Name: 马铃薯病毒基于马铃薯的X型微RNA沉默（VbMS）。 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: 了解利用马铃薯X病毒载体进行病毒介导的microRNA沉默技术，无需稳定转化即可快速高效地研究植物内源miRNA功能，适用于二倍体和四倍体马铃薯品种。

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感谢清华大学的 Yule Liu 博士提供 PVX-LIC 载体。本工作由德克萨斯农工大学农业生命研究机构（Texas A&amp;#38;M AgriLife Research）的启动资金以及美国农业部国家食品与农业研究所（USDA National Institute of Food and Agriculture）哈奇项目（Hatch Project TEX0-1-9675）对 JS 的资助支持。

1. 培养马铃薯植株。
<ol>
	<li>在含MS培养基（Murashige和Skoog培养基）的培养管（25 × 150 mm）中扩增马铃薯离体植株&#160;Gamborg 维生素（MS 基本盐混合物、Gamborg 维生素、30 g/L 蔗糖、3.5 g/L 琼脂，pH = 5.7）。将试管置于生长室中，温度为 20–22 &#176;C，16小时光照/8小时黑暗光周期，光照强度120 &#181;mol/m2&#8729;s1. 
	注意：新芽和根通常在1–2周内从植株中发育。每月用新鲜的MS/Gamborg维生素培养基对植株进行一次继代培养。</li>
	<li>四周后，将体外培养的植株移栽至土壤中，并在温室条件下于20–22 &#176;C，16小时光照/8小时黑暗光周期，光照强度120 &#181;mol/m2&#8729;s1. 
	注意：新长出根系和叶片的植株适合移栽。移栽后的前3–4天内需保持植株湿润。</li>
</ol>
2. 构建VbMS载体。
<ol>
	<li>设计并克隆短串联靶向模拟分子（STTM， 图1)22,53 针对目标miRNA。 
	注意：根据实验数据或从 miRbase 数据库获取 miRNA 序列54,55,56,57,58,59本研究中使用的 miR166 序列此前已有描述60.
	<ol>
		<li>通过在miRNA反向互补序列的第10位对应位置插入错配序列（通常为5’-CTA-3’），设计TM模块th–11th miRNA的核苷酸 
		注意：例如， Stu-miR160 序列是 5’-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3’61，其中 10th–11th 核苷酸以粗体显示。其反向互补序列（脱氧核苷酸）为 5’-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3’，错配凸起插入位点以粗体显示。TM 分子序列（脱氧核苷酸）应为 5’-GGCATACAGG-CTA- GAGCCAGGCA-3’</li>
		<li>设计用于克隆 STTM 片段的引物（图1使用含有48-nt间隔序列的DNA寡核苷酸作为PCR克隆的模板。上游引物包含LIC1接头（5’-CgACgACAAgACCgT-3’）、上述设计的TM分子的正向序列以及48-nt间隔序列的5’端部分序列（5’-GTTGTTGTTGTTATGGT-3’）。下游引物包含LIC2接头（5’-gAggAgAagAgCCgT-3’）、TM分子的反向互补序列以及48-nt间隔序列3’端序列的反向互补部分（5’-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3’）。 
		注意：48-nt 间隔序列是 5’-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAT-3’。例如，对于 STTM-miR160，正向引物应为 5’-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA- GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3’；反向引物应为 5’-gAggAgAagAgCCgT-TGCCTGGCTC病毒介导的 microRNA 沉默，植物功能基因组学，microRNA 靶标模拟，农杆菌浸润，PVX 载体，马铃薯，miRNA 功能研究CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3’图1).</li>
		<li>扩增STTM片段，反应体系为50 μL &#181;使用合成的48-nt通用间隔序列作为模板，通过高保真DNA聚合酶进行PCR扩增获得L。
		<ol>
			<li>通过混合 0.5 &#181;每种引物各 1 μL（40 &#181;M), 0.5 &#181;48-nt 间隔寡核苷酸的 L（40 &#181;M), 5 &#181;L 的 10x PCR 缓冲液，1 &#181;L dNTP 混合物（各 10 mM），0.1 &#181;L 高保真 DNA 聚合酶（10 U/&#181;L），以及43 &#181;L 的 ddH2O至总体积50 &#181;L. 按照以下条件进行标准PCR扩增：94 &#176;C 3分钟，32个循环：94 &#176;C，45 秒，60 &#176;C，45 秒，72 &#176;60 秒，温度为 C</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过乙醇沉淀法纯化STTM片段。向PCR产物中加入2.5倍体积的乙醇和1/10倍体积的3 M醋酸钠（pH = 4.0），充分混匀后在14,000 x g 10 分钟。移除上清液，用 1 mL 70% 乙醇冲洗沉淀。干燥沉淀后，溶于 20 &#181;L 的 ddH2O. 
		注意：使用DNA电泳检测STTM PCR产物的扩增情况。</li>
