Name: 由上皮细胞和原发免疫细胞组成的多细胞人类Alveal模型，用于危险评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 了解如何利用原代人血单核细胞分化为巨噬细胞和树突状细胞，并与上皮细胞共培养构建多细胞人肺模型，用于评估促炎刺激下的免疫反应及急性免疫应答。

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作者谨此感谢 Miguel Spuch-Calvar 博士提供图3中的共培养方案，以及 Bedia Begum Karakocak 博士对本文的审阅。本研究由 PATROLS 项目、欧盟“地平线2020”研究与创新计划（资助协议编号 760813）以及阿道夫·米尔克基金会资助。B.D. 感谢 Peter und Traudl Engelhorn 基金会提供的资金支持。

作者无任何利益冲突需要披露。

新型材料（包括化学品和药物）的不断涌现，逐渐增加了对可预测的体外模型的需求。为了遵循动物实验的“替代、减少和优化”三项原则32，体外细胞模型已成为在替代和减少动物使用方面阐明药物或材料作用机制的有力工具8,9,10,11。本文介绍了一种利用新鲜分离或从先前冷冻的单核细胞解冻后获得的免疫细胞组装多细胞模型的详细方案。同时描述了该模型在气液界面（ALI）条件下的培养方法。最后，本方案展示了对促炎刺激物暴露的一个示例，并比较了包含新鲜单核细胞与冷冻单核细胞的两种模型的反应差异。
已有多种研究证实并论证了在气液界面（ALI）条件下培养和暴露的模型相较于传统的浸没式暴露模型所增加的复杂性具有更高的价值7,22,31。与单一种类的上皮细胞培养相比，共培养体系中观察到更强的促炎反应，这一结果与先前的研究一致。该研究采用了本文所述的共培养模型（以LPS刺激），结果显示TNF和IL1B基因表达水平均高于相应的A549单层培养模型7。另一方面，两种共培养模型在促炎介质释放水平上的个体差异均大于A549单层培养。这一现象可通过生物学重复中使用了来自不同供体（血沉棕黄层）的免疫细胞来解释（即每次重复使用一位供体），这一点此前已有报道7。如有需要，可通过以下方式减少重复实验间的变异：1）使用来自同一供体的冻存外周血单个核细胞（PBMs），或 2）在冻存前将来自不同供体的PBMs混合成细胞池，随后在每次重复实验中使用同一细胞池。同时建议增加生物学重复次数。
细胞冻存技术可被视为一个关键步骤，但其同时也是实验室中用于保存细胞以进行表型和功能分析的常规操作。多项研究已表明，冻存外周血单个核细胞（PBMs）的质量对其存活至关重要，而合适的冻存技术是后续使用这些细胞进行实验成功的关键28,32。通过冻存PBMs可对实验方案进行调整，从而在实验设计上提供更大的灵活性，因为血沉棕黄层（buffy coats）的可获得性通常有限。与新鲜分离的PBMs相比，使用冻存PBMs（分装于多个冻存管中）的另一优势在于，即使在冻存1年后仍可用于后续实验。如果实验中需要或要求控制供体间变异这一参数，则使用冻存样本可显著降低供体间差异带来的潜在问题。
一项在长达13个月后开展的实验室间比较结果显示，外周血单个核细胞（PBMs）在液氮罐中妥善保存后，可在较长时间内使用，且对细胞活力或细胞回收率无任何影响33。若在实验前对细胞活力和细胞应答能力进行严格验证，则更长的保存时间（超过1年）也可能实现。此外，液氮罐内的温度必须始终保持稳定。研究发现，影响冻存PBMs活力的主要因素是二甲基亚砜（DMSO）浓度，其最佳浓度范围为10%–20%（v/v）28。为最大限度减少冷冻可能带来的有害影响，通常会在冻存液中添加不同来源的蛋白质，如胎牛血清（FBS）或牛血清白蛋白（BSA），作为天然保护成分，以提高细胞存活率，其浓度范围较广，从40%到100%不等34。
由于DMSO具有较高的细胞毒性，建议首先将外周血单个核细胞（PBMs）分散于胎牛血清（FBS）中，然后再将DMSO加入已分散在FBS中的PBMs。值得注意的是，尽管较高的FBS浓度（&#62;40%）并未显示出对细胞活力的进一步改善，但同时也不会对细胞造成损害28。尽管如此，冷冻保存单核细胞仍是一种可行的策略，可用于应对血沉棕黄层供应有限的问题。然而，若实验需要使用新鲜PBMs来源的单核细胞衍生树突状细胞（MDDCs）和单核细胞衍生巨噬细胞（MDMs），则可在分离后5–8天进行免疫细胞的分化与使用7,16,17,35,36,37。如果实验设计允许，建议MDDCs和MDMs均至少进行6天的分化。然而，同一实验中不同重复之间的操作一致性，以及对其特异性表面标志物表达的常规检测至关重要。此外，应在分化完成后定期检测细胞对促炎刺激（如LPS）的反应能力。
