利用宿主范围与可视化筛选快速无缝构建重组痘病毒

本方法利用宿主范围选择和荧光标记，在多种细胞类型中高效且无缝地生成重组痘苗病毒。该技术结合了同源重组的快速性与瞬时显性选择无痕性的特点。此外，我们采用宿主范围选择以消除化学诱导变异的可能性。该方法还可用于改造痘苗病毒或其他痘病毒以表达外源基因，例如用于疫苗的制备。如果仅使用荧光筛选进行本实验，则必须确保筛选足够数量的病毒，以便在无PKR选择性压力的情况下检测到相对稀有的重组子。本方法依赖于荧光标记的获得与丢失，从而成功筛选出获得重组盒的病毒，并检测出无痕重组的病毒。

为构建重组载体，首先在每个PCR管中加入17微升无DNase水、每种引物各1.2微升、5微升5x PCR反应缓冲液、模板DNA以及0.5微升DNA聚合酶。再加入额外的无DNase水，使每管终体积达到50微升，并将各管放入热循环仪中。

使用三步法PCR程序前，先将DNA在98摄氏度下变性30秒，共进行25个循环，具体条件如所示。为在1%琼脂糖凝胶上观察扩增产物，向每个加样孔中加入10微升DNA产物和2微升上样缓冲液。以每厘米8伏的电压电泳运行1小时。

实验结束后，根据制造商的说明书使用DNA凝胶回收试剂盒对每个扩增产物进行凝胶纯化。用50微升无DNase的水从柱子中洗脱扩增产物，并立即进行离心。为线性化克隆载体，首先在离心管中加入1微克载体、17微升无DNase的水、2微升反应缓冲液和1微升EcoRI，于37摄氏度孵育1小时。

孵育结束后，向每个分离的扩增产物中加入0.2皮摩尔的线性化载体、10微升无DNase的水和10微升DNA组装主混合液。将样品在50摄氏度下孵育1小时。孵育结束后，按照标准操作流程，用2微升组装产物转化感受态E.coli。

将100微升转化后的细胞涂布于添加了100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂平板上。在37摄氏度过夜培养后，挑选分离良好的单菌落，接种于含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37摄氏度、225转/分钟条件下过夜培养。

第二天早上，使用质粒小量提取试剂盒分离质粒，并在分光光度计上检测DNA的浓度和纯度。

用于重组病毒的制备，将适量细胞以融合单层的形式接种于6孔板中，并以感染复数为1的病毒进行感染。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。孵育结束后，吸去各孔上清液，更换为新鲜DMEM培养基，并根据生产商说明书，使用 commercially available transfection reagent 向每孔加入3微克目标重组载体。将培养板置于培养箱中继续孵育48小时，随后将每种转染条件下的细胞分别收集至1.5毫升离心管中。对收集的细胞进行三次冻融处理，然后将所得裂解物在50%振幅下超声处理15秒。接着，将超声处理后的裂解物用新鲜DMEM进行连续10倍梯度稀释，稀释范围从10¹至10⁶，每种稀释液各取1毫升分别加入蛋白激酶R功能完整的细胞系的融合单层孔中。将细胞在细胞培养箱中孵育1小时后，吸去上清液并更换为新鲜培养基，再将细胞放回细胞培养箱中继续培养。 关键词：重组病毒，感染复数，DMEM，转染试剂，重组载体，冻融，超声处理，梯度稀释，蛋白激酶R

接种后24至48小时，通过荧光显微镜鉴定重组病毒。重组病毒形成的空斑因整合了mCherry-E3L融合基因而呈现红色荧光。在野生型RK13细胞上对重组病毒进行三次空斑纯化。经过三轮空斑纯化后，用空斑裂解液的系列稀释液感染RK13+E3L+K3L细胞。使用配备GFP和RFP滤光片的合适成像系统，通过荧光显微镜鉴定发生坍塌的病毒。随后，在RK13+E3L+K3L细胞上对仅呈绿色的VC-R4或无色的E3L空斑进行三次空斑纯化，确保没有任何空斑发出红色荧光。

用至少100个噬菌斑形成单位感染细胞，以提高识别无色噬菌斑的几率。在极少数情况下，可能需要进行多轮感染。

在蛋白激酶R功能完整的RK13细胞中，红色荧光斑块表明mCherry-E3L病毒的表达；而在RK13+E3L+K3L细胞中，无色斑块或仅表达eGFP的斑块则证实mCherry-E3L筛选标记已失效。

重组病毒VC-R4缺失了两种蛋白激酶R拮抗剂，因此无法在具有蛋白激酶R功能的RK13细胞中复制，而亲本病毒vP872表达E3L，具备复制能力。为了证实VC-R4在RK13细胞中无法复制的现象仅由E3L缺失所致，采用相同的筛选方案，将VC-R4病毒中的增强型绿色荧光蛋白（enhanced GFP）替换为E3L，从而构建出相应的病毒。

有趣的是，在构建该病毒的过程中，在RK13+E3L+K3L细胞中尚未进行筛选时，就已观察到无色噬斑，表明mCherry-E3L筛选标记发生丢失；而通常需要在RK13+E3L+K3L细胞中进行筛选才能获得无痕重组病毒。这一现象很可能是因为mCherry-E3L重组盒与插入VC-R4的E3L基因之间具有较长的序列同源性所致。平均而言，约有12.6%的子代病毒粒子与转染的质粒发生了重组，该频率与此前报道的结果相似。

此处显示了RK13+E3L+K3L细胞中无色噬斑占总噬斑的相对频率，表明mCherry-E3L筛选标记丢失及发生塌缩的频率约为1.8%。

第一阶段使用PKR感受态细胞可确保所有噬斑均含有重组病毒。第二阶段使用PKR缺陷型细胞则能够检测到mCherry-E3L基因座发生塌陷的重组病毒。

该方法使我们能够快速生成携带外源基因的病毒，例如，通过表达不同的病毒PKR拮抗剂，以促进分析这些病毒与来自不同宿主的PKR之间的物种特异性相互作用，可用于疫苗生产。