		<li>在冰上配制 T4 DNA 聚合酶反应体系，混合 2.5 &#181;L 纯化的 STTM PCR 产物，0.5 &#181;L 的 10× T4 DNA 聚合酶缓冲液，0.05 &#181;1 M 二硫苏糖醇（DTT）0.25 L &#181;L of 100 mM dATP, 0.1 &#181;L T4 DNA聚合酶（3 U/&#181;升）和1.6 &#181;L 的 ddH2O至总体积5 &#181;L. 37℃下孵育混合物 &#176;C 下 15 分钟，然后在 75 &#176;C孵育20分钟以灭活T4 DNA聚合酶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备基于PVX的VbMS载体。
	<ol>
		<li>消化 5 &#956;PVX-LIC 质粒的克数38 2.5 &#181;L of SmaI（20 U/&#181;L）体积为 100 &#181;L.</li>
		<li>加入等体积的酚:氯仿:异丙醇（25:24:1，pH = 6.7/8.0）至消化后的PVX-LIC产物中，剧烈混匀。在14,000 x g 离心10分钟，将上清液转移至新的离心管中。加入等体积的氯仿:异丙醇（24:1），剧烈涡旋振荡。在14,000 x g 10 分钟 
		注意：PVX-LIC 载体含有用于克隆的 LIC 串联表达盒。PVX-LIC 载体的 LIC 串联表达盒包含一个 ccdB 基因和氯霉素抗性基因，需在 E. coli 菌株 DB3.1，使用含卡那霉素（50 &#956;克/升）和氯霉素（15 &#956;g/L</li>
		<li>将上清液转移至新的离心管中。加入2.5倍体积的乙醇和1/10倍体积的3 M醋酸钠（pH = 4.0），剧烈混匀。在14,000 x g 10 分钟后离心并弃去上清液。</li>
		<li>用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀，并剧烈涡旋振荡。在14,000 x g 10 分钟，弃去上清液。干燥沉淀，用 100 μL 溶解消化后的 PVX-LIC 质粒 &#181;L 的 ddH2O.</li>
		<li>在冰上配制 T4 DNA 聚合酶反应体系，混合 2.5 &#181;L 已消化的 PVX-LIC 载体 DNA，0.5 &#181;L 的 10× T4 DNA 聚合酶缓冲液，0.05 &#181;1 M DTT 溶液 0.25 L &#181;L 的 100 mM dTTP，以及 0.1 &#181;L T4 DNA聚合酶（3 U/&#181;L）总体积为5 &#181;L. 37℃下孵育混合物 &#176;C 反应 15 分钟，然后在 75 ℃ 处理产物&#8201;&#176;C孵育20分钟以灭活T4 DNA聚合酶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用LIC反应将STTM序列克隆至PVX-LIC载体中。将经T4 DNA聚合酶处理的STTM PCR产物（5 &#181;L）以及经T4 DNA聚合酶处理的PVX-LIC质粒（5 &#181;L）。70℃孵育 &#176;C 为 5&#8201;分钟，冷却至22 &#176;以 0.1 的速率升温至 C &#176;℃，并保持在22℃ &#176;使用PCR仪在C下反应30分钟。 
	注意：将孵育时间延长至4℃过夜 &#176;C 以实现更高的LIC克隆效率。</li>
	<li>转化 5 &#181;LIC 反应产物的 L 加入到 E. coli DH5&#945; 并在含有50的LB平板上培养 &#956;g/mL 卡那霉素62,63使用克隆引物和PVX-LIC载体的通用引物通过PCR筛选并验证阳性克隆，随后&#160;测序
	<ol>
		<li>使用PVX-LIC的正向引物（5’-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3’）与STTM克隆的反向引物组合进行菌落PCR，以鉴定阳性克隆。PCR扩增产物的条带大小应约为300 bp。 
		注意：通过终止子循环测序验证 STTM 片段的序列64,65.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从已验证的克隆中提取PVX-STTM质粒，并将其转化至 农杆菌 GV3101、GV2260 或 EHA105 菌株62,63验证 农杆菌 通过PCR鉴定克隆菌落。 
	注意：确认 农杆菌 使用PVX-LIC的正向引物和STTM克隆的反向引物，通过PCR鉴定菌落。</li>
</ol>
3. 在马铃薯植株中进行基于PVX的VbMS检测。
<ol>
	<li>将4周龄的体外培养马铃薯植株移栽至土壤中。移栽后的植株将在3–4天后进行VbMS检测。</li>
	<li>接种马铃薯植株 农杆菌 含有 PVX-STTM 质粒。 
	注意：对于马铃薯中的VbMS检测， 农杆菌介导的浸润与牙签划伤接种同时进行。
	<ol>
		<li>挑选并接种含有 PVX-STTM 载体的阳性转化子至 50 mL 含 50 &#956;g/mL 卡那霉素和 50 &#956;g/mL 利福平。在 28 ℃下培养 &#176;C 摇床中 220 rpm 振荡培养 16 小时，直至 OD600 = 1.0.</li>
		<li>同时，划线接种阳性 农杆菌 菌落转移至至少两个含有 50 的新 LB 平板上 &#956;g/mL 卡那霉素和 50 &#956;g/mL 利福平，28 ℃培养 &#176;C 下放置 1 天。包含 PVX-LIC38,66 对照载体和PVX-GFP67,68 以监测病毒扩散。</li>
		<li>收集 农杆菌 通过3,400 x离心从液体培养物中分离 g 室温下静置10分钟。重悬 农杆菌 细胞与等体积的侵染缓冲液（10 mM MgCl₂）混合2，10 mM MES 和 200 &#181;M 乙酰丁香酮，pH = 5.6）并调节至 OD600 = 1.0. 室温孵育6 h。</li>
		<li>浸润 农杆菌 用1 mL无针注射器将菌液接种到完全展开叶片的远轴面。
		<ol>
			<li>用一只手翻转并固定叶片，另一只手用一根手指从近轴面支撑叶肉的浸润部位。另一只手保持注射器垂直于叶面，进行浸润 农杆菌 将菌液接种至叶片远轴面。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>刮除 农杆菌 从LB平板上挑取菌液，用牙签轻轻刮擦已侵染的马铃薯植株第一个或第二个节间的茎表面。轻轻刮破茎部表皮，避免刺穿茎组织，以免对植株造成严重损伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将侵染后的植株在22 &#176;在16小时光照/8小时黑暗的光周期条件下，光照强度为120 &#956;mol/m2&#8729; s1 在温室中。 