已有多项研究在气液界面（ALI）条件下使用A549细胞系，既可作为单一代谢培养，也可与其他细胞类型（如巨噬细胞、树突状细胞或成纤维细胞）共同构建三维共培养模型。22,24,29,38. 利用该三维共培养模型，可检测细胞毒性、氧化应激或促炎效应&#160;（纳米）材料已进行了长达72小时的研究&#160;h1,17,21,24,29该模型与体内组织的相似性此前已通过模型的共聚焦激光扫描成像进行过研究16在构建模型时，需要同时考虑细胞增殖（可能影响本模型中的A549细胞）以及原代非增殖性免疫细胞（此处为MDDCs和MDMs）的功能表现。还需注意，并非所有CD14阳性单核细胞均能分化为MDDCs和MDMs，且这些细胞可能以贴壁和悬浮两种形式存在。鉴于共培养体系的特性（此处要求两种细胞均需贴附于已形成的上皮层），建议仅使用两种免疫细胞中的贴壁亚群。此外，常规对单核细胞、MDDC和MDM在LPS刺激下的单培养反应性以及特定表面标志物（CD14、CD163、CD86、CD93或CD206，数据未显示）表达的分析结果表明，6天和7天的分化时间是最佳时间点。
尽管人体肺部肺泡上皮细胞的实际数量约为 ~160,000 个细胞/cm2，但在插入式培养 9 天后，模型中计数的 A549 细胞数量约为 ~1,000,000 个细胞/cm216,18。因此，需要考虑该体外模型的局限性。首先，上皮细胞的密度是根据其在生长膜上形成融合单层的能力确定的。还需要指出的是，A549 细胞代表一种立方形的 II 型肺泡上皮细胞，与扁平铺展的 I 型肺泡上皮细胞不同。另一方面，本实验方案中免疫细胞所需数量是基于文献报道确定的，并以细胞数/表面积的形式呈现39,40,41。该模型中 MDDC 的细胞密度为 400 个细胞/mm2（4 个细胞/cm2）16，与体内研究报道的稳态密度 500–750 个细胞/mm2（5–7 个细胞/cm2）相当39。该模型中 MDM 的密度也处于人体肺泡区域体内情况的相同范围内40。
在顶端（MDMs 所在位置）和基底端（即树突状细胞所在位置）均观察到成熟巨噬细胞标志物（25F9）的染色。免疫细胞通过膜插件孔隙发生转位是可能的，使用该模型也已观察到这一现象16，这或许可以解释染色强度的差异。然而，另一种可能的解释是，成熟巨噬细胞标志物也可能在树突状细胞上表达，但其表达具有高度供体特异性42。此外，25F9&#160;在 MDMs 中的表达强度明显更高（图 7、图 8）。两种促炎刺激物（LPS 和 TNF-α）均影响了两种共培养体系中肺上皮屏障的完整性（图 7、图 8）。这与既往研究结果一致43,44，表明促炎性细胞因子和细菌产物可破坏上皮屏障的完整性。
先前已建立并表征了人肺泡上皮的三维多细胞模型17，该模型已被证明是一种强大且有用的工具，可用于体外评估生物学反应（即急性促炎反应、氧化应激反应、颗粒物分布及细胞间通讯）21,24,25,45。实验结果证实，共培养模型对促炎刺激物（此处为LPS和TNF-α）具有响应性。当使用来自新鲜外周血单核细胞（PBMs）的免疫细胞时，其反应略有增强；然而，使用新鲜与冻存解冻后PBMs的共培养模型之间并无统计学上的显著差异。此外，在相同气液界面（ALI）条件下培养时，两种共培养模型的促炎反应均高于单层上皮细胞培养。综上所述，本方案描述了一种利用新鲜或冻存解冻后的PBMs分化为MDMs和MDDCs，构建三维人肺泡上皮组织共培养模型的方法。研究表明，这两种模型均对促炎刺激物具有高度响应性，因此可作为潜在危害和毒性评估的有力工具。

体外肺细胞培养为评估气溶胶危害提供了经济高效、稳健且高度可控的平台1。作为人肺泡上皮细胞的模型细胞系统，常使用源自肺腺癌的上皮细胞系A5492。这些细胞代表肺泡区域的鳞状II型上皮细胞3，是广泛用于危害和毒性评估的肺细胞系1,4,5,6,7,8,9,10。A549细胞系具有肺泡上皮II型细胞的相关特征，例如含有致密排列磷脂的特征性板层小体3。
研究表明，当细胞在气液界面（ALI）培养时，表面活性物质会释放到暴露于空气的上皮细胞的顶侧，从而降低表面张力11,12,13。这一特性在纳米材料呼吸危害和毒性研究中尤为重要。吸入的纳米材料/毒物一旦沉积在肺泡区域，首先与肺表面活性物质相互作用，并在润湿力的作用下被置换至水性亚相层，在此与肺部细胞发生相互作用14,15。尽管A549细胞可形成单层（在ALI条件下长期培养时可增殖为多层）并产生表面活性物质，但其不足之处在于紧密连接形成不充分，导致跨上皮电阻值较低，但仍具备&#160;一定的功能屏障作用，可阻止细胞间（纳米）颗粒的转位16,17,18。
在肺脏中存在多种免疫细胞群体，包括吞噬性细胞和专职抗原提呈细胞（即巨噬细胞和树突状细胞），这些细胞通过细胞间直接接触或细胞间信号传导相互交流，以调控并维持内环境稳态。巨噬细胞和树突状细胞是先天免疫的关键效应细胞，也是启动适应性免疫应答的重要始动者19。位于上皮层内或其下方的树突状细胞可形成穿过上皮层伸向管腔的突起，以捕获抗原。肺泡巨噬细胞位于上皮细胞的顶面，作为哨兵细胞，构成抵御外来物质以及细菌、病毒和真菌感染的第一道细胞防线。其表型可塑性使其能够迅速响应刺激，诱导促炎反应，同时也可转变为触发抗炎（即抑制性）反应的状态20。
