Name: 使用主机范围和视觉选择快速、无缝地生成重组痘病毒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学习利用宿主范围选择和荧光标记快速生成无疤痕重组痘病毒的方法。该技术结合同源重组与瞬时显性筛选，可在多种细胞类型中高效修饰病毒基因组，适用于疫苗开发与基因表达研究。

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该项目由美国国立卫生研究院（AI114851）资助给SR。

1. 构建重组载体
<ol>
	<li>设计引物以生成筛选盒。使用任意一种在线引物设计工具，为每个独立扩增片段设计与相邻扩增片段及载体具有重叠序列的引物，以促进DNA分子的等温酶促连接（也称为Gibson连接）。 
	注意：本实验方案也可使用传统的限制性内切酶克隆方法完成。若采用此方法，则应设计带有相应限制性酶切位点的引物，而非具有重叠序列的引物。</li>
	<li>使用步骤1.1中设计的引物，按从5’到3’的顺序依次PCR扩增以下元件（图1）：约500个核苷酸的VACV基因组E3L基因上游区域（5’臂）、EGFP或目的基因、约150个核苷酸的紧邻VACV基因组E3L基因下游的区域（短3’臂）、一段合成的痘病毒早期/晚期启动子25、mCherry-E3L融合基因，以及包含短3’臂在内的约500个核苷酸的VACV基因组E3L下游区域（长3’臂）。
	<ol>
		<li>在PCR管中，按以下顺序为每个扩增片段加入试剂：17 μL无DNase水，每种引物各1.2 µL（初始浓度=10 μM，终浓度=0.5 μM），5 µL 5x PCR反应缓冲液，模板DNA（从质粒扩增的片段：EGFP和E/L启动子-mCherry-E3L盒，使用10 ng；从病毒基因组DNA扩增的片段：5’和3’臂，使用100 ng），以及0.5 µL DNA聚合酶。调整所加水量，使最终反应体积为50 μL。 
		注意：模板DNA的浓度应通过实验确定，但我们通常起始使用10 ng/反应。</li>
		<li>将管子放入热循环仪中，在98 °C变性30秒，然后进行25轮三步PCR程序：98 °C变性5秒，55 °C退火10秒，72 °C延伸1分钟。 
		注意：根据每对引物的制造商推荐Tm值确定退火温度。根据每个扩增片段的长度确定合适的延伸时间（1分钟/kb）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增产物。向每个加样孔中加入10 μL DNA产物和2 μL上样缓冲液，在8 V/cm条件下电泳1小时。</li>
	<li>使用DNA凝胶回收试剂盒及说明书中的操作流程对每个扩增片段进行凝胶纯化。通过向柱中加入50 μL无DNase水并立即离心，洗脱回收的扩增片段。</li>
	<li>使用EcoRI内切酶消化线性化pUC19克隆载体。向一个离心管中加入1 μg pUC19、加水至17 μL、2 μL反应缓冲液和1 μL（20单位）EcoRI。在37 °C孵育1小时。
	<ol>
		<li>在1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增产物，电压为8 V/cm，电泳1小时。从凝胶中切下目标条带，并按照步骤1.4所述方法使用DNA凝胶回收试剂盒纯化产物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用主混合试剂盒将所有经凝胶纯化的独立扩增片段与线性化载体进行连接。
	<ol>
		<li>在PCR管中加入0.2 pmol线性化pUC19和每个扩增片段（5’臂、EGFP、短3’臂、E/L启动子-mCherry-E3L盒、3’臂）。加入无DNase水至终体积为10 μL，然后加入10 μL DNA连接主混合液。将样品在50 °C孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照先前描述的方法26,27，用2 μL步骤1.6中组装的产物转化感受态E. coli。取100 μL转化后的菌液涂布于含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上。在37 °C过夜培养。</li>
	<li>挑取分离良好的单菌落，将单个菌落转移至含有含100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基的离心管中。在37 °C、225 rpm振荡条件下过夜培养。</li>