	注意：由miRNA沉默引起的表型通常在接种后2–4周出现图2, 图3通常在侵染后10–20天出现VbMS表型。VbMS表型取决于特定miRNA及其靶基因的特性、生长条件和马铃薯品种。</li>
</ol>
4. 进行表达分析。
<ol>
	<li>接种后2–4周出现表型时，用剪刀采集VbMS植株和对照植株中具有表型的组织，如茎、叶、花或根。从采集的组织中提取总RNA。</li>
	<li>通过电泳检测RNA质量62,63 并通过测量OD值来定量RNA浓度260 使用分光光度计测定吸光度。</li>
	<li>采用茎环法实时逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）分析miRNA表达水平。
	<ol>
		<li>针对特定的miRNA，设计茎环反转录引物。茎环RT引物包含一个通用的5’骨架和一个位于3’端、由特定miRNA的6个核苷酸组成的延伸序列。设计一段5’通用骨架（5’- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3’），可形成茎环结构。（大写字母对应反向重复序列，小写字母对应环区）。</li>
		<li>骨架序列中形成环状结构的5’端部分用作后续PCR扩增的反向引物（骨架序列中的加粗斜体序列）。在茎环引物上添加一段6个核苷酸的延伸序列，该序列与目标miRNA的3’端反向互补，以提供逆转录的特异性补充图 1A). 
		注意：按照 Chen 等人所述的方法设计茎环反转录引物。69 和 Erika Varkonyi-Gasic 等人70,71,72例如，茎环反转录引物用于 Stu-miR160 设计为 5’-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3’。马铃薯miR165/166家族的茎环反转录引物设计为5’-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGGG(A/G)A-3’。（加粗的大写序列为特定miRNA的逆转录提供了特异性。）</li>
		<li>通过混合50–200 ng总RNA和1 &#181;茎环反转录引物的 L（100 &#956;M), 2 &#181;L 的 10 倍缓冲液，0.2 &#181;L RNase抑制剂（40 U/&#181;L），0.25 &#181;L dNTP（各10 mM）和1 &#181;L 逆转录酶（200 U/&#181;L）置于冰上。加入无核酸酶的 ddH2O至总体积20 &#181;L.</li>
		<li>使用脉冲逆转录程序进行逆转录。将逆转录反应混合物在16 &#176;C，30 分钟，进行 30 个温度循环 &#176;C，30 秒，42 &#176;C，30 秒，50 &#176;C 1秒，共60个循环，并在85℃孵育以灭活逆转录酶 &#176;5 分钟，C</li>
		<li>对于miRNA表达的实时PCR分析，根据miRNA序列设计正向引物，但不要包含与上述设计的茎环逆转录引物重叠的序列。在正向引物的5’端添加3–7个核苷酸的延伸序列，以优化引物长度、熔解温度和GC含量。补充图1). 
		注意：通用反向引物为 5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。例如，用于 miR159 的茎环反向转录引物为 Stu-miR160 设计为 5’-CGGCTGCCTGGCTCC-3’。miR165/166家族的茎环反转录引物为5’-CGGCTCGGACCAGGCTT-3’。加粗序列用作引物优化的5’端延伸。可使用miRNA引物设计工具设计用于miRNA的茎环逆转录引物和实时PCR引物。73.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过标准的逆转录 PCR（RT-PCR）合成目标 mRNA 的 cDNA。将逆转录反应体系在 37 &#176;C 反应 60 分钟，然后加热至 85 ℃ 使逆转录酶失活 &#176;5 分钟，C 
	注意：（1）使用 psRNATarget 程序预测靶 mRNA74 如果目标mRNA未知。（2）用于mRNA的通用反转录引物是一种带锚定序列的引物，序列为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’。</li>
	<li>设置实时 PCR 反应，针对两者&#160;目标miRNA及其靶mRNA。混合0.5 &#181;L 模板 cDNA，5 &#181;L 的 2× 实时 PCR 缓冲液（含 SYBR Green），0.05 &#181;每对正向和反向引物各 L（40 &#181;M）和 4.4 &#181;L 的 ddH2总体积为5 O &#181;冰上放置。</li>
	<li>在95℃孵育 &#176;C 3分钟，40个循环：95 &#176;C，3 秒，60 &#176;C，30 秒。随后进行熔解曲线分析，步骤如下：在 95 &#176;C，15 秒，降温至 60 &#176;以20的升温速率升至C &#176;摄氏度，保持在60 &#176;C，60 秒，升温至 95 &#176;以 0.2 ℃/min 的速率升温至 C &#176;C/s，并在95℃下保存 &#176;C，15 秒。分析 Ct使用以下数值： &#916;&#916;Ct 方法76,77 并绘制均值及标准误。 
	注意：(1) 可按照所述方法设计靶标 mRNA 的实时 PCR 引物75. (2) 马铃薯 polyubiquitin 10 基因可作为马铃薯中归一化处理的内参对照。马铃薯的上游引物 polyubiquitin 10 基因为5’-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGGTTG-3’，反向引物为5’-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3’。（3）在实时PCR分析中，污染和引物二聚体的形成可能导致假阳性结果。为监测非特异性扩增并提高实时PCR分析的可靠性，建议在实时PCR检测中设置无模板和无逆转录酶的对照。</li>
</ol>