为了模拟人体肺泡上皮组织屏障，我们建立了一种三重共培养模型，在该模型中，A549细胞的顶侧和基底侧分别添加了人外周血单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）和树突状细胞（MDDCs）17。该模型在气液界面（ALI）条件下的培养已有先前报道16，甚至可在暴露后持续培养长达72小时21。与浸没式培养条件相比，在ALI条件下暴露于碳纳米管后，细胞培养物的急性免疫反应显著增强22。该共培养模型在气液界面（ALI）中培养并暴露于不同材料，已被用于研究暴露于氧化锌23、石墨烯相关材料24、金纳米颗粒25,26、碳纳米管21以及火山灰和柴油机尾气颗粒物27时的细胞毒性、氧化应激和炎症反应。
此外，已证实巨噬细胞和树突状细胞作为免疫效应细胞在体外人肺模型中的重要作用。特别是与单层培养系统相比，仅在存在免疫细胞的情况下，该模型中才观察到增强的促炎反应7。使用原代单核细胞来源免疫细胞的潜在缺点包括外周血单个核细胞（PBMs）获取受限以及供体间变异。为解决这些潜在问题，本文提出了一种方案，即对 freshly isolated PBMs28 进行冷冻保存，用于细胞培养模型的构建。本研究旨在展示三维人肺泡上皮组织模型的构建过程，包括从人血沉棕黄层中分离 PBMs。同时比较该模型对促炎刺激的反应性，模型所用细胞包括由新鲜 PBMs 分化而来的 MDMs 和 MDDCs，或由冻存/解冻 PBMs 分化而来的 MDMs 和 MDDCs。
处理未经检测的人类血液样本时需采取特定防护措施，以防止潜在的传染性疾病传播，例如人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎和丙型肝炎。因此，必须采取个人防护措施，如佩戴手套、防护服、口罩和眼部保护装置，并严格遵守良好实验室规范原则。这些防护措施可降低皮肤或黏膜接触潜在感染性液体的风险。此外，对于涉及处理血沉棕黄层和外周血单个核细胞（PBMs）的人员，必须接种乙型肝炎病毒疫苗，且抗乙型肝炎抗体的血清滴度水平须高于100 IU/L（需符合所在国家的具体法律法规要求）。同时，所有操作必须在生物安全二级实验室中进行（需符合所在国家的具体法律法规要求）。在实施整个实验方案过程中，应遵循实验室环境中操作哺乳动物细胞培养相关的标准健康与安全预防措施，包括废弃物的处理。

<table><tbody><tr><td>基准微孔板读数仪</td><td>无需特定型号，例如 BioRad，Cressier，瑞士</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>无需特定型号</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞冻存容器（例如 Mr. Frosty）</td><td>无需特定型号</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>无需特定型号</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>无需特定型号，例如</td><td>Zeiss LSM 710 meta</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板或自动细胞计数仪</td><td>无需特定型号</td><td></td><td></td></tr><tr><td>II 级层流生物安全柜</td><td>无需特定型号</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiStand Macs（Macs 细胞分离器）</td><td>Miltenyi，德国</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>pH 计</td><td>无需特定型号</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置相差光学显微镜</td><td>无需特定型号</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器助吸器、移液枪（不同体积）</td><td>无需特定型号</td><td></td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>无需特定型号</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>无需特定型号</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>无需特定型号</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;一次性小型设备/玻璃器皿&lt;/strong&gt;</td><td></td><td>货号</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 