	<li>使用质粒小提试剂盒从过夜培养物中提取质粒DNA。使用分光光度计检测DNA的浓度和纯度。A260/A280比值在1.8至2.0之间为可接受范围。</li>
	<li>将质粒送交进行Sanger测序，以确认所获得的克隆产物是否正确。将DNA在-20 °C保存。</li>
</ol>
2. 重组病毒的制备
<ol>
	<li>在6孔板中，以感染复数为1.0（MOI = 1.0）的条件，用待重组病毒感染生长至融合单层的适宜细胞。将感染后的细胞置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。2 孵育1小时。然后吸除培养基，更换为新鲜DMEM。将感染的细胞在37 °C、5% CO₂条件下继续培养。2. 
	注意：对于具有复制能力的病毒，例如缺失 K3L 的痘苗病毒22，可选用欧洲兔肾细胞系RK13（ATCC #CCL-37）或BSC-40细胞系。然而，对于复制缺陷型病毒，例如本文所述缺失PKR拮抗因子E3L和K3L双基因的病毒，则需使用能够表达这两个基因的互补细胞系 转 或需要PKR敲低或敲除的细胞。</li>
	<li>使用商品化的转染试剂，按照生产商说明书将500 ng在步骤1.10中构建并验证的载体转染至感染的细胞中。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养。2 48小时。 
	注意：如果使用缺失 E3L 和 K3L 的痘苗病毒，PKR 介导的选择压力将促进重组病毒的筛选，并维持这些细胞中 mCherry-E3L 融合蛋白的表达。如有需要，也可仅对插入片段进行 PCR 扩增，用于转染，而非使用完整质粒。</li>
	<li>感染后48小时，收集感染的单层细胞。某些情况下可通过移液收集细胞，若细胞仍紧密贴壁，则使用细胞刮刀收集。将细胞反复冻融三次，随后以50%的振幅超声处理裂解液15秒。将裂解液储存于-80 °C，待用时取出。</li>
	<li>将步骤 2.3 中收获的裂解液进行10倍系列稀释，从10⁻¹开始-1 至 10-6 通过将120 μL裂解液加入1080 μL DMEM（10）-1），然后将120 μL该稀释液加入1080 μL DMEM中（10-2），并重复此过程四次。将每种稀释液各1 mL分别加入含有PKR感受态细胞系（此处为RK13细胞）的汇合单层细胞孔中。
	<ol>
		<li>将感染的细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育2 孵育1小时。然后吸除培养基，更换为新鲜DMEM。将感染的细胞在37 °C、5% CO₂条件下继续培养。2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染后24至48小时，通过荧光显微镜鉴定重组病毒。重组病毒形成的空斑因整合了mCherry-E3L融合基因而表达红色荧光。图2）。如果最初使用的病毒不含PKR抑制剂，则所有噬斑都将含有重组病毒。</li>
	<li>在RK13细胞上对重组病毒进行三次噬斑纯化。经过最后一轮噬斑纯化后，所有噬斑均应表达红色荧光。</li>
	<li>感染表达VACV PKR抑制剂E3L和K3L的汇合状兔肾细胞（RK13+E3L+K3L细胞）6孔板28用第2.6步中纯化的红色荧光病毒接种，每孔约50-100个噬斑。 
	注意：这些细胞可反式提供VACV PKR拮抗因子，缓解由PKR介导的选择性压力，从而维持mCherry-E3L融合基因的稳定性，促进重组病毒的“无痕”生成。</li>
	<li>使用 EVOS2 显微镜，结合 GFP 滤光立方体（激发：470/22，发射：525/50）和 RFP 滤光立方体（激发：531/40，发射：593/40），通过荧光显微镜鉴定塌陷的病毒。 
	注意：mCherry-E3L 融合基因的丢失频率约为 2.5%（表 2若未将EGFP作为标记基因，那么丢失mCherry-E3L融合基因的突变病毒所形成的噬斑将无色。</li>
	<li>在 RK13+E3L+K3L 细胞上对仅呈绿色的斑块（VC-R4）或无色斑块（E3L）进行三次空斑纯化，确保没有任何斑块发出红色荧光。</li>
	<li>通过PCR和Sanger测序确认mCherry-E3L的缺失及预期突变的存在。 
	注意：如果目标基因或突变不具备PKR抑制活性，则必须在RK13+E3L+K3L细胞或具有等效PKR抑制或PKR缺陷的细胞系中培养重组病毒图3).</li>
</ol>

