Name: 为早期小鼠胚胎测序准备小型RNA库 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学习制备低起始量小RNA测序文库的技术，用于早期小鼠胚胎中microRNA表达谱分析。该方法无需混合样本，可应用于神经嵴细胞发育及发育障碍诊断研究。

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本项目得到安德鲁·麦克唐纳B+基金会和美国国立卫生研究院（NIH）（R01-HD099252、R01-HD098131）的支持。&#160;R.J.P. 是癌症研究CPRIT学者（RR150106）和癌症研究V基金会学者（V Foundation）。<span style="border-width: 1pt; border-style: none; border-color: windowtext; padding: 0in; background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">&#160;作者还感谢贝勒医学院（BCM）细胞计量与细胞分选核心实验室提供本项目所需的设备。

所有研究和动物护理程序均经贝勒医学院机构动物护理和使用委员会批准，并在贝勒医学院经国际实验动物评估和认可委员会认证的动物设施中进行饲养。所有品系均维持在C57BL6遗传背景上。
1. 胚胎解剖（E7.5-E9.5）
<ol>
	<li>从怀孕雌性小鼠体内取出子宫角，在即将进行切口的腹部区域用70%乙醇消毒。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗子宫以清洁表面，并将子宫置于无菌的塑料10 cm培养皿中。</li>
	<li>使用显微解剖剪将每个含有蜕膜的区域相互分离，剥除子宫肌层并暴露所有蜕膜。逐个将蜕膜从每个胚胎上分离下来。</li>
	<li>从每个胚胎上移除卵黄囊，并保存用于基因分型。</li>
	<li>将所有胚胎转移至盛有新鲜PBS的新培养皿中，用于成像。</li>
	<li>拍摄整窝胚胎的图像，然后逐一成像每个胚胎，并记录每个胚胎的体节数量。不同实验之间应保持放大倍数和曝光时间（荧光成像）一致。 
	注意：我们发现荧光成像时50–200 ms的曝光时间已足够，明场成像时20 ms的曝光时间已足够。</li>
</ol>
2. 胚胎解离与细胞分选
<ol>
	<li>对每个需要分选的胚胎，执行以下操作。
	<ol>
		<li>对于发育阶段晚于E8.0的胚胎，在耳基板上方进行断头处理（若仅需头部区域的标记细胞）。对于E7.5胚胎，去除胚外结构（若仅需胚胎本体）。</li>
		<li>将头部用最小体积的PBS转移至48孔板中的一个洁净孔中，加入250 µL木瓜蛋白酶溶液（27 U/mL），使用P200移液器轻轻吹打数次。</li>
		<li>在显微镜下观察，检查是否存在细胞团块及单个细胞。</li>
		<li>重复轻柔吹打操作，直至获得单细胞悬液（通常需吹打3轮，E7.5–E9.5胚胎约需30秒至1分钟）。</li>
		<li>加入250 µL胎牛血清（FBS）终止反应。</li>
		<li>对每个待分选的胚胎重复步骤2.1.1–2.1.5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将500 µL细胞悬液通过35 µm尼龙网膜滤帽管过滤，以去除细胞团块。</li>
	<li>收集滤液并转移至新的1.5 mL离心管中，在200 × g 条件下离心5分钟。小心移除上清液并转移至新管中（待确认活细胞已沉淀后方可丢弃）。</li>
	<li>用含0.5–1%牛血清白蛋白的300 µL PBS重悬细胞沉淀，置于冰上直至分选（尽量缩短从此时到分选结束的时间）。
	<ol>
		<li>如需检测，取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝（0.4%）混合，使用血细胞计数板计数，以估算细胞数量和活力，因台盼蓝仅染色死细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分选前，再次将每个样品通过滤帽管过滤，并加入DAPI染料以标记活细胞。</li>
	<li>使用配备70 µm喷嘴的流式细胞分选仪，将每个样品分选至含有500 µL RNA提取裂解液的收集管中（参见材料表）。</li>
	<li>混匀后于-80 °C保存，直至所有样品收集完毕。只有在实验所需全部样品均收集完成后，才继续后续操作，以减少文库制备轮次间的技术差异。</li>
</ol>
3. RNA 提取
注意：本方案改编自RNA提取试剂盒；参见材料表。
<ol>
	<li>向每个样本中加入 500 µL RNA 提取裂解液（见材料表），使总体积达到 1000 µL。</li>
	<li>将每个样本在室温下解冻。</li>
	<li>每个样本涡旋振荡 1.5 分钟，确保在开始均质化前每根管的盖子已拧紧。将匀浆液在室温（15–25 °C）下孵育 5 分钟。</li>
	<li>加入 140 µL 氯仿，盖紧管盖并剧烈振荡 15 秒。在室温下孵育 3 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 15 分钟。将上层水相转移至冰上的新收集管中。切勿转移任何中间相或有机相。当接近粉红色有机相时，将管子倾斜，分次移取少量液体，直至无法再收集到清晰的水相为止。</li>
	<li>测量从每个样本收集到的含 RNA 水相的体积，以便在下一步进行准确计算。</li>
	<li>加入 1.5 倍体积（通常为 525 µL，但可能略多或略少）的 100% 乙醇，并用移液器充分混匀。</li>
	<li>将最多 700 µL 的样本（包括任何沉淀物）移入 2 mL 收集管中的柱子中。盖上盖子，在室温下以 ≥8,000 x g 离心 15 秒。弃去穿流液。</li>
	<li>使用剩余样本重复步骤 3.8。</li>