我们提出了一种基于PVX的miRNA沉默系统，通过将STTM设计整合到PVX载体中，用于鉴定马铃薯内源miRNA的功能。VbMS系统在沉默马铃薯中的miRNA165/166方面表现出有效性，该miRNA家族在植物物种中高度保守。
TM 方法通过设计一种人工 miRNA 靶标模拟物（target mimic），在 miRNA 互补序列的预期切割位点处形成错配环，从而干扰 miRNA 的表达，实现对靶向 miRNA 的隔离及其活性的抑制22,35,78,79。TM 分子与靶 miRNA 的配对通过降低特定 miRNA 或 miRNA 家族的水平来阻断其功能，进而导致靶 mRNA 的上调。目前已开发出多种用于沉默 miRNA 的 TM 技术，包括内源性 miRNA 靶标模拟（eTM）79...

植物微小RNA（miRNA）是一类长度为20–24个核苷酸、由细胞核编码的调控性RNA1，几乎参与调控植物所有生物学过程，包括生长与发育2,3、光合作用与代谢4,5,6,7、激素合成与信号传导8,9、生物与非生物胁迫响应10,11,12,13，以及营养与能量调控14,15。植物miRNA的调控作用具有高度程序化特征，通常在转录后水平通过切割靶标mRNA或抑制其翻译来实现。
在……方面已取得巨大进展&#160;马铃薯中miRNA的鉴定、转录谱分析及靶基因预测16,17,18,19,20,21然而，由于缺乏高效且高通量的遗传学方法，植物（包括马铃薯）中miRNA的功能表征进展落后于其他生物。由于大多数miRNA属于具有显著遗传冗余的基因家族，因此通过标准的基因功能缺失分析来开展单个miRNA的功能研究具有较大挑战性。22此外，单个miRNA可以调控多个靶基因23 多个不同的miRNA可协同调节同一条分子通路24,25这些特性使得对特定miRNA或miRNA家族功能的表征变得困难。
对miRNA的功能分析在很大程度上依赖于功能获得（gain-of-function）方法，而这些方法存在明显的局限性。人工miRNA（amiRNA）技术利用内源性初级转录本（pri-miRNA）高效产生miRNA，从而抑制靶基因的表达26,27,28,29。然而，通过强组成型35S启动子进行激活标签（activation tagging）或miRNA过表达，常常导致miRNA表达水平显著升高，无法真实反映体内（in vivo）的生理状态，因此可能无法准确体现miRNA的内源性功能30。另一种替代策略是表达miRNA抗性的靶基因形式，即在结合位点和/或切割位点引入不可切割的突变31,32,33。但该方法也可能因转基因带来的技术性假象，导致对miRNA抗性靶基因所引发表型的误判。因此，对于这些功能获得研究所得出的结论应谨慎对待34。上述方法的另一主要局限在于其依赖遗传转化，该过程费时且劳动强度大。此外，依赖转基因的方法难以应用于难以转化的植物物种。因此，开发一种快速高效的基因功能缺失（loss-of-function）策略，对于揭示miRNA的功能至关重要&#160;。
为了绕过转化程序的先决条件，病毒介导的microRNA沉默（VbMS）技术已通过将靶标模拟物（TM）策略与病毒来源的载体相结合而建立。在VbMS系统中，人工设计的TM分子由病毒骨架瞬时表达，为研究植物内源性miRNA的功能提供了一种高效、高通量且节省时间的工具35,36。VbMS最初在本氏烟（N. benthamiana）和番茄中利用烟草脆裂病毒（TRV）开发成功35,36,37，随后已扩展至拟南芥、棉花、小麦和玉米，采用的病毒表达系统包括马铃薯X病毒（PVX）38、棉花叶皱缩病毒（ClCrV）39、黄瓜花叶病毒（CMV）40,41,42、中国小麦花叶病毒（CWMV）43以及大麦条纹花叶病毒（BSMV）44,45。
马铃薯（Solanum tuberosum）是全球第四大重要的粮食作物，也是种植最广泛的非谷类作物，这主要归因于其高营养价值、高能量产出以及相对较低的投入需求46。马铃薯的多个特性使其成为一种具有吸引力的双子叶模式植物。它是一种通过营养繁殖的多倍体作物，具有较高的异交率、杂合性以及遗传多样性。然而，迄今为止，尚无利用病毒介导的微小RNA沉默（VbMS）技术对马铃薯中miRNA功能进行表征的报道。本文介绍了一种基于马铃薯X病毒（PVX）并经连接无关克隆（LIC）技术改造的VbMS方法，用于评估miRNA在马铃薯植株中的功能38。我们选择miR165/166家族来展示VbMS检测，因为miR165/166家族及其靶mRNA和III类同源异型域/亮氨酸拉链（HD-ZIP III）转录因子已被广泛研究22,47,48。HD-ZIP III基因是分生组织发育和器官极性的关键调控因子，抑制miR165/166功能会导致HD-ZIP III基因表达升高，从而引起多种发育缺陷，例如顶端优势减弱和叶片极性模式异常22,35,38,41。这些易于观察评分的发育表型与miRNA165/166的沉默密切相关，有助于准确评估基于PVX的VbMS检测的有效性。
本研究中，我们证明了基于PVX的VbMS系统能够有效阻断马铃薯中miRNA的功能。由于基于PVX的病毒诱导基因沉默（VIGS）系统已在多个马铃薯品种中建立49,50,51,52，因此这种基于PVX的VbMS方法有望应用于多种二倍体和四倍体马铃薯物种。