<ol><li>Brochier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+eradication+of+rabies+using+recombinant+vaccinia-rabies+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine.</a> Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).</li>
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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本文介绍了一种瞬时标记选择策略的改进方法32，用于构建不含外源DNA的重组痘苗病毒。该策略利用宿主抗病毒蛋白PKR介导的选择压力，而非抗生素等其他形式的选择压力。使用宿主抗病毒基因可避免药物诱导的细胞表型改变，或因筛选药物导致突变风险增加的问题。此外，与药物筛选不同，本方法不存在滞后阶段，因为PKR在所有细胞中均组成型表达。基于mCherry表达的次级视觉筛选也提高了该方法的特异性，确保在第一轮筛选中仅挑选表达外源基因的噬斑；同时，在筛选已丢失mCherry-E3L基因的成熟重组病毒时，该标记同样可高效发挥阴性选择标记的作用。
该重组策略最关键的步骤是构建合适的重组载体，以及进行适当的噬斑纯化，以确保所选病毒为克隆来源。本文建议采用“Gibson 组装”法来构建重组载体。该方法效率极高，可在一天内完成重组载体所有片段的组装。然而，由于短3’臂与长3’臂具有相同的序列，这些片段在克隆反应过程中可能相互连接，导致部分载体中缺失mCherry-E3L表达盒。根据我们的经验，这种情况较为罕见，但在克隆后确认载体结构仍属必要。我们亦曾使用传统的...