	<li>按照制造商说明书洗涤柱子。通过全速离心 1 分钟干燥柱子。将柱子转移至新的 1.5 mL 收集管中。</li>
	<li>向膜的中心加入 11 µL 无核酸酶水。室温静置 1 分钟。以最大速度离心 1 分钟，洗脱 RNA。</li>
	<li>使用分光光度计和并行毛细管电泳仪（材料表）测定 RNA 浓度。</li>
</ol>
4. 文库构建
注意：本方案改编自小RNA文库构建试剂盒手册；参见材料表。
<ol>
	<li>按照小RNA文库构建试剂盒手册中的说明，使用¼稀释的3’接头进行变性及3’接头连接。</li>
	<li>继续进行过量3'接头的去除。</li>
	<li>按照小RNA文库构建试剂盒手册中的说明完成接头去除步骤。务必使用新配制的80%乙醇进行磁珠纯化，并在用无核酸酶水重悬前彻底去除所有过量乙醇，避免磁珠过度干燥（过度干燥会导致磁珠沉淀开裂）。</li>
	<li>直接进入过量接头失活步骤。</li>
	<li>按照小RNA文库构建试剂盒手册中的说明，在冰上配制所有试剂，完成过量接头的失活反应。</li>
	<li>继续进行5' 4N接头连接。</li>
	<li>按照小RNA文库构建试剂盒手册中的说明完成5'接头连接，确保使用¼稀释的5’接头，并在冰上配制所有试剂。</li>
	<li>进入反转录步骤。</li>
	<li>按照小RNA文库构建试剂盒手册中的说明完成反转录——第一链合成，并注意在冰上配制所有试剂，避免酶在 freezer 外长时间放置。 
	注意：此时可暂停实验流程，将样品在4 °C下保存过夜；也可继续进行PCR扩增。</li>
	<li>按照小RNA文库构建试剂盒手册中的说明配制试剂，完成PCR扩增，并尽量减少PCR循环次数。PCR循环数应根据具体实验条件优化确定，应使用最少必要循环数。本实验中使用16个循环成功扩增了小RNA文库。</li>
	<li>直接进入片段大小选择步骤。</li>
</ol>
5. 大小筛选
<ol>
	<li>向每个样品中加入 5 µL 的 6x 上样缓冲液，并用移液器混匀。</li>
	<li>向凝胶的第一个加样孔中加入 10 µL 的 DNA 标准品，其右侧相邻的加样孔留空。将步骤 5.1 中获得的全部产物上样至 6% Tris/硼酸/乙二胺四乙酸–聚丙烯酰胺凝胶（TBE-PAGE）中，各样品之间至少间隔一个加样孔。 
	注意：保留凝胶原包装容器，以用于后续步骤。</li>
	<li>在 0.5x TBE 电泳缓冲液中以 150 V 电压电泳约 30–40 分钟（直至下部染料条带迁移至凝胶底部附近，距底边 0.5–1 cm）。</li>
	<li>在电泳进行的同时，配制 1 L 染色液：将 SYBR Gold 以 1:10,000 的比例稀释于 0.5x TBE 缓冲液中。</li>
	<li>当电泳完成（即下部染料条带接近凝胶底部）时，小心地从玻璃板间取出凝胶，并记录凝胶的方向。</li>
	<li>将凝胶放回其原始包装托盘中。弃去 0.5x TBE 缓冲液，加入步骤 5.5 配制的染色液，染色 15 分钟。必要时可适当延长染色时间。</li>
	<li>将凝胶置于紫外透射仪上，注意避免撕裂凝胶，并保持上述记录的方向（若 DNA 标准品条带不清晰，可延长复染时间）。</li>
	<li>染色完成后，使用相机在紫外透射仪上成像。
	<ol>
		<li>若需获得更佳图像，应首先使用非紫外透射仪的成像设备对凝胶进行拍照，再在紫外透射仪上切下目标条带；直接在紫外透射仪上成像会导致背景着色不均，如图 3A-B 所示。避免频繁移动凝胶，因其较为脆弱，易发生断裂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用洁净的剃刀切下约 150 bp 的条带，并转移至洁净的 1.5 mL 离心管中。切勿切下约 130 bp 的条带（接头二聚体产物）。
	<ol>
		<li>切下含文库产物的凝胶条带后，再次对凝胶成像以用于记录存档。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有凝胶切片的微量离心管以最大转速离心 30 秒，使凝胶切片沉至管底。</li>
	<li>为每个样品使用一支 p200 枪头将凝胶切片尽可能碾碎。将使用过的枪头一同弃入对应离心管中。</li>
	<li>向每管中加入 300 µL 洗脱缓冲液，注意冲洗管壁上的凝胶碎屑，并重新装上 p200 枪头，将枪头上的凝胶残留也冲洗入管中。</li>
	<li>将洗脱样品置于设定为 25 °C 的振荡孵育器中，以 1000 rpm 振荡过夜。孵育结束后从孵育器中取出离心管，室温下以最大转速离心 10 分钟。</li>
	<li>将含有文库产物的上清液转移至 2 mL 无 RNase 的 96 孔板中。注意避免转移任何凝胶碎片。</li>
	<li>向每个样品中加入 50 µL 纯化磁珠，通过移液混匀。立即加入 350 µL 异丙醇，再次通过移液混匀。室温下轻摇孵育 10 分钟。</li>
	<li>短暂离心使磁珠沉淀，随后置于磁力架上静置 2 分钟。小心移除并弃去上清液。</li>
	<li>加入 950 µL 80% 乙醇。孵育 30 秒。完全移除上清液。重复此步骤，共进行两次乙醇洗涤。</li>
	<li>干燥样品 3 分钟。此步骤需注意彻底去除各孔底部积聚的残留乙醇（不超过一次），并避免过度干燥磁珠（过度干燥会导致磁珠沉淀开裂）。</li>
	<li>彻底去除孔底所有残留液体。将 96 孔板从磁力架上取下。</li>
	<li>用 13 µL 重悬缓冲液重悬磁珠沉淀。通过移液混匀至均匀悬浮。孵育 2 分钟后，置于磁力架上静置 3 分钟。</li>
	<li>将 12 µL 上清液转移至洁净的离心管或洁净 96 孔板的孔中，用于后续保存。所有样品可于 4 °C 短期保存过夜，或于 -20 °C 长期保存。</li>
	<li>使用毛细管电泳高灵敏度 DNA 检测法检测各文库中片段的大小与浓度。通过多于一种方法确认浓度。 
	注意：我们偶尔使用标准灵敏度试剂盒，以避免毛细管电泳过载。</li>
</ol>

