实验性自身免疫性脑脊髓炎期间中枢神经系统淋巴细胞浸润的流式细胞术分析

本文所介绍的方案将有助于我们理解淋巴细胞在中枢神经系统自身免疫性疾病发展过程中的作用。通过该方法，可对脑内的淋巴ocytes进行单细胞水平的研究。该方案还可应用于其他模型及需要分析免疫细胞特性与功能的中枢神经系统疾病。

在本视频中，该方案可轻松演示如何诱导模型并分离脑内的单个细胞。在确认小鼠对足底反射无反应后，使用1毫升注射器，在靠近颈部的背部两个不同位置，将100微克乳化MOG 35-55溶于100微升完全弗氏佐剂中，皮下注射至麻醉的C57BL/6小鼠体内。在免疫当天以及免疫后第2天，向小鼠腹腔注射200微升浓度为1纳克/微升的百日咳毒素工作液。

第二次注射后，将小鼠放回带有加热垫的饲养笼中，并持续监测直至完全恢复卧位。次日及疾病发展过程中，以盲法对所有小鼠进行检查，并根据表格中列出的神经学症状以及体重变化情况进行评分。在适当的实验终点，小心地从鼻部向颈部剪开颅骨，将每只动物的脑组织从颅腔中取出，分别放入含有10毫升RPMI培养基的50毫升离心管中。

充分混匀各管，以去除贴壁的红细胞，然后用抽吸法移除培养基。向每根试管中加入10毫升新鲜培养基，并将脑组织分别转移至6个100毫米的培养皿中。最后用剃刀将每个脑组织切碎，使用塑料移液管每次从一个培养皿中尽可能转移组织及6毫升培养基至预冷的7毫升玻璃匀浆器中。

先使用研杵的松动活塞研磨脑组织，再使用紧密活塞继续研磨，直至组织悬液呈均匀状态。随后，将所得组织匀浆倒入预冷的15毫升锥形管中，并置于冰上。待所有样品均完成匀浆后，用新鲜培养基将每管体积调整至7毫升，然后将每份组织悬液加入新的预冷15毫升离心管中，每管预先加入3毫升100%基底膜基质。

轻轻颠倒混匀数次，用三毫升移液器小心缓慢地向每份组织溶液样品下方加入一毫升70%密度梯度溶液。通过密度梯度离心法分离细胞，几乎完全去除上层液体，注意彻底清除所有髓鞘成分。将界面层转移至新的15毫升离心管中，并用新鲜培养基调整体积至10毫升。

然后再次离心样品，并弃去上清液，再将沉淀重悬于每管约100 µL培养基中。对于收获的脑细胞进行流式细胞术分析时，将约2×10⁶个细胞加入100 µL培养基中，分别分配至96孔板的各个孔中。当所有细胞接种完毕后，在各孔中加入100 µL 500倍浓缩的细胞刺激混合液以及蛋白转运抑制剂，然后将该板放入细胞培养孵箱中孵育4小时。

孵育结束后，通过离心收集各孔底部的细胞，并将沉淀重悬于每孔100 µL流式细胞术缓冲液中。染色前，加入3 µL抗小鼠CD16/CD32 Fc阻断剂，在4°C预孵育10分钟，以阻断任何非特异性的Fc介导相互作用。

孵育结束后，向每孔加入目标抗体混合物，将培养板置于4摄氏度避光环境中。30分钟后，每孔加入100微升流式细胞术缓冲液洗涤细胞，并通过离心沉淀细胞。弃去上清液后，每孔加入200微升细胞内固定缓冲液。

在室温下孵育30至60分钟后，通过离心收集样品，并将沉淀重悬于每孔200微升的1×通透缓冲液中。再次离心样品，弃去上清液后，用100微升新鲜的通透缓冲液重悬沉淀。接着，加入针对目标细胞内抗原的适当抗体，在4摄氏度避光孵育30分钟。

孵育结束后，向每孔加入 100 µL 1× 透化缓冲液，通过离心沉淀样品。然后将染色细胞重悬于 200 µL 流式细胞术染色缓冲液中，并根据标准方案通过流式细胞术分析细胞。典型的 EAE 临床病程应产生如图所示的疾病曲线及体重变化。

接种MOG 35-55的C57BL/6小鼠通常在第10至12天开始出现疾病症状，并在第15至21天达到疾病高峰。在疾病发作前，免疫小鼠的体重逐渐增加，随后随着疾病症状的加重而下降。小鼠在EAE疾病高峰期体重最低，随着临床症状减轻，体重略有恢复。然而，小鼠通常无法完全恢复，往往进一步发展为单相慢性疾病病理状态。

如该代表性流式分析所示，EAE小鼠中产生干扰素γ的Th1细胞和产生IL-17的Th17细胞显著增加。最关键的步骤是3.10。操作者应转移中间层，并小心地尽量少带其他层。

按照本方案，我们可以进一步分离T淋巴细胞，用于后续转录分析以开展研究