从小鼠早期胚胎中制备小RNA测序文库
2020年10月9日
我们介绍一种用于分析小鼠早期胚胎中microRNA表达谱的技术。该方案克服了细胞起始量少以及小RNA富集困难的挑战。本检测方法可用于分析小鼠早期胚胎不同细胞谱系中miRNA表达随时间的变化。
本方案旨在简化从早期胚胎中制备低起始量的小RNA测序文库，以准确分析调控胚胎发育的微小RNA（microRNA）。该技术的优势在于无需合并低起始量样本，且可轻松应用于未分选和已分选的细胞。我们还展示了精确的胚胎分期方法，以避免重复样本之间的变异。
该方法可应用于时间、遗传和发育研究，或其他输入RNA浓度较低的情况。未来，该方法有望用于诊断微小RNA表达失调的发育障碍疾病。本实验方案中技术难度最高的步骤是胚胎解剖。
由于每个胚胎都必须经过解剖、分期、成像，然后迅速解离，以确保细胞活性。解剖胚胎时，用 PBS 冲洗怀孕雌鼠的子宫，并将其置于无菌的 10 厘米塑料培养皿中。使用显微解剖剪分离含有蜕膜的区域，并剥除子宫肌层以暴露所有蜕膜。
解剖胚胎时，用 PBS 冲洗怀孕雌性小鼠的子宫，并将其置于无菌的 10 厘米塑料培养皿中。使用显微解剖剪分离含有蜕膜的区域。将所有胚胎转移至另一含有洁净 PBS 的培养皿中，并对整窝胚胎拍摄图像。
随后分别对每个胚胎进行成像，并计数体节的数量，实验间保持放大倍数和曝光条件一致。对于发育阶段晚于E8.0的胚胎，在耳基板上方切除头部，并将头部分装至48孔板中的一个洁净孔内。向孔中加入250 µL木瓜蛋白酶溶液，并轻轻吹打混匀。
使用显微镜检查是否存在细胞团块，并反复吹打直至获得单细胞悬液。然后向细胞中加入 250 µL FBS，取 500 µL 悬液通过 35 µm 尼龙滤网过滤。将滤液转移至新的 1.5 mL 离心管中，在 200 × g 条件下离心 5 分钟。
将上清液转移至新离心管中，用含BSA的300 µL PBS重悬细胞沉淀。准备分选时，再次通过带滤膜的离心管过滤细胞，并加入DAPI以标记活细胞。使用配备70 µm喷嘴的细胞分选仪，将每个样品分选至含有500 µL RNA提取裂解液的收集管中，随后混匀样本并置于-80 °C保存。
向每个样品中加入5 µL 6X上样染料，用移液器吹打混匀。将样品上样至6% TBE聚丙烯酰胺凝胶，从第一孔开始依次上样，每份样品之间留出一个泳道。在0.5X TBE电泳缓冲液中，以150伏电压电泳30至40分钟。
当凝胶电泳完成后，小心地将其从玻璃板上取下，并放入原包装中的托盘内，注意保持方向。移除电泳缓冲液，将凝胶染色15分钟，然后在紫外透射仪上成像。
识别位于150个碱基对的条带，并使用干净的剃须刀片将其切下，注意避免切到位于130个碱基对的接头二聚体产物。将凝胶切片放入微量离心管中，并以最大速度离心30秒。
接下来，使用 P200 吸头将凝胶切片尽可能碾碎，并将吸头弃入离心管中。向每根离心管中加入 300 µL 洗脱缓冲液，冲洗管壁上的凝胶碎片。重新安装移液器吸头，将其冲洗干净后再从管中取出。
将样品在 25 摄氏度、1,000 RPM 振荡条件下孵育过夜。第二天，以最大速度离心 10 分钟，将上清液转移至无 RNase 的 96 孔板中。向每个样品中加入 50 µL 纯化磁珠，用移液器吹打混匀。
然后加入 350 µL 异丙醇，混匀样品，并在室温下轻轻振荡孵育 10 分钟。孵育结束后，离心收集样品并置于磁力架上磁吸附 2 分钟。弃去上清液，用 950 µL 80% 乙醇洗涤磁珠 30 秒。
将样品干燥三分钟，然后去除孔底部的所有残留液体。将反应板从磁力架上取下，并用13 µL重悬缓冲液重悬磁珠。
将培养板孵育两分钟，然后转移回磁力架上静置三分钟。取12 µL上清液转移至洁净离心管中，于4 °C过夜保存，或于-20 °C长期保存。收集了E7.5、E8.5和E9.5时期的胚胎。
体节分期用于确定六小时的时间间隔。当使用主成分分析根据样本相似性进行聚类时，发现样本按年龄聚集。在E8.5阶段用Wnt1-Cre标记了迁徙前和迁徙中的神经嵴细胞，在E9.5阶段用Sox10-Cre进行了标记。
两种CRE驱动元件的比较证实，它们在小鼠早期胚胎中标记了不同的细胞群体。采用分光光度计和毛细管电泳对RNA进行了定量。分光光度计检测结果显示，RNA不含污染性蛋白质且细胞浓度较高，但其灵敏度不足以检测RNA浓度随年龄发生的变化。
毛细管电泳图谱可用于估算RNA片段的浓度和大小。位于2,000和5,100个核苷酸处的峰分别为18S和28S核糖体RNA，而小RNA区域则位于约150个核苷酸处。
凝胶回收可用于将小RNA测序文库与接头引物分离。在切胶前，每个样本中存在多种不同大小的产物。毛细管电泳图谱在大小选择前后显示，经过凝胶纯化后，150个碱基对文库产物的纯度显著提高。
我们设计了本实验方案，将单个样本的RNA制备物分成两部分，分别构建小RNA测序文库和总mRNA测序文库。该方法不仅可用于研究microRNA的表达情况，还可探究这些表达的microRNA可能调控的mRNA靶标。通过该技术，我们能够全面了解从原肠胚形成期到神经管闭合期颅神经嵴细胞中高表达的microRNA及其靶基因的调控情况。