<ol><li>Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+regulatory+network+orchestrates+neural+crest+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 557-568 (2008).</li>
<li>Abrahante, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+hunchback-like+gene+lin-57%2Fhbl-1+controls+developmental+time+and+is+regulated+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans hunchback-like gene lin-57/hbl-1 controls developmental time and is regulated by microRNAs.</a> Developmental Cell. 4 (5), 625-637 (2003).</li>
<li>Lin, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C+elegans+hunchback+homolog%2C+hbl-1%2C+controls+temporal+patterning+and+is+a+probable+microRNA+target%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The C elegans hunchback homolog, hbl-1, controls temporal patterning and is a probable microRNA target.</a> Developmental Cell. 4 (5), 639-650 (2003).</li>
<li>Reinhart, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+21-nucleotide+let-7+RNA+regulates+developmental+timing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 403 (6772), 901(2000).</li>
<li>Slack, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lin-41+RBCC+gene+acts+in+the+C.+elegans+heterochronic+pathway+between+the+let-7+regulatory+RNA+and+the+LIN-29+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor.</a> Molecular Cell. 5 (4), 659-669 (2000).</li>
<li>Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+microRNA+let-7+binds+to+imperfect+let-7+complementary+sites+from+the+lin-41+3%27UTR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR.</a> Genes & Development. 18 (2), 132-137 (2004).</li>
<li>Ventura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+deletion+reveals+essential+and+overlapping+functions+of+the+miR-17+92+family+of+miRNA+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted deletion reveals essential and overlapping functions of the miR-17 92 family of miRNA clusters.</a> Cell. 132 (5), 875-886 (2008).</li>
<li>Eberhart, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Mirn140+modulates+Pdgf+signaling+during+palatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis.</a> Nature Genetics. 40 (3), 290(2008).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+small+RNAome+during+the+early+stage+of+cardiac+differentiation+from+pluripotent+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Data%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of small RNAome during the early stage of cardiac differentiation from pluripotent embryonic stem cells.</a> Genomics Data. 12, 136-145 (2017).</li>
<li>Chugh, P., Dittmer, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+pitfalls+in+microRNA+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Potential pitfalls in microRNA profiling.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 3 (5), 601-616 (2012).</li>
<li>Werber, M., Wittler, L., Timmermann, B., Grote, P., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tissue-specific+transcriptomic+landscape+of+the+mid-gestational+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The tissue-specific transcriptomic landscape of the mid-gestational mouse embryo.</a> Development. 141 (11), 2325-2330 (2014).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+sequencing+reveals+dynamic+modifications+and+activities+of+small+RNAs+in+mouse+oocytes+and+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos.</a> Science Advances. 2, (2016).</li>
<li>Ohnishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+class+transition+from+siRNA%2FpiRNA+to+miRNA+during+pre-implantation+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Small RNA class transition from siRNA/piRNA to miRNA during pre-implantation mouse development.</a> Nucleic Acids Research. 38 (15), 5141-5151 (2010).</li>
<li>Loontiens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+high-quality+RNA+from+a+small+number+of+fluorescence+activated+cell+sorted+zebrafish+cells+for+RNA+sequencing+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Purification of high-quality RNA from a small number of fluorescence activated cell sorted zebrafish cells for RNA sequencing purposes.</a> BMC Genomics. 20 (1), 228(2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

