Name: 量化秀丽隐杆线虫中组织特异性蛋白静剂下降 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学习利用组织特异性多聚谷氨酰胺荧光报告基因在秀丽隐杆线虫中定量分析蛋白质稳态下降的方法。该技术可可视化并量化衰老相关的细胞蛋白质稳态衰退，为研究衰老机制和开发神经退行性疾病治疗策略提供重要工具。

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我们感谢Samuelson实验室的历届和现任成员在优化本方法和/或协助本手稿撰写过程中的讨论与支持。本研究的资助来自美国国立卫生研究院下属的国家衰老研究所，资助编号为RF1AG062593和R21AG064519。本内容完全由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿撰写过程中均未参与。

1. 试剂的准备
<ol>
	<li>选择希望通过饲喂法RNAi失活的目标基因。购买HT115菌株的保存菌种 E. coli 含有目标RNAi克隆20或者，将目的基因的cDNA亚克隆至L4440质粒的多克隆位点。 
	注意：为防止dsRNA在细菌内降解，应使用HT115菌株。该菌株缺乏RNase III E. coli 含有IPTG诱导型T7聚合酶活性的菌株。对于不使用喂食法RNAi的蛋白质稳态研究，可使用HT115或OP50 E. coli 可在标准NGM平板上使用。</li>
	<li>每种测试条件准备5个6 cm培养皿。对于使用RNAi的实验，在转化的HT115中诱导dsRNA的产生 E. coli对于未进行RNAi的研究，使用OP50 E. coli 在标准NGM平板上可使用（参见 补充文件 1 标准NGM和RNAi平板配方）。 
	注意：RNAi 平板在接种细菌前可在 4 °C 下保存数月。</li>
	<li>培养以下菌种 E. coli 在37 °C、220 rpm条件下于摇床培养箱中过夜（16–20 h）培养HT115 E. coli 在含氨苄青霉素（50 μg/mL）的LB培养基中 
	注意：标准 OP50 E. coli 不具有抗生素抗性，但也有链霉素抗性变体可供使用。
	<ol>
		<li>通过离心浓缩细菌，离心条件为 2,400 x g 在台式离心机中离心15-20分钟，吸除上清液，将沉淀重悬于1/10体积的溶液中th HT115 使用含氨苄青霉素的LB培养基（起始体积，即10倍浓度），OP50标准菌株使用不含氨苄青霉素的LB培养基。</li>
		<li>向每块平板分装 200 µL 浓缩的 10 倍细菌液（每种测试条件设 3–4 个重复，并额外准备 2 块备用平板，以应对污染情况）。</li>
		<li>在洁净环境中（如超净工作台）将敞口培养皿晾干，直至所有液体被吸收；或将加盖的培养皿置于实验台过夜晾干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于在超净台中干燥的接种RNAi平板，需在室温下将干燥的平板置于线虫盒中过夜（最长24小时）。在室温放置1天后，可将平板密封于自封袋中，于4 °C保存最多2周（以防止平板干燥）。使用前，需将存放在4 °C的平板连同自封袋一起恢复至室温，以避免冷凝水引入空气中的真菌污染物。
	<ol>
		<li>使用基于摄食的RNAi时，将接种了HT115菌的RNAi平板置于室温下至少12小时，然后再添加 秀丽隐杆线虫 RNAi 平板中含有可诱导dsRNA产生的IPTG。或者，可在步骤1.3.1结束前2小时将IPTG加入液体培养物中。</li>
		<li>避免将接种HT115的平板在室温下长期存放（超过数天），以防琼脂开裂导致 秀丽隐杆线虫 钻入琼脂。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. C. elegans 的同步化
注意：&#160;选择通过碱性次氯酸盐处理成年 gravid 蠕虫或卵孵化两种方法之一来同步 C. elegans。
<ol>
	<li>通过低氯酸盐处理产卵成虫以同步动物，促进胚胎释放22。
	<ol>
		<li>进行低氯酸盐处理时，用 M9 缓冲液洗涤产卵期雌雄同体动物 2 次，然后重悬于 5 mL 低氯酸盐溶液（3.25 mL 低氯酸盐溶液、1 mL M9 缓冲液和 0.75 mL 5 M NaOH）中，振荡处理 5 分钟，每隔 1 分钟振荡一次。5 分钟后离心收集动物，并用 M9 缓冲液洗涤 3 次。 
		注意：已有研究提出低氯酸盐处理可能影响蛋白质稳态21。</li>
		<li>低氯酸盐处理后，将胚胎置于 3 mL M9 溶液中，在 20 °C 条件下旋转孵育过夜，使其孵化。</li>
		<li>通过将 10 µL L1 动物溶液滴加到 6 cm 培养皿中 3 次（每次 10 µL），计数 L1 动物数量，计算每 µL 溶液中 L1 动物的平均密度。L1 动物会随时间沉降，因此需定期混匀 L1 溶液以防止沉降。</li>
		<li>每培养皿接种 50 只 L1 动物，计数并记录接种数量，然后将培养皿转移至 20 °C 培养箱中。在实验开始时明确每皿中动物的实际数量至关重要。 
		注意：通过在 M9 溶液中过夜孵化同步 L1 动物是常规方法，因其可最大限度减少将动物转移至食物后出现的发育异质性。然而，该同步过程依赖饥饿信号诱导的发育停滞，某些研究中应避免使用（详见23 的进一步讨论）。作为替代方案，可通过产卵法获得大致同步的动物，请参见步骤 2.2。</li>
		<li>将剩余的 L1 动物在液氮或 -80 °C 冰箱中冷冻保存。如此可保留实验设置时各品系的样本，为后续研究提供宝贵资源，并提高实验可重复性。 