<table><tbody><tr><td>100 &amp;micro;M dATP 和 100 &amp;micro;M dTTP</td><td>Omega Bio-tek, Inc.，Norcross，GA 30071，美国</td><td>TQAC136</td><td></td></tr><tr><td>3 M 醋酸钠，pH 4.0</td><td>Teknova，Hollister，CA 95023，美国</td><td>#S0297</td><td></td></tr><tr><td>乙酰丁香酮</td><td>TCI America，美国俄勒冈州波特兰市，邮编 97203</td><td>D2666-25G</td><td></td></tr><tr><td>农杆菌菌株：GV3101、GV2260 或 EHA105。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>VWR 公司，美国宾夕法尼亚州拉德诺，邮编 19087-8660</td><td>VWRV0757-950ML</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜，DMSO</td><td>TCI America，美国俄勒冈州波特兰市，邮编 97203</td><td>D0798-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>VWR 公司，美国宾夕法尼亚州拉德诺，邮编 19087-8660</td><td>VWRV0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DB3.1</td><td></td><td></td><td>用于含 ccdB 基因的 PVX-LIC 和 pTRV2e 载体的保存</td></tr><tr><td>E. coli DH5&amp;alpha;</td><td></td><td></td><td>通过LIC克隆生成的目的载体</td></tr><tr><td>肥料：Peters Peat Lite Special 15-0-15 阴天专用肥</td><td>ICL Specialty Fertilizers，美国南卡罗来纳州萨默维尔，29483</td><td>G99260</td><td></td></tr><tr><td>高保真 PCR 试剂：KAPA HiFi DNA 聚合酶（含 dNTPs）</td><td>罗氏测序与生命科学，Kapa生物系统公司&lt;br/&gt; 美国马萨诸塞州威尔明顿</td><td>7958960001</td><td></td></tr><tr><td>异戊醇</td><td>VWR 公司，美国宾夕法尼亚州拉德诺，邮编 19087-8660</td><td>VWRV0944-1L</td><td></td></tr><tr><td>Koptec 纯乙醇 &amp;ndash; 200 Proof</td><td>Decon Labs，宾夕法尼亚州普鲁士王市，19406，美国</td><td>V1005M</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>TCI America，波特兰，俄勒冈州 97203，美国</td><td>M0606-250G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>ThermoFisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，邮编 02451</td><td>MFCD00149781</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV 逆转录酶</td><td>New England BioLabs，美国马萨诸塞州伊普斯维奇，邮编 01938-2723</td><td>M0253L</td><td></td></tr><tr><td>Nano-drop 分光光度计：NanoDrop One&lt;sup&gt;C&lt;/sup&gt; 带有 Wi-Fi 功能的微量紫外-可见分光光度计</td><td>ThermoFisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，邮编 02451</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>PCR仪：Bio-Rad MyCycler PCR系统</td><td>Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫尔克里士，邮编 94547</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>PCR仪：Eppendorf Mastercycler pro</td><td>Eppendorf，美国纽约州霍普奇11788</td><td>950030010</td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td>Sper Scientific，斯科茨代尔，亚利桑那州 85260，美国</td><td>台式pH/mV计 - 860031</td><td></td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），pH 6.7/8.0</td><td>VWR 公司，美国宾夕法尼亚州拉德诺，邮编 19087-8660</td><td>VWRV0883-400ML</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel：结冷胶</td><td>Alfa Aesar，Tewksbury，MA 01876，美国</td><td>J63423-A1</td><td></td></tr><tr><td>PVX VIGS 载体：PVX-LIC</td><td></td><td></td><td>Zhao 等，2016</td></tr><tr><td>实时荧光定量PCR仪：QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>实时荧光定量 PCR 试剂：KAPA SYBR&amp;reg; FAST qPCR Master Mix (2x) 试剂盒</td><td>罗氏测序与生命科学，Kapa生物系统公司&lt;br/&gt; 美国马萨诸塞州威尔明顿 01887</td><td>7959389001</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶：SmaI</td><td>New England BioLabs，Ipswich，MA 01938-2723，美国</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>逆转录试剂：qScript cDNA SuperMix</td><td>Quanta BioSciences，美国马里兰州盖瑟斯堡 20877</td><td>95107-100</td><td></td></tr><tr><td>RNA提取试剂盒：E.Z.N.A. Plant RNA Kit</td><td>Omega Bio-tek, Inc.，Norcross，GA 30071，美国</td><td>货号：D3485-01</td><td></td></tr><tr><td>RNase抑制剂 小鼠来源</td><td>New England BioLabs，Ipswich，MA 01938-2723，USA</td><td>M0314L</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol RT</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103</td><td>R4533</td><td></td></tr><tr><td>基质：Metro-Mix 360</td><td>Sun Gro Horticulture，美国马萨诸塞州阿加瓦姆，01001-2907</td><td>Metro-Mix 360</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA聚合酶及缓冲液</td><td>New England BioLabs，Ipswich，MA 01938-2723，美国</td><td>M0203S</td><td></td></tr></tbody></table>