发育过程可能进展迅速，细胞经历多个连续的特化阶段，因此要全面捕捉参与早期命运决定的miRNA，需要比常用的半天时间间隔更精确的分期。最近一项研究对Theiler 12期胚胎（具有3到6个体节）进行了RNA测序11。我们发现，在此期间，神经嵴细胞经历了特化（3个体节阶段）、去层化（4个体节阶段）以及迁移（5-6个体节阶段）。我们还发现，除了用于谱系示踪细胞群的Cre驱动元件外，胚胎年龄是生物样本间差异的最大来源，只有体节数匹配的胚胎才能视为重复样本。在比较转基因胚胎与野生型对照时，也应考虑这一因素。
以往在早期发育过程中对miRNA进行分析的方法，在小RNA测序文库构建中通常需要10–100 ng的RNA起始量，并将多个胚胎合并为一个样本13,14。本文展示了一种从单个E7.5胚胎或E8.5和E9.5时期分选的神经嵴细胞中提取RNA并进行文库构建的方法，起始总RNA量约为100 ng。在解离胚胎用于分选时，应通过显微镜观察解离过程，并及时终止反应，以判断单细胞是否已获得。我们发现，按照本方案所述，通过轻柔的手动移液，E8.5–E9.5胚胎的头颅区域几乎可立即完成解离。对于较大的组织或发育更晚期的胚胎，解离时间可能更长，具体取决于所解离的胚胎部位。对于E7.5–E9.5的胚胎，细胞团块在显微镜下清晰可见，应持续解离直至无可见细胞团块为止。若将显微镜焦点在孔中溶液的不同深度调节（放大倍数5–10倍），即可观察到悬浮的单个细胞。以往方法通常将细胞直接分选至裂解缓冲液中，用于从少量细胞中制备总RNA测序样品14。本方案中，我们将细胞直接分选至RNA提取裂解液中，以便在文库构建开始前完成RNA的提取。使用洗脱体积为11 µL的微型离心柱，可获得足够高的RNA浓度，从而使单次RNA提取样品可同时用于小RNA测序和总RNA测序。
目前大多数小RNA测序方法的一个局限性在于对转化后的cDNA进行PCR扩增。本方法虽未完全克服这一局限性，但我们已将PCR循环次数从推荐的最大25次减少至16次。这种扩增次数的降低有助于减少PCR引入的人工扩增偏差。另一种偏差来源是接头连接过程，已知接头末端与miRNA末端的特定序列相比其他序列具有更高的连接效率。为避免此问题，本方案所用接头在每个接头末端引入了4个随机碱基，以防止连接反应中的序列偏好性。此外，当RNA投入量较低时，接头二聚体的形成是另一个常见问题。文库构建试剂盒中已包含若干步骤以减少接头二聚体的产生，例如接头失活以及每次连接反应后通过磁珠纯化去除过量接头。我们还对接头3’和5’端的4N接头进行了稀释 &#188; 以减少可能形成的接头二聚体的量。我们发现，如果不进行稀释，130 bp条带的强度会增加，从而在凝胶上难以与含有目标小RNA文库的150 bp条带区分开来。
目前构建测序文库的另一个挑战是在测序前对产物进行准确定量。我们发现，不同方法对同一文库的定量结果存在差异。建议研究人员采用多种定量方法，以获得更准确的浓度估算。
该方案可广泛应用于遗传学、发育研究或其他从少量细胞中提取RNA的应用场景。该方法通过避免胚胎合并，简化了时间过程研究，并可轻松适用于未分选和已分选的细胞。