概述
本方案描述了一种用于分析小鼠早期胚胎中微小RNA（microRNA）表达谱的技术，解决了因起始细胞数量少以及小RNA富集困难所带来的挑战。该技术可实现对不同时期多种细胞谱系中miRNA表达变化的分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 基因组学
背景
- microRNA 在胚胎发育过程中发挥着关键作用。
- 由于早期胚胎中 RNA 起始量低，对 microRNA 进行表达谱分析在技术上具有挑战性。
- 现有方法通常需要合并样本，这可能会掩盖个体差异。
- 准确的表达谱分析对于理解发育过程及相关疾病至关重要。
研究目的
- 简化从小鼠早期胚胎制备小RNA测序文库的流程。
- 在无需混合低起始量样本的情况下对微小RNA进行表达谱分析。
- 促进对胚胎中时间动态、遗传及发育变化的研究。
使用的方法
- 胚胎解剖与分期，以确保一致性。
- 制备单细胞悬液用于RNA提取。
- 凝胶回收以分离小RNA测序文库。
- 毛细管电泳用于RNA定量与片段大小评估。
主要结果
- 使用主成分分析进行分析时，样本按年龄聚集。
- 利用特异性的 CRE 驱动元件鉴定了不同群体的神经嵴细胞。
- 毛细管电泳确认了 RNA 样本的纯度和浓度。
- 凝胶纯化提高了小 RNA 文库的质量。
结论
- 该方案可有效分析小鼠早期胚胎中的微小RNA（microRNA）。
- 可应用于多种发育生物学研究及潜在的诊断用途。
- 未来应用可能包括探究与微小RNA失调相关的发育障碍。
常见问题
行业重要性概述
对小鼠早期胚胎中的microRNA进行精确分析，有助于解决理解早期发育过程中基因调控的关键瓶颈，特别是在细胞输入量较低的情况下。本方案能够从分选或未分选的胚胎细胞中无偏倚地构建小RNA文库，支持发育生物学研究中的预测可信度及靶点验证。其可重复性和可扩展性使其成为早期发现和转化研究流程中可重复使用的技术手段。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在早期发育阶段全面解析miRNA介导的调控通路。
- 通过在无需预先定义靶标的情况下对miRNA表达进行谱型分析，支持功能靶标的验证。
- 通过解析细胞谱系特异性的miRNA表达谱，有助于阐明作用机制并降低研发风险。
- 提高对发育相关基因调控假说的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 制备经过验证的小RNA文库，适用于下游测序和分析流程。
- 标准化样本制备和片段大小选择，提高重复样本间的可重复性。
- 提供miRNA丰度和异构体多样性的定量结果。
- 可在低起始量或稀有细胞群体中实现对miRNA表达的可靠评估。
转化与临床前研究
- 将miRNA表达谱分析与疾病相关的发育模型相结合，推动转化生物标志物的发现。
- 支持从miRNA功能的早期发现到临床前验证的连续性研究。
- 提供经风险校正的数据，助力发育生物学项目的推进。
- 促进对发育障碍中miRNA失调机制的深入研究。
流程与工作流整合
该方案可融入从早期假设验证到临床前研究的整个发现过程，能够在低样本量的发育系统中实现稳健的miRNA表达谱分析。
- 发现生物学：通过实现无偏倚的miRNA表达分析，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可重复、定量的小RNA文库，适用于基于测序的检测。
- 分析：提供毛细管电泳和基于凝胶的读出方式，用于文库质量控制和片段大小选择。
- 转化研究：将miRNA表达数据与发育阶段和细胞谱系相关联，支持生物标志物的比对。
- 企业级复用：提供标准化的工作流程，可适应多种细胞类型和发育背景。
运营与企业影响
- 科学价值：提高发育基因调控研究中预测的可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：通过增强低起始量RNA工作流程的标准化、可重复性和可扩展性，提升实验效率。
- 战略价值：通过实现稳健的早期数据生成，优化决策流程，提高资本使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的发育与遗传研究项目的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备胚胎解剖、分期及单细胞制备方面的专业知识。
- 需要具备细胞分选、凝胶电泳和毛细管电泳仪器的使用条件。
- 要求跨团队在样本处理和文库制备方面进行严格标准化。
- 通过调整实验方案，可适用于不同的发育阶段和细胞谱系。
- 受限于胚胎操作中的技术难题以及低RNA起始量的检测灵敏度。