和 50 mL 锥形离心管</td><td>无需特定型号</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 孔和 12 孔细胞培养板，平底，低蒸发盖，无菌</td><td>Falcon，瑞士</td><td>353046 和 353043</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养小室，透明 PET 膜，12 孔，3 &amp;mu;m 孔径</td><td>Falcon，瑞士</td><td>353181</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>无需特定型号，例如 VWR，瑞士</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>无需特定型号</td><td></td><td></td></tr><tr><td>经高压灭菌的玻璃培养皿</td><td>无需特定型号</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi，德国</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>用于真空过滤的无菌过滤杯，0.2 &amp;mu;m 孔径</td><td>无需特定型号，例如 VWR，瑞士</td><td>10040-446</td><td></td></tr><tr><td>与过滤杯兼容的无菌实验室瓶（最小 100 mL）</td><td>无需特定型号</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌移液管</td><td>无需特定型号</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich，瑞士</td><td>A7030-100g</td><td></td></tr><tr><td>CD14+ MicroBeads 人源磁珠</td><td>Miltenyi，德国</td><td>130-097-052</td><td></td></tr><tr><td>解离试剂胰蛋白酶-EDTA，0.05%，含酚红</td><td>Gibco，瑞士</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>密度梯度介质 Lymphoprep</td><td>Alere Technologies AS，挪威</td><td>1114547</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma Aldrich，瑞士</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich，瑞士</td><td>E6758-100g</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（热灭活）</td><td>Gibco，瑞士</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），优质级</td><td>Miltenyi，德国</td><td>130-093-864</td><td></td></tr><tr><td>人白细胞介素 4（IL-4），优质级</td><td>Miltenyi，德国</td><td>130-095-373</td><td></td></tr><tr><td>人巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），优质级</td><td>Miltenyi，德国</td><td>130-096-485</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco，瑞士</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>来自大肠杆菌的脂多糖（LPS）</td><td>Sigma-Aldrich，瑞士</td><td>4524-5mg</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich，瑞士</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco，瑞士</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco，瑞士</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>罗斯韦尔帕克纪念研究所-1640 