发育生物学的一个核心问题是：单个未分化的细胞如何能够发育成具有多种复杂细胞类型的完整生物体。在胚胎发育过程中，随着生物体的发育，细胞的发育潜能逐渐受到限制。神经嵴谱系就是一个典型的例子，它从一种多能性细胞群体逐步分化为多种终末细胞类型，例如外周神经元、胶质细胞、颅骨和软骨。神经嵴细胞在原肠胚形成期间由外胚层特化而来，随后经历上皮-间质转化，并迁移到胚胎体内各个特定位置，在这些位置进行终末分化1。数十年的研究已揭示了调控神经嵴发育的转录基因调控网络，但对于控制神经嵴发育时序的转录后调控机制，目前了解仍十分有限。
既往研究表明，微小RNA（miRNA）通过抑制基因表达来调控正常的发育时序和细胞命运决定2,3,4,5,6。关于miRNA在神经嵴发育中作用的研究主要集中于颅面发育的较晚阶段。例如，miR-17~92和miR-140分别对小鼠和斑马鱼颅面发育过程中的腭形成至关重要7,8。然而，miRNA在胚胎最早期神经嵴命运决定中的作用尚未得到充分研究。由于早期胚胎中细胞数量较少等技术难题，对miRNA在早期命运决定中功能的研究受到限制。
已利用不同分化阶段的类胚体在体外对细胞系中的miRNA进行了谱型分析，以模拟小鼠早期发育过程9。然而，关于小RNA在早期哺乳动物体内发育过程中的研究仍相对有限。以往的miRNA谱型分析方法存在一定的偏差，因为在qPCR、微阵列和Northern印迹等方法中，通常依赖已知序列来分析特定miRNA的表达水平10。新一代测序技术及不断改进的分子工具如今使得对miRNA表达进行相对无偏倚的分析成为可能，从而有助于研究其在早期哺乳动物发育和细胞命运决定中的作用。
本文报道了一种从经历原肠胚形成期（E7.5）至器官发生早期（E9.5）的小鼠胚胎神经嵴细胞中分离并测序小RNA的技术。该技术简便易行，结合了谱系示踪、细胞分选和基于凝胶的大小筛选方法，能够从极少量细胞中制备适用于下一代测序的小RNA测序文库。我们强调，为在胚胎发育早期剧烈变化过程中精确解析6小时时间间隔内的miRNA动态，必须严格匹配体节阶段的胚胎，以获得全面的miRNA表达图谱。该方法可广泛应用于遗传学和发育学研究，并避免了胚胎混合使用。本文还介绍了一种克服现有方法中若干挑战的策略，例如通过基于凝胶的纯化实现miRNA富集、文库定量，以及最大限度减少PCR引入的偏差。该方法已被用于鉴定小鼠胚胎神经嵴谱系中miRNA随时间变化的表达模式，以研究miRNA如何调控发育时序。

<table><tbody><tr><td>#5 镊子 Fine Science Tools</td><td>费舍尔科技</td><td>NC9277114</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>费舍尔科技</td><td>07-202-011</td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>默克米利泊尔 Sigma</td><td>I9516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>5 % Criterion TBE 聚丙烯酰胺凝胶，12+2 孔，45 &amp;micro;L</td><td>伯乐生命医学</td><td>3450047</td><td></td></tr><tr><td>5200 片段分析仪</td><td>安捷伦</td><td>M5310AA</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 PCR 板，高型半裙边透明/透明</td><td>伯乐生命医学</td><td>HSS9601</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>bdbiosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，V 级</td><td>费舍尔科技</td><td>BP1600100</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液 (DPBS)</td><td>Gendepot</td><td>CA008-300</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 管</td><td>费舍尔科技</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>纯乙醇，200 证明无水</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>E7023-500ml</td><td></td></tr><tr><td>FC-404-2001</td><td>因美纳</td><td>FC-404-2001</td><td></td></tr><tr><td>HS NGS 片段试剂盒</td><td>安捷伦</td><td>DNF-474-0500</td><td></td></tr><tr><td>HS RNA 试剂盒</td><td>安捷伦</td><td>DNF-472-0500</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini 试剂盒 (50)</td><td>凯杰</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex 小 RNA 测序试剂盒 v3 (48 条形码)</td><td>费舍尔科技</td><td>NC1289113</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 中等输出试剂盒 v2 (150 个循环)</td><td>因美纳</td><td>FC-404-2001</td><td></td></tr><tr><td>NGS 片段试剂盒</td><td>安捷伦</td><td>DNF-473-1000</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>沃辛顿</td><td>LK003176</td><td>用 5 mL 无钙/镁 PBS 重悬，终浓度为 27 U/mL</td></tr><tr><td>SYBR Gold 核酸凝胶染色剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Trizol LS</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>UVP 台式紫外透射仪：单紫外</td><td>费舍尔科技</td><td>UVP95044701</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 剪刀直型 Fine Science Tools #91500-09</td><td>费舍尔科技</td><td>NC9609583</td><td></td></tr></tbody></table>