痘苗病毒（VACV）在成功根除自然界中的人类病原体天花病毒（VARV）的过程中发挥了关键作用。自从天花病毒被消灭以来，包括痘苗病毒在内的痘病毒在人类和动物医学中持续被用作有效的治疗性病毒。例如，基于痘苗病毒的狂犬病病毒疫苗在欧洲1和美国2预防森林型狂犬病传播方面已取得显著成效。最近，表达多种抗肿瘤分子（例如单链抗体或人促红细胞生成素）的重组痘病毒作为溶瘤剂已展现出令人鼓舞的应用前景3,4,5。痘苗病毒作为载体尤其具有吸引力，因为它易于进行遗传操作，具有广泛的宿主范围，并且在多种条件下稳定性良好，便于运输并可在现场维持疫苗活性6,7。尽管已开发出多种技术用于实验室研究和疫苗制备中重组痘苗病毒的构建，但目前的病毒构建策略仍存在明显局限性。
由于VACV具有多种用途，人们已开发出多种生成重组病毒的策略。第一种策略利用同源重组，将包含目的转基因和可筛选标记基因（如抗生素抗性基因）的表达盒导入病毒基因组。该表达盒两侧各带有约500个核苷酸（nt）或更长的同源臂，可引导基因插入病毒基因组的特定位点，并通过双交换事件实现稳定整合8,9,10。该策略快速且高效；然而，其结果会在病毒基因组中残留标记基因等额外遗传物质，可能产生意想不到的影响。此外，由于可用的独特筛选标记数量有限，该方法在可引入的转基因数量上存在实际的上限。瞬时显性筛选（TDS）策略通过促进生成&#34;无痕&#34;重组病毒，解决了这一问题11。在该策略中，含有突变VACV基因和可筛选标记基因的质粒被整合到病毒基因组中，但无需额外的侧翼VACV DNA序列。该方法通过单次交换事件实现整个质粒的瞬时整合，并导致VACV基因发生重复。该中间产物在持续施加筛选压力的条件下保持稳定，从而可富集该结构。当撤去筛选压力后，VACV基因的重复序列可介导第二次交换事件，导致质粒被清除，并以大约50:50的比例生成野生型（wt）或重组病毒。尽管TDS无需稳定插入外源DNA即可产生重组病毒，但仍需通过测序分析对多个病毒克隆进行筛选，以鉴定出具有预期突变的克隆，这一步骤可能耗时且成本较高。
本文介绍一种结合了上述各种方法优点的重组痘病毒构建策略，该策略类似于此前报道的用于复制缺陷型改良安卡拉痘苗病毒（modified vaccinia Ankara）的方法12,13,14。该策略结合了可视化筛选与宿主范围选择，通过双交换事件快速获得重组病毒，随后利用同源重组去除可筛选标记基因。该方法能够在实现同源重组介导的突变体快速构建的同时，兼具TDS方法&#34;无痕&#34;的特点，且无需额外的筛选步骤来区分野生型与突变型病毒。本方法采用宿主范围选择替代抗生素筛选，避免了化学试剂可能引起的细胞系表型改变。在本策略中，我们选用宿主抗病毒蛋白激酶R（PKR）作为筛选因子以构建重组VACV。PKR在多数细胞类型中以无活性的单体形式表达15。当其N端的双链RNA（dsRNA）结合域与双链RNA（dsRNA）结合后，PKR发生二聚化并发生自磷酸化16。活化的PKR可磷酸化真核翻译起始因子2（eIF2）的α亚基，最终抑制起始甲硫氨酰-tRNA向核糖体的递送，从而阻断细胞内蛋白质翻译，并广泛抑制多种病毒科的复制17,18。
针对PKR广泛而强大的抗病毒活性，许多病毒已进化出至少一种策略以阻止PKR的激活。大多数痘病毒表达两种PKR拮抗蛋白，分别由VACV中的E3L和K3L基因编码，这两种蛋白通过两种不同的机制抑制PKR19。E3通过结合双链RNA来阻止PKR的同源二聚化20,21，而K3则作为假底物抑制剂，直接结合活化的PKR，从而阻断其与底物eIF2α的相互作用22。重要的是，这两种PKR拮抗蛋白并不一定能够抑制来自所有物种的PKR。例如，绵羊痘病毒的K3同源蛋白能强烈抑制绵羊的PKR，而绵羊痘病毒的E3同源蛋白则未表现出显著的PKR抑制作用23,24。在本研究中，我们介绍了一种方法，利用PKR介导的选择性压力结合荧光筛选，构建一种E3L和K3L基因缺失的VACV重组病毒（VC-R4），该病毒无法在具有功能性PKR的多种物种来源的细胞中复制。这种重组病毒为快速构建在天然E3L启动子调控下表达外源基因的重组病毒提供了优良的遗传背景。

<table><tbody><tr><td>2X-Q5预混液</td><td>NEB</td><td>M0492L</td><td>PCR中使用的高保真聚合酶</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11593027</td><td>细菌筛选剂</td></tr><tr><td>一次性细胞刮刀</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-100-242</td><td>用于收集感染细胞的细胞刮刀</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto 2细胞成像系统</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMAFD2000</td><td>荧光显微镜</td></tr><tr><td>EVOS光源立方体，GFP</td><td>ThermoFisher</td><td>AMEP4651</td><td>GFP立方体</td></tr><tr><td>EVOS光源立方体，RFP</td><td>ThermoFisher</td><td>AMEP4652</td><td>RFP立方体</td></tr><tr><td>GenJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100489</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>LB（Luria Bertani）肉汤</td><td>Gibco</td><td>10855021</td><td>细菌培养基</td></tr><tr><td>Monarch DNA凝胶回收试剂盒</td><td>NEB</td><td>T1020L</td><td>用于纯化扩增子和线性化载体的凝胶纯化试剂盒</td></tr><tr><td>Monarch质粒小提试剂盒</td><td>NEB</td><td>T1010L</td><td>用于质粒纯化的小提试剂盒</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td>用于测定RNA和DNA浓度的分光光度计</td></tr><tr><td>NEBuilder预混液</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td>用于构建重组载体的等温酶促连接试剂盒</td></tr><tr><td>Q500超声破碎仪</td><td>Qsonica</td><td>Q500-110</td><td>用于病毒裂解物的超声处理</td></tr><tr><td>RK13细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-37</td><td>兔肾细胞</td></tr><tr><td>VWR多孔细胞培养板</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>细胞培养板</td></tr></tbody></table>

