，该方法可用于后续实验，以阐明调控诺如病毒与细菌相互作用的具体条件及其结构组分。

用于量化人诺如病毒VLP与共生细菌结合的设门策略如图1所示。代表性密度点图展示了样本设门方式，以排除细胞碎片和细胞聚集体，从而确保VLP结合的测定基于单细胞群体（图1A）。代表性直方图显示，在不含诺如病毒VLP的细菌样本中，抗诺如病毒抗体信号水平较低；在VLP-细菌样本中，使用同型对照抗体染色后背景信号亦较低（图1B）。同型对照峰与未染色样本峰重叠，而使用抗人诺如病毒GII型抗体对相同样本染色后，峰位置出现显著偏移。
采用Overton直方图减法，将抗人诺如病毒GII抗体染色样本中的PE阳性信号与相应同型对照的PE阳性信号进行比较，以确定结合人诺如病毒VLPs的细菌群体百分比（<strong class="x...

本实验方案的目的是定量分析真核病原体人诺如病毒与细菌的结合能力。在完成初步的病毒-细菌结合实验后，采用流式细胞术检测整个细菌群体中与病毒结合的细菌。

共生细菌对真核病毒的感染具有明确的影响。病原体与宿主微生物组之间的直接结合是……

病毒与细菌之间的相互作用对于病毒成功感染以及激活宿主免疫反应可能具有重要意义。但目前在实验室中尚无法制备高浓度且高纯度的人诺如病毒储备液。该技术可用于任何能够与细菌结合的病毒，只要存在相应的病毒样颗粒或活病毒即可。这使我们能够量化这些病毒与细菌之间的相互作用。从琼脂平板上直接挑取一株来自冻存甘油菌种的阴沟肠杆菌单菌落，接种于5 mL液体培养基中。将细菌培养过夜。第二天，将培养物各1.3毫升分装至两个独立的1.5毫升离心管中。在10,000 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，然后用1毫升无菌1×PBS洗涤样品，每次洗涤重复两次。将样品再次在10,000 × g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于1.3毫升无菌1×PBS中。从0.5毫升洗涤后的菌液开始，用1×PBS将细菌进行连续稀释，稀释梯度从10⁻¹至10⁻⁴。使用分光光度计，在600纳米处测定洗涤后未稀释的菌液及四个稀释度菌液的光密度。将前述各稀释度菌液用1×PBS进行10倍系列稀释。将每个系列最后三个稀释度的100微升菌液涂布于琼脂平板，以测定每个样品每毫升中的菌落形成单位数。将平板在室温下静置干燥5分钟。将平板倒置后放入培养箱中孵育。在按照文稿所述完成试剂、抗体和细菌的准备后，于BSL-2生物安全柜内组装所有材料。人诺如病毒的病毒样颗粒被列为生物安全等级2级（BSL-2）病原体，所有使用病毒样颗粒（VLP）的操作均须在经过认证的生物安全柜中进行。将10微克的人诺如病毒VLP加入每管细菌中，并用移液器充分混匀。将各管在37°C条件下孵育1小时，同时持续旋转。孵育后，于10,000 × g离心5分钟。吸除上清液并弃去，将细菌沉淀重悬于1毫升PBS中。重复洗涤步骤一次后，再次于10,000 × g离心5分钟。弃去上清液，将VLP-细菌沉淀重悬于150微升5%封闭缓冲液中。常见的错误是试管被混淆，导致添加了错误的处理试剂。为避免此问题，应将所有试管按对应的处理方式排成行，并一次性向各试管中加入同一种处理试剂。针对每种细菌样品，准备 50 微升稀释后的人类诺如病毒 GII 型抗体。使用 5% 封闭缓冲液，将阴沟肠杆菌（E.cloacae）样品的抗体按 1:125 比例稀释。针对每种细菌样品，使用相同的稀释比例，准备 50 微升稀释后的同型对照抗体。将每个黏附实验样品转移至洁净的1.5毫升离心管中，分成每份350微升的等分试样。为制备未染色对照组，向每份细菌样品的第一个等分试样中加入50微升封闭缓冲液。对于染色样品，向第二组等分试样中加入50微升GII抗体稀释液。通过向第三组等分试样中加入50微升稀释后的同型抗体来制备同型对照。将所有样品置于冰上并避光孵育30分钟。然后以10,000 × g离心所有样品5分钟。弃去上清液，并将每个样品重悬于150微升FCSB中。再次以10,000 × g离心所有样品5分钟。再次弃去上清液，并将样品重悬于100微升FCSB中。将样品最后一次离心并弃去上清液后，用150 µL FCSB重悬样品。将每份样品转移至含有400 µL FCSB的离心管中，终体积为550 µL。将样品置于4 °C保存，直至进行流式细胞术分析。使用流式细胞术检测VLP的结合情况。首先，利用密度图排除细胞碎片，随后通过点图设门去除细菌双联体和细胞团块。代表性直方图显示，仅含细菌的样本中无PE信号，而VLP:细菌样本中的PE信号强度相较于未染色对照和同型对照均出现明显偏移。与10微克VLP孵育一小时后，流式细胞术检测到VLP颗粒结合至大肠杆菌（E.colacae）和加氏乳杆菌（L.gasseri）。为确定本实验中结合定量的检测下限，在将VLP加入细菌前，预先制备了VLP的系列稀释液。随着VLP用量的减少，被VLP结合的细菌百分比相应降低。了解病毒与细菌的比例，并在不同实验之间保持该比例的一致性，对于结果的解读至关重要。可通过构建细菌和病毒的突变体，以特异性确定介导这种相互作用的微生物表面结构。该技术使研究人员能够探究影响诺如病毒与细菌相互作用的各种条件和环境因素，包括病毒基因型的变化、细菌培养条件的改变以及细菌表面结构的变异如何影响病毒的结合能力。