基于马铃薯病毒x的microrna沉默技术（vbms）在马铃薯中的应用

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

基于病毒的 microRNA 沉默（VbMS）是一种用于植物中 microRNA（miRNA）功能表征的快速高效工具。VbMS 系统已开发并应用于多种植物物种，包括Nicotiana benthamiana、番茄、拟南芥、棉花，以及小麦和玉米等单子叶植物。本文中，我们描述了一种使用基于 PVX 的 VbMS 载体在马铃薯中沉默内源性 miRNA 的详细实验方案。为了降低特定 miRNA 的表达水平，需设计目标 miRNA 的模拟分子（target mimic，TM），将其插入植物病毒载体，通过Agrobacterium介导的侵染在马铃薯中表达，从而直接结合目标内源性 miRNA 并阻断其功能。

图2显示了PVX-STTM165/166马铃薯植株（Katahdin）的叶片组织在叶脉处从叶片远轴面异位生长。还观察到更为严重的表型，例如喇叭状叶片的形成。相比之下，PVX对照植株未观察到任何表型异常。这些结果表明，VbMS系统在四倍体马铃薯植株中有效抑制了内源miRNA的功能，且PVX-VbMS系统是一种可靠的遗传工具，可用于确定特定miRNA或miRNA家族的功能。
图3显示了PVX-STTM165/166马铃薯植株（Russet Burbank）的叶片远轴面沿叶脉处出现异位叶组织生长。这些结果表明，PVX-VbMS系统可应用于其他马铃薯物种，包括主要的马铃薯栽培品种。
<img alt="PVX 载体图示；STTM 分子与 miRNA 的相互作用及基因沉默过程示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_up...

我们提供了一种基于马铃薯X病毒（PVX）的microRNA沉默（VbMS）系统的详细实验方案，用于在马铃薯中对内源性microRNA（miRNA）进行功能鉴定。将目标miRNA的靶标模拟物（TM）分子插入PVX载体中，并在马铃薯中瞬时表达，以实现对目标miRNA或miRNA家族的沉默。

