使用 iDISCO⁺ 和光片荧光显微镜对椎体淋巴管系统及其引流进行三维成像

本方案可提供椎体淋巴管及其引流淋巴结的三维、大尺度视图，有助于研究淋巴引流以及免疫细胞在淋巴系统中的迁移。iDISCO+透明化方案可保持组织完整性，从而实现对椎体中神经、血管和免疫细胞的精确定位，包括脊髓、脑膜、硬膜外腔以及引流淋巴结。在确认麻醉后的8至12周龄小鼠对足底反射无反应后，将小鼠置于立体定位仪中。

使用手术刀在计划注射的相应区域做皮肤切口。使用脊柱固定器在胸12至腰1椎体水平固定脊髓，并钝性分离覆盖颈部及脊柱的颈旁或椎旁肌肉，以暴露硬脑膜表面。然后使用26号针头小心穿刺硬脑膜及其下方的蛛网膜中央区域。

接下来，从玻璃毛细管尖端切下两毫米，并将毛细管连接至与10微升注射器相连的套管。用2至8微升所选的荧光示踪剂填充微毛细管。以适当的角度将微毛细管插入硬脑膜的中位区域，准备进行注射。

将毛细管推至硬脑膜下方1.5毫米处，用10微升外科胶水封闭毛细管周围的切口。待胶水干燥后，以每分钟1微升的速度缓慢注射荧光示踪剂。当全部体积注射完毕后，将毛细管留置原位1分钟，然后撤出微毛细管。

用额外的胶水封闭注射孔。注射后在适当时间点，使用解剖剪从下腹部至胸腔进行皮肤和腹膜切口。打开胸腔以暴露心脏，并将26号针头插入心脏的左心室。

以每分钟 2 毫升的速度，用 20 毫升冰冻的 4% 多聚甲醛 PBS 溶液进行灌注。用剪刀迅速剪开右心房，以释放灌注液流。用镊子完全去除皮肤，并用剪刀去除四肢。

取出所有内脏器官，注意保留淋巴结完整并剪开肋骨。将解剖得到的组织分别浸入含有冰上预冷的4%多聚甲醛（溶于PBS）的50毫升离心管中，在4摄氏度下固定过夜，随后用50毫升新鲜PBS洗涤固定后的组织三次，每次洗涤5分钟。对于全组织样本的iDISCO+标记，首先在室温下以含PBS的甲醇溶液进行梯度脱水处理，每步浸泡1小时，并持续振荡。

最后一次浸入后，将样品在33%甲醇、66%二氯甲烷溶液中振荡孵育过夜。次日早晨，在室温下用100%甲醇洗涤样品两次，每次洗涤一小时。随后在4°C条件下，用5%过氧化氢甲醇溶液孵育过夜。

次日早晨，将样品在 PBS 中按甲醇浓度递减的顺序依次浸入，每种浓度下振荡孵育 1 小时，室温下逐步再水化。为脱钙脊椎骨，将样品在 Morse 溶液中室温孵育 30 分钟。随后用 PBS 洗涤两次，并在含 0.2% Triton X-100 的 PBS 中振荡孵育两次，每次 1 小时，室温进行。

第二次Triton X-100孵育后，将样品在37摄氏度下用通透化溶液处理24小时，随后在37摄氏度下用封闭液孵育24小时。封闭液孵育结束后，将样品在含有5%二甲基亚砜和3%驴血清、并以0.2%Tween-20和0.1%肝素补充的PBS溶液中，于37摄氏度下与一抗共同孵育六天。

孵育结束后，在室温下用含2% Tween-20和0.1%肝素的PBS溶液洗涤样品，每次洗涤均需更换新鲜溶液，共洗涤四至五次，每次过夜并在振荡条件下进行。随后根据论文中的说明，将样品与二抗孵育。最后一次洗涤后，将样品依次浸入PBS中浓度递增的甲醇溶液中进行脱水，每种浓度处理一小时。

随后在33%甲醇66%二氯甲烷溶液中孵育过夜。次日早晨，用二氯甲烷洗涤样品两次，每次15分钟。然后在二苄基醚中静置透明4小时，期间不摇动。

进行光片荧光显微成像时，将透明化后的样品置于显微镜载物台上，调整至横向平面，使用 4X、0.3 数值孔径的物镜。选择单侧三光片消除模式，固定 X 轴位置，不启用动态聚焦。采用波长调至 561 纳米、功率 100 毫瓦以及波长 639 纳米、功率 70 毫瓦的 LED 激光器。

将光片数值孔径设置为0.03。设置适当的发射滤光片，并用二苄基醚填充显微镜腔室。随后，使用相机以2倍光学变焦和每像素0.8微米的分辨率，以2.5微米的Z轴步长和每步30毫秒的曝光时间采集图像序列。

以全画幅10%的重叠率进行马赛克图像采集。以TIF格式采集图像，并使用适当的完全转换软件将其转换为3D格式。使用Stitcher软件重建马赛克图像时，打开图像并根据图像间10%的重叠区域作为参考，手动排列图像以重构完整的马赛克图像。

然后使用 3D 软件对数据生成正交投影。为显示的淋巴管及其他解剖结构添加彩色编码属性。并对来自光片荧光显微镜的原始数据设置 1.47 的伽马校正。

按照制造商的说明进行操作。iDISCO+ 与光片荧光显微镜相结合，可保持椎体解剖结构，并实现对周围骨骼、韧带、肌肉和神经节内淋巴管系统的成像。向脑脊液、小脑延髓池或脊髓胸腰段区域注射少量红色荧光示踪剂后，45 分钟即可在深部颈淋巴结中观察到示踪剂的聚集，表明淋巴系统已摄取并引流了该示踪剂。

示踪剂注入胸腰段脊髓实质后，示踪剂会积聚在脊髓组织和深部颈部引流淋巴结中，但不会出现在用抗LYVE-1抗体标记的颈部和胸部淋巴管系统中。将抗LYVE-1抗体注入胸腰段脊髓实质后，可标记椎体淋巴管及其椎体外淋巴连接结构。上述结果证实了示踪剂被椎体淋巴管摄取，并沿淋巴引流通路向椎体外淋巴系统引流。

进行示踪剂注射时需格外小心，以免干扰脑脊液循环。iDISCO+方案要求非常严格，但您需要根据样本的大小进行适当调整。在示踪剂注入中枢神经系统后，可进行免疫染色或活体成像实验。

iDISCO+ 技术可用于研究不同的细胞、细胞群和组织。