培养基（RPMI）</td><td>Gibco，瑞士</td><td>42401-018</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>Sigma-Aldrich，瑞士</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液（0.4%）</td><td>Sigma Aldrich，瑞士</td><td></td><td></td></tr><tr><td>肿瘤坏死因子 α（TNF-&amp;alpha;）</td><td>Immunotools</td><td>11343015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;用于细胞毒性及（前）炎症反应检测的检测试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞毒性检测试剂盒（LDH）</td><td>Roche，瑞士</td><td>11644793001</td><td></td></tr><tr><td>人 IL-6 DuoSet ELISA</td><td>R&amp;D，Biotechne，瑞士</td><td>DY206</td><td></td></tr><tr><td>人 IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA</td><td>R&amp;D，Biotechne，瑞士</td><td>DY208</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;免疫染色&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），浓度 2 &amp;mu;g/mL</td><td>Sigma-Aldrich，瑞士</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG（H+L）Alexa Fluor 647 标记，浓度 20 &amp;mu;g/mL</td><td>Abcam，英国</td><td>ab150115</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG 抗体（H+L）Dylight 488 标记，浓度 10 &amp;mu;g/mL</td><td>Agrisera，瑞典</td><td>AS09 633</td><td></td></tr><tr><td>成熟巨噬细胞标志物单克隆抗体，浓度 50 &amp;mu;g/mL</td><td>eBioScience，Thermo Fischer，瑞士</td><td>14-0115-82</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明标记鬼笔环肽，浓度 0.264 &amp;micro;M</td><td>Molecular Probes，Life Technologies，瑞士</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>重组抗 CD83 抗体，1:50 稀释</td><td>Abcam，英国</td><td>ab244204</td><td></td></tr></tbody></table>

由上皮细胞和原代免疫细胞组成的用于危害评估的多细胞人类肺泡模型

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

本文描述了一种用于模拟肺泡上皮组织屏障的人肺泡细胞共培养模型，该屏障由肺泡上皮II型细胞以及两种免疫细胞（即人单核细胞来源的巨噬细胞[MDMs]和树突状细胞[MDDCs]）组成。文中提供了一种构建多细胞模型的实验方案。肺泡上皮细胞（A549细胞系）首先在可渗透性培养小室的双室培养板中于浸没条件下生长并分化，随后与已分化的MDMs和MDDCs共同培养。最后，将细胞暴露于气液界面条件下数天。由于人原代免疫细胞需从人血沉棕黄层中分离获得，因此本文比较了由新鲜或冻存后解冻的单核细胞所分化成的免疫细胞，以便根据实验需求优化方法。由肺泡细胞与新鲜分离或冻存解冻后单核细胞来源的免疫细胞组成的三维模型，在受到促炎刺激物（脂多糖和肿瘤坏死因子α）刺激后，其细胞因子（白细胞介素6和8）的释放量相较于未处理组细胞均表现出统计学上显著升高。另一方面，不同共培养体系之间的细胞因子释放水平无统计学显著差异。这表明，本研究所建立的模型在存在由新鲜或冻存外周血单核细胞（PBMs）分化而来的MDMs和MDDCs时，能够对促炎刺激产生响应。因此，该模型是研究机体对不同物质（包括气溶胶化药物或纳米材料）急性生物学反应的有力工具。