从小鼠早期胚胎中制备小rna测序文库

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

microRNA（miRNA）在细胞命运决定和发育时序的复杂调控中具有重要作用。由于细胞数量有限，miRNA在早期发育过程中的功能研究在技术上具有挑战性。此外，许多研究方法（如Northern印迹、微阵列和qPCR）需要预先确定目标miRNA，因此许多miRNA及其异构体在早期发育阶段的表达尚未被系统研究。本文展示了一种对早期小鼠胚胎中分选细胞进行小RNA测序的实验方案，可实现对早期神经嵴细胞群体中miRNA的相对无偏倚表达谱分析。我们通过扩增和基于凝胶的纯化方法，克服了文库构建过程中起始细胞数量少和片段大小选择的技术难题。我们发现胚胎发育年龄是导致重复样本间差异的重要变量，因此在生物学重复实验中必须使用发育阶段匹配的小鼠胚胎。研究结果表明，该方法可广泛应用于其他细胞谱系中miRNA表达谱的分析。总之，该实验方案可用于研究miRNA如何调控早期小鼠胚胎中不同细胞谱系的发育程序。

通过本实验所展示的方法，我们分别在E7.5、E8.5和E9.5阶段收集了胚胎。去除所有胚胎的胚外结构后，对胚胎进行体节分期，以分辨6小时的时间间隔（图1A-1B）。通过主成分分析根据样本相似性进行聚类，我们发现样本按发育年龄聚集，表明胚胎年龄导致显著差异，因此在设置生物学重复时需严格匹配体节阶段（图1C）。我们在E7.5阶段对多能性上胚层进行分析，在E8.5阶段利用Wnt1-Cre示踪迁徙前和迁徙期的神经嵴细胞，在E9.5阶段利用Sox10-Cre示踪迁徙期的神经嵴细胞（图1D）。本研究中，我们通过在耳板上方切除胚胎头部，特异性地分离颅部神经嵴组织。对常用于标记神经嵴细胞的两种Cre驱动小鼠模型（Wnt1和Sox10）进行比较，结果证实它们在早期小鼠胚胎中标记的是不同的细胞群体（图1E）。采用流式分选策略获取活的单个RFP阳性细胞，并直接将其分选至RNA提取裂解液中（见材料表），随后在-80 °C保存（图1F）。记录每个样本中所收获细胞的数量至关重要。
RNA 提取采用改良的 RNA 试剂盒方案进行。具体而言，我们使用应储存于 4 °C这些色谱柱适用于以较小体积进行洗脱（11 µL) 以从细胞投入量有限的样本中获得尽可能高的 RNA 浓度。出于同样原因，在苯酚-氯仿抽提后，完全收集水相至关重要。在收集过程中缓慢移液并倾斜离心管至一侧，对于最大化得率尤为关键。在本实验中，我们采用分光光度计和毛细管电泳两种方法对 RNA 进行定量：分光光度计用于评估盐类/蛋白质污染情况，毛细管电泳用于测定 RNA 浓度（图2）。分光光度计图谱显示，RNA被成功分离，无蛋白质污染，但盐含量较高（图2A-2B）。理想的260/280比值应约为1.8，260/230比值应为 &gt;2.0. 通过分光光度计测得的总RNA产量在E8.5至E9.5期间并未随时间增加。这是由于分光光度计的分辨率不足以检测我们所收获细胞数量对应的RNA浓度变化，因此我们建议使用毛细管电泳所获得的浓度信息图2C）。毛细管电泳图谱可用于估算RNA片段的浓度和大小。峰 &lt;1000个核苷酸的峰提示存在降解。代表性图谱显示RNA未发生降解。2000个核苷酸和5100个核苷酸处的峰分别为18S和28S rRNA。小RNA区域位于约150个核苷酸处。图 2D).
使用文中所述的小RNA文库构建试剂盒制备小RNA测序文库 材料表此处我们使用了每个样本所获RNA略少于一半的量4 µL 的 11 µL 洗脱，约80–120 ng），可用于从每个样本剩余的RNA合成RNA测序文库。此处我们将3’和5’小RNA接头稀释至1/4，以减少接头二聚体的含量，并建议尽可能连续完成接头连接、纯化及反转录步骤。我们使用了16个PCR循环来扩增文库，建议针对任何实验的PCR循环数应通过实验确定最小所需值。若进行过多的PCR循环，可能导致低表达miRNA的读段数被人为放大。