基于马铃薯病毒X的microRNA沉默技术（VbMS）在马铃薯中的应用

基于病毒的 microRNA 沉默（VbMS）是一种用于植物中 microRNA（miRNA）功能鉴定的快速高效工具。VbMS 系统具有……

分析植物中 microRNA 功能的传统方法主要依赖于稳定敲低植物的产生。这种基于病毒的 microRNA 沉默系统不需要繁琐且耗时的转化。基于病毒的 microRNA 沉默是一种快速有效的工具，用于对植物中的 microRNA 进行功能表征，可应用于广泛的二倍体和四倍体马铃薯物种。演示该程序的是我实验室的博士后研究助理 Jinping Zhao。为了设计靶模拟物模块，在对应于 microRNA 的第 10 至第 11 个核苷酸的位点上将错配序列插入到目标 microRNA 的反向补体序列中。为了扩增短串联靶标模拟物片段，使用每个目标引物、48 个核苷酸的空间寡核苷酸、10 倍 PCR 缓冲液、dNTP 混合物、高保真 PCR DNA 聚合酶和双蒸水构建 PCR 反应，最终体积为 50 μL。然后使用指示的参数通过标准 PCR 扩增 microRNA。为了纯化短串联靶标模拟物，向 PCR 产物中加入 2.5 体积的乙醇和 1/10 体积的 3 摩尔乙酸钠。剧烈混匀，然后以 14， 000 倍 G 离心反应物 10 分钟。去除上清液后，用 1 毫升 70% 乙醇冲洗沉淀并让沉淀干燥，然后将沉淀溶解在 20 微升双蒸水中。为了构建 T4 DNA 聚合酶反应，将纯化的短串联靶标模拟 PCR 产物与 10 倍 T4 DNA 聚合酶缓冲液、1 摩尔二硫苏糖醇、100 毫摩尔 dATP、T4 DNA 聚合酶和双蒸水在冰上混合，最终体积为 5 μL。然后将混合物在 37 摄氏度下孵育 15 分钟，然后在 75 摄氏度下孵育 20 分钟以灭活 T4 DNA 聚合酶。为了制备基于 PVX 的 VBMS 构建体，用 2.5 μL SMA1 消化 5 μg PVX 连接非依赖性克隆质粒，总体积为 100 μL。向异戊醇中加入等体积的苯酚与氯仿，以 25 比 1 的比例向消化的 PVX 连接非依赖性克隆产物中加入 25 至 24 比 1 的比例，剧烈混合，然后离心收集产物。将等体积的氯仿与异戊醇以 24：1 的比例加入上清液中，涡旋，然后对试管内容物进行第二次离心。离心结束时，将上清液转移到新的离心管中，加入 2.5 体积的乙醇和 1/10 体积的 3 摩尔乙酸钠，充分混合。离心管并用 1 毫升 70% 乙醇冲洗沉淀并剧烈涡旋。再次离心试管并去除上清液，让沉淀风干。然后将消化的 PVX 连接非依赖性克隆质粒沉淀溶解在 100 微升双蒸水中。为了构建 T4 DNA 聚合酶反应，将消化的 PVX 非连接性克隆载体 DNA 与 10 倍 T4 DNA 聚合酶缓冲液、1 摩尔二硫苏糖醇、100 毫摩尔 dTTP 和 T4 DNA 聚合酶在冰上混合，最终体积为 5 μL。然后将混合物在 37 摄氏度下孵育 15 分钟，然后在 75 摄氏度下孵育 20 分钟以灭活 T4 DNA 聚合酶。要将短串联靶标模拟序列克隆到 PVX 连接非依赖性克隆载体中，将 5 μL T4 DNA 聚合酶处理的短串联靶标模拟 PCR 产物与 5 μL T4 DNA 聚合酶处理的 PVX 连接非依赖性克隆质粒混合，并在 70 °C 下孵育混合物 5 分钟。孵育结束时，在 PCR 机器中以每秒 0.1 摄氏度的速度将试管内容物冷却至 22 摄氏度，一旦达到目标温度，将试管留在热循环仪中 30 分钟。在孵育结束时，使用标准转化方案将 5 微升不依赖连接克隆反应产物转化到大肠杆菌 DH5 α 中，并在含有 50 μg/mL 卡那霉素的 LB 平板上培养转化的细菌。通过终止子循环测序验证短串联靶模拟物片段的序列后，从经过验证的克隆中分离 PVX VBMS 质粒，并将其转化为适当的农杆菌菌株。要用含有 PVX VBMS 质粒的农杆菌接种 4 周龄的体外马铃薯植株，请选择含有 PVX VBMS 载体的阳性转化体，并将转化体接种在 50 毫升液体 LB 中，其中含有 50 微克/毫升卡那霉素和 50 微克/毫升利福平，在 28 摄氏度和 220 转/分钟下接种 16 小时。在孵育过程中，将阳性农杆菌菌落划线到至少两个含有卡那霉素和利福平的新 LB 平板上，并在 28 摄氏度下培养培养物一天。当 600 纳米处的光密度达到 1.0 时，通过离心收集农杆菌液体培养物，并将沉淀重悬于足够体积的渗透缓冲液中，以将 600 纳米处的光密度调节至 1.0。在室温下孵育 6 小时后，将农杆菌悬浮液装入 1 毫升无针注射器，然后用一只手翻转并握住一株马铃薯植株的扩展叶子。用一根手指从近轴侧支撑叶层的所需渗透部位。并用另一只手将注射器垂直于叶子表面，将 100 至 200 微升农杆菌培养物渗入叶片的背面。接下来，用牙签从农杆菌培养板中收集菌落，并刮擦浸润的马铃薯植株的前一两个节间的茎表面和茎的表皮，然后将浸润的植物在温室中培养两到四个星期。当表型出现时，用剪刀从 VBMS 和对照植物中收集具有表型的样品。从收集的组织分离总 RNA，并使用逆转录酶 PCR 分析每个样品中的 microRNA 和靶标 mRNA 表达。在这些图像中，PVX 短串联靶模拟 165/166 马铃薯植株，可以观察到叶组织沿叶脉的背面异位生长。还观察到更严重的表型，例如喇叭形叶子的形成。相比之下，在 PVX 对照植物中未观察到表型异常，表明 VBSM 系统可有效抑制四倍体马铃薯植物的内源性 microRNA 功能。PVX 短串联靶标模拟 165/166 马铃薯植株表现出从叶层背面沿叶片脉的异位叶到组织生长，表明 PVX VBMS 系统可应用于其他马铃薯品种，包括主要马铃薯品种。必须同时渗透叶子并用相同的农杆菌培养物接种同一植物的茎。当需要在后代中维持靶向 microRNAs 的沉默状态时，建议使用转基因方法将目标模拟分子稳定地引入马铃薯植物。