由肺泡上皮细胞和免疫细胞组成的人肺共培养模型，采用新鲜或冻存的MDDC和MDM前体细胞（此处为来源于人外周血的单核细胞）构建。如图1所示，在单核细胞分离或解冻后的第3天接种A549细胞。经过6天的分化后，分化的MDM呈圆形，而MDDC则呈现更长的形态，并可见突起结构。这些细胞还倾向于形成聚集体，尤其是由新鲜单核细胞分化时更为明显（图2、图3）。上皮细胞在膜插件上生长3天后形成致密的细胞层（图4），此时进行共培养体系的组装。共培养体系组装24小时后，再在气液界面（ALI）条件下继续培养24小时，随后准备进行暴露实验。
采用伪气液界面（pseudo-ALI）方法，如先前所述29，检测了三维细胞培养模型在已知促炎刺激下的反应性。将促炎刺激物LPS和TNF-α以少量（100 μL）添加至暴露于空气的细胞模型的顶侧表面。同时，通过乳酸脱氢酶（LDH）检测法评估膜破裂缺失情况，以衡量细胞毒性。在基底室的条件培养基（CCM）中，经膜破裂阳性对照（去污剂Triton-X 100）处理后，观察到LDH释放量显著增加（图5）。这些结果证明该模型对细胞毒性物质具有响应性，而在顶侧施加TNF-α或LPS刺激后，未观察到LDH释放增加。
使用新鲜或先前冷冻的PBMs制备的样本中乳酸脱氢酶（LDH）测量值存在差异，其可能原因与样本储存有关。来自新鲜PBMs的样本在-80 °C下储存时间较长，因此LDH酶的活性可能下降。值得注意的是，LDH在CCM中仅可稳定保存最多4天，因此建议在收集上清液后最迟2天内完成检测。或者，也可在收集后立即将上清液冷冻保存。然而，需注意冷冻可能导致LDH酶活性降低。
通过ELISA定量检测基础侧CCM中促炎介质（此处为TNF-α以及白细胞介素6 [IL-6] 和8 [IL-8]）的分泌。与相应的未处理细胞相比，经LPS或TNF-α处理的样本中，IL-6和IL-8的释放量均显著增加（p &lt; 0.05，单因素方差分析），该结果在由PBMs来源构建的两种细胞共培养模型中均观察到（图6）。尽管在新鲜PBMs组成的共培养体系中，基础侧CCM内所有检测细胞因子的浓度（pg/mL）均较高，但两种共培养体系之间以及共培养与单层培养之间差异无统计学意义（p &gt; 0.05）（图6）。为验证共培养模型相较于二维上皮细胞单层培养的优势，还对A549单层培养细胞进行了LPS或TNF-α刺激。结果如预期所示，A549单层培养细胞释放的所有被检测介质水平均低于两种共培养模型；然而，两者之间的差异无统计学意义（p &gt; 0.05，单因素方差分析）。
通过共聚焦激光扫描显微镜（LSM）评估了三维人肺泡上皮组织屏障的细胞形态。为了观察各模型的组成，共培养模型中的巨噬细胞（MDMs）使用成熟巨噬细胞标志物25F9进行染色，MDDCs则使用CD83染色，CD83是活化树突状细胞的重要标志物30。在细胞形态方面，使用新鲜外周血单个核细胞（PBMs）来源的MDMs和MDDCs构建的共培养模型与使用冻存后解冻的PBMs来源细胞构建的模型之间未观察到差异。在经LPS和TNF-α暴露的共培养模型中（无论免疫细胞为新鲜或冻存），LSM图像均显示上皮层出现破坏，而在未处理的细胞中则未见此现象（图7，图8）。
<img alt="MDMs/MDDCs 与 A549 在气液界面共培养用于暴露研究的分化时间线示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：实验方案的示意图时间线。展示三维共培养模型的制备、组装及应用过程（暴露于待测物质）。ALI = 气液界面，MDDCs = 单核细胞来源的树突状细胞，MDMs = 单核细胞来源的巨噬细胞，PBMs = 外周血单核细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞生长比较；显微镜图像 a) 低密度，b) 高密度；比例尺 100µm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：由新鲜外周血单核细胞（PBMs）分化而来的MDMs和MDDCs。 从新鲜外周血单核细胞（PBMs）分化6天后的相差显微镜图像，分别为（A）巨噬细胞（MDMs）和（B）树突状细胞（MDDCs）。MDMs呈圆形，而MDDCs常以聚集体形式出现。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜下的细胞生长比较；细胞增殖分析，图像显示100 µm比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：由冻存的PBMs分化而来的MDMs和MDDCs。 解冻后6天，由PBMs分化得到的（A）MDMs和（B）MDDCs的相差显微镜图像。MDMs呈圆形，但也可观察到部分伸长的细胞。MDDCs亦呈圆形，并带有突起。