利用宿主范围与可视化筛选快速无缝构建重组痘病毒

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

痘苗病毒（VACV）在根除自然界中的天花病毒（VARV，即天花的致病因子）方面发挥了关键作用。自首次被用作疫苗以来，VACV 已被开发为治疗性疫苗的载体以及溶瘤病毒。这些应用利用了 VACV 基因组易于操作和宿主范围广泛的优势，使其成为构建具有多种治疗用途的重组病毒的优秀平台。目前已开发出多种生成重组 VACV 的方法，包括标记物筛选法和瞬时显性筛选法。本文介绍了一种宿主范围筛选法的优化方案，并结合重组病毒的可视化鉴定。该方法利用宿主抗病毒蛋白激酶 R（PKR）所产生的选择压力，以及表达与 mCherry 融合标签的 E3L 蛋白（VACV 的两种 PKR 拮抗蛋白之一）的荧光融合基因。该表达盒包含目的基因和 mCherry-E3L 融合基因，两侧为来源于 VACV 基因组的序列。在目的基因与 mCherry-E3L 之间设有一个较小区域，其序列与 3’ 臂的前约 150 个核苷酸相同，以促进同源重组并在筛选后丢失 mCherry-E3L 基因。我们证明，该方法可在多种细胞类型中高效、无缝地生成重组 VACV，且无需药物筛选或对突变病毒进行大量筛选。

我们采用 图1 所示的流程，通过在已缺失 K3L 的病毒（vP872）中将 E3L 替换为 EGFP，构建了一种缺失两种 PKR 拮抗剂 E3L 和 K3L 的 VACV。 图2 显示，在 PKR 功能完整的 RK13 细胞中出现红色荧光蚀斑，表明病毒表达了 mCherry-E3L；同时，在 RK13+E3L+K3L 细胞中观察到 EGFP 的表达，证实了 E3L 的缺失以及 mCherry-E3L 筛选标记的丢失。 图3 进一步证实，这种缺失两种 PKR 拮抗剂的重组病毒 VC-R4 无法在 PKR 功能完整的 RK13 细胞中复制，而表达 E3L 的亲本病毒 vP872 则具有复制能力。为了确认该病毒在 RK13 细胞中复制失败的原因仅在于 E3L 的缺失，我们利用相同的筛选流程，将 VC-R4 中的 EGFP 替换回 E3L，从而构建了回复突变病毒。 图3 同时验证了该回复突变病毒在 RK13 ...