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环境

马铃薯病毒基于马铃薯的X型微RNA沉默（VbMS）。

病毒诱导的基因沉默（VIGS）在Nicotiana benthamiana和番茄中的应用

植物病毒纳米颗粒（VNPs）是生物医学应用中有前景的平台。本文介绍了植物VNPs的增殖、纯化、表征及生物偶联的操作步骤。最后，我们展示了利用小鼠异种移植模型和荧光成像技术，将VNPs应用于肿瘤靶向与成像的研究。...

病毒纳米颗粒用于 在体 肿瘤成像

本文描述了一种分析玉米粗缩病毒（Maize rayado fino...

半胱氨酸残基溶剂可及性的分析Maize rayado fino virus病毒样颗粒的制备Nicotiana benthamiana植物与多肽至病毒样颗粒的交联

农杆菌浸润法和PVX农杆菌感染法是植物中外源基因瞬时异位表达的常规功能检测方法。这些方法在效应子组学策略（快速鉴定抗性基因和无毒基因）中是高效的检测手段，对现代分子植物病理学研究至关重要。它们满足了植物中进行高效高通量功能分析的需求。...

农杆菌浸润及PVX农杆菌感染在马铃薯和Nicotiana benthamiana中的应用

病毒诱导的基因沉默是鉴定植物非寄主抗性相关基因的有效工具。我们展示了利用表达 GFPuv...

通过VIGS介导的正向遗传学筛选鉴定参与非寄主抗性的基因

本文介绍了一种通过在小RNA病毒基因组中插入与特定微小RNA互补的序列来调控其嗜性（tropism）的方法。该方案可根据不同病毒生命周期的长度和特性进行相应修改，从而适用于所有不同类别的病毒。...

基于微小RNA的肠道病毒嗜性调控

本文介绍了两种转化马铃薯植株的实验方案。Agrobacterium tumefaciens 转化可获得完整的转基因植株，而 Agrobacterium rhizogenes...

Agrobacterium tumefaciens 和 Agrobacterium rhizogenes 介导的马铃薯转化及通过 GUS 染色检测木栓质合成基因的启动子活性

本文介绍了一种改进的筛选方法，可广泛用于快速筛选植物病原体中的RNA沉默抑制因子。...

植物病原菌分泌效应子中RNA沉默抑制子的筛选与鉴定

本方法展示了利用Northern杂交技术从总RNA提取物中检测miRNA。...

植物微小RNA的检测与定量分析：RNA印迹分析法

本文介绍了一种基于农杆菌的注射（agroinjection）方法，用于将Agrobacterium介导的狗尾草花叶病毒 和甘蔗花叶病毒克隆接种至玉米幼苗。采用该方法接种可实现病毒感染、病毒诱导的标记基因沉默以及GFP的病毒过表达。...

通过注射重组狗尾草花叶病毒和甘蔗花叶病毒感染性克隆直接对玉米幼苗进行农杆菌接种

关键词：玉米幼苗，农杆菌接种，注射，重组狗尾草花叶病毒，重组甘蔗花叶病毒，感染性克隆

本文介绍了一种通过在诱导细胞死亡后连续成像接种叶片来研究程序性细胞死亡起始速率的实验方案。...

使用数字显微镜研究细胞死亡的启动

了解利用马铃薯X病毒载体进行病毒介导的microRNA沉默技术，无需稳定转化即可快速高效地研究植物内源miRNA功能，适用于二倍体和四倍体马铃薯品种。

基于马铃薯病毒X的microRNA沉默技术（VbMS）在马铃薯中的应用

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