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜下的组织学切片；细胞结构；显微分析；比例尺 100 µm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：膜插件上上皮细胞的生长。接种后第 4 天，在膜插件上融合生长的 A549 细胞的相差显微镜图像，形成致密的细胞层。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用来自PBMs的MDMs和MDDCs的共培养模型中LDH释放图谱；LPS、TNF-α与Triton-X比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：通过基于膜破裂的（LDH）检测法测定的细胞毒性结果。 数据以未处理细胞的倍数变化表示（均值 ± 标准差，n = 3；星号表示与未处理细胞相比具有统计学显著性增加，**p < 0.01） &lt; 0.01，****p &lt; 0.0001）。绿色模型代表使用新鲜外周血单个核细胞（PBMs）分离的单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）和单核细胞来源的树突状细胞（MDDCs），紫色模型代表使用冻存后解冻的PBMs组装的模型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="共培养模型柱状图：MDMs、MDDCs释放TNF-α、IL-6、IL-8；LPS、TNF-α刺激。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图6：共培养与单培养体系中的促炎反应。在LPS或TNF-α刺激24小时后，共培养体系中促炎介质（TNF-α、IL-6和IL-8）的释放情况。数据以未处理细胞为对照表示（均值±标准差，n = 3，**p &lt; 0.01，***p &lt; 0.001，****p &lt; 0.0001）。绿色模型代表使用新鲜外周血单个核细胞（PBMs）来源的MDMs和MDDCs，紫色模型代表使用冻存后解冻的PBMs构建的体系。灰色代表A549单培养体系。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="未处理、LPS、TNF-α 处理细胞的荧光显微镜图像；顶面/底面比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig07.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 7"> 
图7：由新鲜免疫细胞组成的共培养体系的形态学特征。 使用新鲜外周血单个核细胞（PBMs）来源的单核细胞来源巨噬细胞（MDMs）和单核细胞来源树突状细胞（MDDCs）构建的共培养模型顶面与底面的激光扫描共聚焦显微镜（LSM）图像，以及模型顶面的xz投影图像。青色代表细胞核（DAPI染色），品红色代表细胞骨架（罗丹明-鬼笔环肽染色），白色代表MDMs（25F9标记），绿色代表MDDCs（CD83标记）。白色箭头指示MDM，绿色箭头指示MDDC。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="未处理与经处理的上皮细胞的共聚焦显微镜图像，比较顶面与底面。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig08.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 8"> 
图 8：由冻存免疫细胞组成的共培养体系的形态学特征。 共培养模型顶面的激光扫描显微镜（LSM）图像及其对应的xz投影，以及使用解冻后外周血单个核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）和树突状细胞（MDDCs）构建的模型底面图像。青色代表细胞核（DAPI染色），品红色代表细胞骨架（罗丹明-鬼笔环肽染色），白色代表MDMs（25F9标记），绿色代表MDDCs（CD83标记）。白色箭头指示MDM，绿色箭头指示MDDC。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种从人外周血中分离单核细胞，并将其分化为巨噬细胞和树突状细胞，进而与上皮细胞共同组装成多细胞人肺模型的实验方案。该研究比较了由新鲜分离或冻存后解冻的单核细胞分化而来的免疫细胞所构成的共培养体系，在受到促炎刺激后的生物学反应。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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