大小选择对于富集miRNA文库而非通常存在的接头二聚体至关重要。文库产物（150 bp）与接头二聚体（130 bp）的大小非常接近。采用凝胶回收方法将小RNA测序文库与接头二聚体分离（图3）。在切胶前的PAGE凝胶图像显示，每个样本中均存在多种不同大小的产物（图3A）。在加样时，任意两个样本之间或样本与DNA标记物之间应至少留出一个空泳道。凝胶底部的迁移前沿略呈弯曲状，表明如果所有样本中150 bp条带难以分辨，则可能需要降低电泳速度。该代表性图像还显示，作为阳性对照的高浓度RNA（来自大鼠脑组织的总RNA）在文库构建中产生的150 bp产物明显多于各胚胎样本。阴性对照表明所用试剂中无外源核酸污染（图3A）。应使用洁净的剃刀切割150 bp条带，所收集区域如图3B所示。毛细管电泳图谱在大小选择前后对比显示，经凝胶纯化后150 bp文库产物的纯度显著提高（图3C-3D）。需要注意的是，图3C-3D中的图谱显示样本峰高于标记物峰，提示存在上样过载。在此类情况下，片段大小测定仍可准确，但浓度可能不准确。可通过将文库稀释至标记物检测范围内或采用其他方法进行定量。我们发现不同文库定量方法之间存在一定差异，建议对多种定量方法进行实证测试。在最大化单次测序样本数量时，准确的浓度定量尤为关键。文库将被稀释至1.3 pM用于测序，通常在一套提供约1.4亿条读长的150个循环测序试剂盒上，可同时对15–25个样本进行测序，每样本获得约500万条读长。通常比对率在60–80%之间。
<img alt="胚胎发育阶段；基因表达数据、方差图、流式细胞术图谱。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61086/61086fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：从小鼠胚胎中分离细胞用于小RNA测序。（A）E8.5小鼠胚胎，显示去除卵黄囊和体节，用于确定胚胎发育阶段（B）小鼠胚胎体节分期，以捕捉神经嵴发育的不同阶段（C）由分选的野生型神经嵴细胞构建的文库进行主成分分析，结果显示样本按年龄聚类（D）示意图显示在E8.5使用Wnt1-Cre标记迁移前和迁移中的神经嵴细胞，而在E9.5使用Sox10-Cre仅标记迁移中的神经嵴细胞（E）由分选的野生型神经嵴细胞构建的文库进行主成分分析，结果显示样本按Cre驱动子类型聚类，与年龄无关（F）利用FACS分选从E8.5和E9.5胚胎中分离RFP+神经嵴细胞的设门策略。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61086/61086fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="分光光度法分析；吸光度图、RNA纯度表格、电泳结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61086/61086fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：从小鼠E7.5-E9.5胚胎中分离RNA。（A）采用本实验方案所处理的最年轻阶段胚胎RNA提取物的代表性分光光度计图谱。（B）显示分光光度计测得RNA质量代表性数值的表格。（C）从各年龄段胚胎中分选的神经嵴细胞所提取RNA的示例。（D）毛细管电泳图谱，显示高质量RNA。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61086/61086fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="片段分离与定量的凝胶电泳结果及DNA大小分析图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61086/61086fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：大小选择前后的miRNA文库。（A）TBE-聚丙烯酰胺凝胶电泳（TBE-PAGE）图显示四个样本及对照在150 bp条带切除前的代表性小RNA文库；（B）切除150 bp条带后的文库。（箭头指示需切除的150 bp条带）（C）大小选择前和（D）大小选择后的小RNA文库毛细管电泳图谱。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61086/61086fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们介绍一种用于分析小鼠早期胚胎中microRNA表达谱的技术。该方案克服了细胞起始量少以及小RNA富集困难的挑战。本检测方法可用于分析小鼠早期胚胎不同细胞谱系中miRNA表达随时间的变化。