quantifying-human-norovirus-virus-like-particles-binding-to-commensal

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用流细胞测定量化人类诺如病毒样颗粒与准细菌结合

本文介绍一种定量小鼠诺如病毒（MNV）感染性颗粒的方法，MNV 是唯一能在细胞培养中高效复制的诺如病毒。空斑试验利用 MNV 对小鼠巨噬细胞的嗜性，可适用于含有 MNV...

小鼠诺如病毒蚀斑试验

来源：Moore, M. D., et al. 检测病毒衣壳结构完整性的替代体外方法。J. Vis. Exp.

使用动态光散射技术追踪病毒样颗粒的聚集行为

本视频展示了玻连蛋白与细菌表面蛋白相互作用的检测方法。通过流式细胞术分析结合在玻连蛋白上的荧光标记抗体所产生的荧光信号，可确认玻连蛋白存在于细菌表面。该技术有助于理解宿主与病原体之间的相互作用，并为细菌感染的潜在治疗策略提供线索。...

使用流式细胞术检测玻璃连接蛋白与细菌表面的结合

本视频演示了一种用于定量人诺如病毒类病毒颗粒（VLPs）与人肠道细菌结合的检测方法。将细菌悬液与VLPs混合并孵育，以形成VLP-细菌复合物。随后用荧光标记的VLP特异性抗体对复合物进行标记，再通过基于流式细胞术的可视化和定量分析，确定结合VLP的细菌百分比。...

一种定量检测人诺如病毒样颗粒与肠道细菌结合能力的实验方法

本文介绍了一种利用水牛绿色猴肾细胞系检测可培养病毒总量的方法。该方法为检测环境水和饮用水中感染性病毒的存在情况提供了一种标准化的工具。...

EPA 方法 1615：通过培养法和反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测水中肠道病毒和诺如病毒的存在。第二部分：总可培养病毒检测

本文介绍了一种利用反转录-定量PCR方法对环境水和饮用水中肠道病毒和诺如病毒进行定量的实验流程。采用美国环境保护署方法1615（EPA Method...

EPA 方法 1615. 通过培养法和反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测水中肠道病毒和诺如病毒的存在情况。第三部分：通过 RT-qPCR 检测病毒

我们介绍一种实验方案，描述了通过流式细胞术半定量检测甲型流感病毒与A549细胞的结合以及病毒颗粒向靶细胞内吞作用的方法。...

通过流式细胞术测定甲型流感病毒在A549细胞中的吸附与内化

在此，我们介绍一种用于表达和纯化高质量诺如病毒凸起（P）结构域的方法 E. coli 用于X射线晶体学研究。该方法可应用于其他杯状病毒P结构域以及非结构蛋白。...

人诺如病毒突出域的制备 E. coli 用于X射线晶体学

利用与识别表面抗原的抗体偶联的15...

利用流式病毒术分析病毒颗粒与细胞外囊泡的抗原谱

开发并评估了一种基于大泡沫材料的采样方法，用于检测和定量环境硬质表面上的诺如病毒。...

表面人诺如病毒检测的拭子采样方法

利用病毒基因组扩增的常规检测方法受限于无法区分具有感染性与非感染性的病毒颗粒。本文旨在提供详细的实验方案，介绍利用适配体结合、动态光散射和透射电子显微镜等替代方法，以辅助区分具有感染性的诺如病毒颗粒。...

替代方法 体外 病毒衣壳结构完整性的测定方法

了解如何使用流式细胞术量化人类诺如病毒样颗粒与革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的结合。该方法无需活病毒即可研究病毒与细菌的相互作用，适用于评估共生细菌如何影响病毒感染机制。

利用流式细胞术定量人诺如病毒样颗粒与共生细菌的结合

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