本方法利用宿主范围选择及重组病毒的可视化鉴定，实现“无痕”重组痘苗病毒的构建。

痘苗病毒（VACV）在根除天花的病原体——天花病毒（VARV）的过程中发挥了关键作用。自首次被用作……

本方法利用宿主范围选择和荧光标记，在多种细胞类型中高效且无缝地生成重组痘苗病毒。该技术结合了同源重组的快速性与瞬时显性选择无痕性的特点。此外，我们采用宿主范围选择以消除化学诱导变异的可能性。该方法还可用于改造痘苗病毒或其他痘病毒以表达外源基因，例如用于疫苗的制备。如果仅使用荧光筛选进行本实验，则必须确保筛选足够数量的病毒，以便在无PKR选择性压力的情况下检测到相对稀有的重组子。本方法依赖于荧光标记的获得与丢失，从而成功筛选出获得重组盒的病毒，并检测出无痕重组的病毒。为构建重组载体，首先在每个PCR管中加入17微升无DNase水、每种引物各1.2微升、5微升5x PCR反应缓冲液、模板DNA以及0.5微升DNA聚合酶。再加入额外的无DNase水，使每管终体积达到50微升，并将各管放入热循环仪中。 使用三步法PCR程序前，先将DNA在98摄氏度下变性30秒，共进行25个循环，具体条件如所示。为在1%琼脂糖凝胶上观察扩增产物，向每个加样孔中加入10微升DNA产物和2微升上样缓冲液。以每厘米8伏的电压电泳运行1小时。实验结束后，根据制造商的说明书使用DNA凝胶回收试剂盒对每个扩增产物进行凝胶纯化。用50微升无DNase的水从柱子中洗脱扩增产物，并立即进行离心。为线性化克隆载体，首先在离心管中加入1微克载体、17微升无DNase的水、2微升反应缓冲液和1微升EcoRI，于37摄氏度孵育1小时。孵育结束后，向每个分离的扩增产物中加入0.2皮摩尔的线性化载体、10微升无DNase的水和10微升DNA组装主混合液。将样品在50摄氏度下孵育1小时。孵育结束后，按照标准操作流程，用2微升组装产物转化感受态E.coli。将100微升转化后的细胞涂布于添加了100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂平板上。在37摄氏度过夜培养后，挑选分离良好的单菌落，接种于含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37摄氏度、225转/分钟条件下过夜培养。 第二天早上，使用质粒小量提取试剂盒分离质粒，并在分光光度计上检测DNA的浓度和纯度。 用于重组病毒的制备，将适量细胞以融合单层的形式接种于6孔板中，并以感染复数为1的病毒进行感染。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。孵育结束后，吸去各孔上清液，更换为新鲜DMEM培养基，并根据生产商说明书，使用 commercially available transfection reagent 向每孔加入3微克目标重组载体。将培养板置于培养箱中继续孵育48小时，随后将每种转染条件下的细胞分别收集至1.5毫升离心管中。对收集的细胞进行三次冻融处理，然后将所得裂解物在50%振幅下超声处理15秒。接着，将超声处理后的裂解物用新鲜DMEM进行连续10倍梯度稀释，稀释范围从10¹至10⁶，每种稀释液各取1毫升分别加入蛋白激酶R功能完整的细胞系的融合单层孔中。将细胞在细胞培养箱中孵育1小时后，吸去上清液并更换为新鲜培养基，再将细胞放回细胞培养箱中继续培养。

