一种用于刺激骨细胞力传导及分析骨重塑功能结果的芯片实验室平台

本文介绍了在可调节的芯片实验室平台上培养骨细胞的实验方案。这些技术可用于深入理解调控力学诱导骨重建机制的原理。我们的系统支持骨细胞的长期培养，从而能够在机械负荷环境改变的情况下，直接定量分析骨形成与骨吸收过程。

使用这些基础技术可推动多项与骨骼相关问题的研究进展，例如骨质疏松症、骨折愈合以及假体周围性骨溶解。制备微孔和微通道层时，将PDMS预聚物与固化剂按10:1的比例加入塑料杯中，充分混合后，对聚合物进行30分钟的脱气处理。随后将混合物缓慢倾倒至已预先调平的掩模上。

静置30分钟，然后在45摄氏度下烘烤18小时。使用锥形实验室刮刀松开PDMS边缘，小心地将其从掩膜上剥离，再用手术刀和3D打印模板切割出单个芯片，并用包装胶带进行表面清洁。制备PDMS膜层时，重复前述步骤混合、浇注并烘烤PDMS。

从调平盒中取出PDMS片材，并切割出与微孔和微通道层尺寸相匹配的单个膜。使用卡尺测量膜中心的厚度，剔除厚度不符合要求的膜，然后用包装胶带小心清洁膜表面，并将其放置在一片石蜡膜上。制作PDMS盖层时，重复之前的步骤进行PDMS的混合、浇注和烘烤。

将各个盖子裁剪至合适尺寸后，使用1毫米活检打孔器在PDMS上打穿通孔，然后用包装胶带对表面进行清洁。将第一层和第二层置于等离子清洗仪中，在中等射频功率下处理30秒以活化表面，随后将第一层的通孔与第二层的微通道对齐，并将两层紧密压合。对于深孔设计，在等离子处理过程中，使用双面胶带将第三层的石蜡膜固定于平整表面，然后重复上述过程，将第二层与第三层结合。

修剪掉PDMS膜上多余的材料，并小心地从芯片底部剥离石蜡膜。将芯片在65°C下烘烤10分钟，以增强PDMS层之间的结合强度，然后将斜角加样头插入盖板上的通孔中，并使用移液器吸头将双组分环氧树脂涂覆于每个加样头周围，将其固定。待环氧树脂完全固化后，用70%乙醇对芯片表面进行清洁，并将其转移至生物安全柜中。

将一个5 mL注射器通过无菌硅胶管连接至分配尖端，并用70%乙醇充满整个芯片，至少保持30秒。从芯片中移除乙醇，并用紫外光照射过夜进行灭菌。次日，用蒸馏水清洗芯片三次，用水充满芯片，然后从分配尖端移除硅胶管。

将芯片在37摄氏度下孵育至少48小时。将一个压缩弹簧套在压头的轴上，插入底座底部的中心孔中，然后用四颗自攻螺钉将刻度块固定到底座底部，再将第二个压缩弹簧套在中心螺钉上。

将螺丝插入旋钮底部的六角形孔中，并将组件拧入底座中心的螺纹孔内。在底座底部拧入四个雌雄接头支柱。通过逆时针旋转旋钮以消除装置中的松动，直至压板顶部低于底座顶部，然后缓慢顺时针旋转旋钮，直到压板顶部与底座顶部齐平。

使用5毫升注射器从深孔芯片中移除水，并在乙酸中加入200微升I型胶原蛋白，覆盖孔底，孵育1小时。用含钙和镁的DPBS冲洗芯片3次，并将其放入芯片支架中。在MEM α培养基中加入小牛血清、FBS和青霉素/链霉素，将MLO-Y4骨细胞接种到芯片上。

将管路从分配尖端取下，将芯片放入深孔培养皿中，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育细胞72小时。孵育结束后，将无菌管路连接至分配尖端，使用5毫升注射器从芯片中移除用过的培养基，然后缓慢用新鲜培养基重新填充芯片。将芯片支架放入加载装置底座顶部的矩形凹槽内，将管路穿过盖子上的槽口，并将盖子固定到底座上。

通过顺时针旋转旋钮对细胞施加载荷，直至达到所需的压头位移，然后将加载装置放入一个空的P1000移液器吸头盒中，使细胞在该载荷下孵育15分钟。孵育结束后，逆时针旋转旋钮，将载荷卸除至初始起始位置，随后取下装置的盖子，将芯片支架放入深孔培养板中，让细胞继续孵育90分钟以进行载荷后恢复。使用5毫升注射器从芯片中移除条件培养基，并将芯片从芯片支架中取出，然后使用锥形刮刀破坏PDMS盖层与孔层之间的粘合。

细胞现已准备好进行分析。浅孔板配置可用于分析成骨细胞和破骨细胞的功能活性。通过茜素红和冯科萨染色对前成骨细胞形成的骨进行定量分析。

使用甲苯胺蓝染色对破骨细胞的骨吸收进行定量，并通过扫描电子显微镜验证吸收陷窝的存在。采用深孔芯片结构，通过静态平面外拉伸诱导成骨细胞的机械转导。芯片中接种成骨细胞的图像表明，芯片与蒸馏水孵育48小时对于维持细胞活力及典型形态至关重要。

在加载过程中，成骨细胞受到聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜上诱导产生的应变梯度作用。确定了1至2毫米位移范围内平均等效应变与压头位移之间的关系，并生成了诱导应变的代表性热图。加载后，通过乳酸脱氢酶染色以及annexin V与死细胞检测法分析细胞活力。

拉伸的骨细胞乳酸脱氢酶染色显示，在培养孔外缘区域染色较浅，该位置对应于应变值较高的区域。我们的平台具有高度的多功能性，可用于研究多种调控骨重建的因素，例如负荷诱导的机械转导、炎症反应以及药物效应。本文介绍的技术为构建真正的“芯片骨器官”奠定了基础，有望显著增进我们对调控骨健康的多细胞复杂机制的理解。