从小鼠早期胚胎中制备小RNA测序文库

microRNAs（miRNAs）在细胞命运决定和发育时序的复杂调控中具有重要作用。miRNAs 功能的体内研究……

本方案旨在简化从早期胚胎中制备低起始量的小RNA测序文库，以准确分析调控胚胎发育的微小RNA（microRNA）。该技术的优势在于无需合并低起始量样本，且可轻松应用于未分选和已分选的细胞。我们还展示了精确的胚胎分期方法，以避免重复样本之间的变异。该方法可应用于时间、遗传和发育研究，或其他输入RNA浓度较低的情况。未来，该方法有望用于诊断微小RNA表达失调的发育障碍疾病。本实验方案中技术难度最高的步骤是胚胎解剖。由于每个胚胎都必须经过解剖、分期、成像，然后迅速解离，以确保细胞活性。解剖胚胎时，用 PBS 冲洗怀孕雌鼠的子宫，并将其置于无菌的 10 厘米塑料培养皿中。使用显微解剖剪分离含有蜕膜的区域，并剥除子宫肌层以暴露所有蜕膜。解剖胚胎时，用 PBS 冲洗怀孕雌性小鼠的子宫，并将其置于无菌的 10 厘米塑料培养皿中。使用显微解剖剪分离含有蜕膜的区域。将所有胚胎转移至另一含有洁净 PBS 的培养皿中，并对整窝胚胎拍摄图像。随后分别对每个胚胎进行成像，并计数体节的数量，实验间保持放大倍数和曝光条件一致。对于发育阶段晚于E8.0的胚胎，在耳基板上方切除头部，并将头部分装至48孔板中的一个洁净孔内。向孔中加入250 µL木瓜蛋白酶溶液，并轻轻吹打混匀。使用显微镜检查是否存在细胞团块，并反复吹打直至获得单细胞悬液。然后向细胞中加入 250 µL FBS，取 500 µL 悬液通过 35 µm 尼龙滤网过滤。将滤液转移至新的 1.5 mL 离心管中，在 200 × g 条件下离心 5 分钟。将上清液转移至新离心管中，用含BSA的300 µL PBS重悬细胞沉淀。准备分选时，再次通过带滤膜的离心管过滤细胞，并加入DAPI以标记活细胞。使用配备70 µm喷嘴的细胞分选仪，将每个样品分选至含有500 µL RNA提取裂解液的收集管中，随后混匀样本并置于-80 °C保存。向每个样品中加入5 µL 6X上样染料，用移液器吹打混匀。将样品上样至6% TBE聚丙烯酰胺凝胶，从第一孔开始依次上样，每份样品之间留出一个泳道。在0.5X TBE电泳缓冲液中，以150伏电压电泳30至40分钟。当凝胶电泳完成后，小心地将其从玻璃板上取下，并放入原包装中的托盘内，注意保持方向。移除电泳缓冲液，将凝胶染色15分钟，然后在紫外透射仪上成像。识别位于150个碱基对的条带，并使用干净的剃须刀片将其切下，注意避免切到位于130个碱基对的接头二聚体产物。将凝胶切片放入微量离心管中，并以最大速度离心30秒。接下来，使用 P200 吸头将凝胶切片尽可能碾碎，并将吸头弃入离心管中。向每根离心管中加入 300 µL 洗脱缓冲液，冲洗管壁上的凝胶碎片。重新安装移液器吸头，将其冲洗干净后再从管中取出。将样品在 25 摄氏度、1,000 RPM 振荡条件下孵育过夜。第二天，以最大速度离心 10 分钟，将上清液转移至无 RNase 的 96 孔板中。向每个样品中加入 50 µL 纯化磁珠，用移液器吹打混匀。然后加入 350 µL 异丙醇，混匀样品，并在室温下轻轻振荡孵育 10 分钟。孵育结束后，离心收集样品并置于磁力架上磁吸附 2 分钟。弃去上清液，用 950 µL 80% 乙醇洗涤磁珠 30 秒。将样品干燥三分钟，然后去除孔底部的所有残留液体。将反应板从磁力架上取下，并用13 µL重悬缓冲液重悬磁珠。将培养板孵育两分钟，然后转移回磁力架上静置三分钟。取12 µL上清液转移至洁净离心管中，于4 °C过夜保存，或于-20 °C长期保存。收集了E7.5、E8.5和E9.5时期的胚胎。体节分期用于确定六小时的时间间隔。当使用主成分分析根据样本相似性进行聚类时，发现样本按年龄聚集。在E8.5阶段用Wnt1-Cre标记了迁徙前和迁徙中的神经嵴细胞，在E9.5阶段用Sox10-Cre进行了标记。两种CRE驱动元件的比较证实，它们在小鼠早期胚胎中标记了不同的细胞群体。采用分光光度计和毛细管电泳对RNA进行了定量。分光光度计检测结果显示，RNA不含污染性蛋白质且细胞浓度较高，但其灵敏度不足以检测RNA浓度随年龄发生的变化。毛细管电泳图谱可用于估算RNA片段的浓度和大小。位于2,000和5,100个核苷酸处的峰分别为18S和28S核糖体RNA，而小RNA区域则位于约150个核苷酸处。凝胶回收可用于将小RNA测序文库与接头引物分离。在切胶前，每个样本中存在多种不同大小的产物。毛细管电泳图谱在大小选择前后显示，经过凝胶纯化后，150个碱基对文库产物的纯度显著提高。我们设计了本实验方案，将单个样本的RNA制备物分成两部分，分别构建小RNA测序文库和总mRNA测序文库。该方法不仅可用于研究microRNA的表达情况，还可探究这些表达的microRNA可能调控的mRNA靶标。通过该技术，我们能够全面了解从原肠胚形成期到神经管闭合期颅神经嵴细胞中高表达的microRNA及其靶基因的调控情况。

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科研

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