关键词：重组病毒，感染复数，DMEM，转染试剂，重组载体，冻融，超声处理，梯度稀释，蛋白激酶R 接种后24至48小时，通过荧光显微镜鉴定重组病毒。重组病毒形成的空斑因整合了mCherry-E3L融合基因而呈现红色荧光。在野生型RK13细胞上对重组病毒进行三次空斑纯化。经过三轮空斑纯化后，用空斑裂解液的系列稀释液感染RK13+E3L+K3L细胞。使用配备GFP和RFP滤光片的合适成像系统，通过荧光显微镜鉴定发生坍塌的病毒。随后，在RK13+E3L+K3L细胞上对仅呈绿色的VC-R4或无色的E3L空斑进行三次空斑纯化，确保没有任何空斑发出红色荧光。用至少100个噬菌斑形成单位感染细胞，以提高识别无色噬菌斑的几率。在极少数情况下，可能需要进行多轮感染。 在蛋白激酶R功能完整的RK13细胞中，红色荧光斑块表明mCherry-E3L病毒的表达；而在RK13+E3L+K3L细胞中，无色斑块或仅表达eGFP的斑块则证实mCherry-E3L筛选标记已失效。重组病毒VC-R4缺失了两种蛋白激酶R拮抗剂，因此无法在具有蛋白激酶R功能的RK13细胞中复制，而亲本病毒vP872表达E3L，具备复制能力。为了证实VC-R4在RK13细胞中无法复制的现象仅由E3L缺失所致，采用相同的筛选方案，将VC-R4病毒中的增强型绿色荧光蛋白（enhanced GFP）替换为E3L，从而构建出相应的病毒。有趣的是，在构建该病毒的过程中，在RK13+E3L+K3L细胞中尚未进行筛选时，就已观察到无色噬斑，表明mCherry-E3L筛选标记发生丢失；而通常需要在RK13+E3L+K3L细胞中进行筛选才能获得无痕重组病毒。这一现象很可能是因为mCherry-E3L重组盒与插入VC-R4的E3L基因之间具有较长的序列同源性所致。平均而言，约有12.6%的子代病毒粒子与转染的质粒发生了重组，该频率与此前报道的结果相似。此处显示了RK13+E3L+K3L细胞中无色噬斑占总噬斑的相对频率，表明mCherry-E3L筛选标记丢失及发生塌缩的频率约为1.8%。第一阶段使用PKR感受态细胞可确保所有噬斑均含有重组病毒。第二阶段使用PKR缺陷型细胞则能够检测到mCherry-E3L基因座发生塌陷的重组病毒。该方法使我们能够快速生成携带外源基因的病毒，例如，通过表达不同的病毒PKR拮抗剂，以促进分析这些病毒与来自不同宿主的PKR之间的物种特异性相互作用，可用于疫苗生产。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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用于裂谷热病毒 MP-12 疫苗株的反向遗传学系统是构建具有增强减毒性和免疫原性的新型 MP-12 突变株的有效工具。本文描述了生成和鉴定 NSs...

利用反向遗传学改造裂谷热病毒MP-12株的NSs基因以提高疫苗的安全性和有效性

本文介绍一种仅基于细胞感染的实验方案，与现有其他方案相比，该方案可将重组细小病毒的生产效率提高100倍以上。本方案依赖于使用一种新型的基于腺病毒5型的辅助病毒，该辅助病毒含有细小病毒VP转录单元（Ad-VP）。...

利用腺病毒衍生系统高效生产重组细小病毒

一种快速且模块化的方案，用于生成表达荧光蛋白的重组痘苗病毒 此处描述了使用瞬时显性选择方法同时标记蛋白质的技术。...

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我们描述了一种荧光报告型痘苗病毒的使用方法，该病毒可通过光谱上可区分的报告荧光蛋白的时相特异性表达，实现对病毒感染性和基因表达的实时检测。我们详细介绍了一种基于孔板的方法，用于精确定位小分子抑制剂作用下病毒复制受干扰的具体阶段。...

用于量化基因表达各阶段病毒功能的痘苗病毒报告病毒

痘苗病毒（VV）已广泛应用于生物医学研究及人类健康改善。本文介绍一种利用CRISPR-Cas9系统对VV基因组进行编辑的简单且高效的方法。...

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我们介绍了一种用于产生和扩增基因修饰的呼吸道合胞病毒（RSV）的方法，以及一种优化的RSV蚀斑检测法。我们通过构建两种重组病毒来演示该方案，这两种病毒分别可用于定量检测RSV的复制以及活体分析RSV包涵体及其相关颗粒的动态过程。...

重组呼吸道合胞病毒的制备、扩增与滴定

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本文介绍了一种通过在插入片段的3'端引入合适的限制性酶切位点，获得pVAX1-PRRSV表达载体的实验方案。我们可将载体线性化，并通过同源重组技术将DNA片段逐个连接至该载体。...

一种无缝克隆方法用于构建猪繁殖与呼吸综合征病毒表达载体

从质粒DNA中拯救甲型流感病毒是一项基础且关键的实验技术，该技术可使流感研究人员能够构建重组病毒，用于研究流感病毒生物学的多个方面，并可作为潜在的载体或疫苗使用。...

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