		注意：低氯酸盐溶液和 M9 溶液的配制方法见&#160;补充文件 1&#160;。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若通过产卵法同步动物，将 20&#160;只年轻产卵期成虫（成虫第 1 天）放置于每个培养皿中，让其产卵 4–6 小时，直至每皿约有 50 枚卵。&#160;移除所有产卵期成虫，并将含卵培养皿转移至 20 °C 培养箱中。 
	注意：产卵期成虫应在成虫第 1 天同步。较老的动物可能产下在子宫内滞留较久的卵，导致释放的卵处于更晚期的发育阶段。</li>
</ol>
3. 子代产生
注意：必须采取措施以防止后代产生，或将同步化的起始种群与其后代分离。可通过在培养板中添加5-氟-2'-脱氧尿苷（FUdR）实现化学抑制后代产生，本文对此进行了描述。一些研究报道，FUdR可能影响蛋白质稳态24,25。下文将讨论防止后代产生的其他替代方法。
<ol>
	<li>通过将1 g FUdR溶解于10 mL超纯H2O中，配制1000倍浓缩的FUdR储备液。使用0.2 μm滤膜和10 mL注射器对FUdR储备液进行过滤除菌。将1 mL储备液分装至无菌的1.5 mL离心管中，冻存于-20 °C。</li>
	<li>在20 °C下培养线虫至L4阶段。经次氯酸盐处理获得同步化L1幼虫的N2品系线虫，通常需要在20 °C下培养约40小时以达到L4阶段。其他品系的生长速率应在实验前通过实验确定。有关准确判断C. elegans发育阶段的详细方法，请参见26。
	<ol>
		<li>向每块含有L4期线虫的6 cm培养板中加入100 µL的80倍浓缩FUdR溶液。必须在L4阶段添加FUdR，这一点至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养板放回线虫培养盒中，并将盒子置于自封袋内，然后放回相应的培养箱中。</li>
</ol>
4. 利用表达多聚谷氨酰胺的动物测量肌肉组织中蛋白质稳态的下降
注意：可通过两种方法检测肌肉细胞中蛋白质稳态的下降：通过成像技术观察衰老过程中蛋白质聚集体的形成（4.1），以及通过麻痹发生情况来测量这些聚集体随年龄增长所引发的蛋白毒性（4.2）。
<ol>
	<li>成像衰老过程中肌肉中多聚谷氨酰胺聚集物的形成 
	注意：通过将聚谷氨酰胺（polyQ）重复序列与黄色荧光蛋白（YFP）融合，对肌肉细胞中蛋白质聚集的年龄依赖性进展进行成像。本方案概述了菌株AM140的使用方法 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP]，但也可使用其他多聚谷氨酰胺变异菌株。 polyQ::YFP 转基因通过肌肉特异性表达 unc-54 肌肉特异性启动子。同步化 unc-54p::polyQ::YFP 在成年后的第1、2、3和4天观察表达目标基因的动物。为进行观察 unc-54p::polyQ::YFP 聚集体，使用配备荧光功能的复式显微镜或荧光解剖显微镜进行观察。AM140 可从秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）获取，网址为：https://cgc.umn.edu/strain/AM140。
	<ol>
		<li>在成像日（成年后的第1、2、3和4天），挑选20只动物，置于含3%琼脂糖垫和5 μL 10 mM叠氮化钠（用M9缓冲液稀释）的显微镜载玻片装置上。</li>
		<li>在所有动物完成实验后&#160;用叠氮化钠将动物固定（约5分钟），使用10倍放大镜对动物整体进行成像（图1A)。成像时使用 FITC 滤光片，并对每只动物采用相同的曝光参数。成像后弃置载玻片。 
		注意：也可以直接在平板上定量YFP焦点，但在计数时需通过向平板通入二氧化碳气流以抑制线虫运动。当需要筛选大量条件时，该替代方法更为适用（详见讨论部分）。</li>
		<li>成像完成后，计数整个动物体壁肌肉中焦点的数量。焦点是较亮的点状信号，可与背景中较弱的可溶性信号相区分。</li>
		<li>绘制第1、2、3和4天YFP焦点积累的进展图。绘制XY图，其中X轴表示成年天数，Y轴表示焦点数量 unc-54p::polyQ::YFP 焦点（图1B）。将实验条件下（例如基因下调或过表达）的焦点数量与对照组动物进行比较。针对每次试验中每个观察时间点的各组间进行统计学分析。
		<ol>
			<li>当仅比较两种条件下的焦点计数时，应在每个时间点进行独立样本 t 检验。</li>
			<li>当比较两种以上条件的焦点计数时，对每个时间点进行整体单因素方差分析（one-way ANOVA），纳入该时间点所有条件的数据。如果整体ANOVA得到显著性p值（即，p < 0.05），则进行事后多重比较校正，例如使用Tukey法或Bonferroni法，以确定具体哪些组间存在显著差异。 &#60; 0.005），执行 事后 采用成对独立样本 t 检验进行分析，以确定在哪些特定条件之间检测到焦点数量的显著差异（例如，对于 A、B 和 C 组，比较 A 与 B、A 与 C、B 与 C） &amp;#38; B, A &amp;#38; C，以及 B &amp;#38; C)</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以动物麻痹率作为肌肉细胞中多聚谷氨酰胺毒性的替代指标进行检测 
	注意：多聚谷氨酰胺（polyQ）聚集物在肌肉中的年龄依赖性增加会导致运动功能相关的肌肉功能衰退。这种运动缺陷可通过测量表达polyQ的动物的渐进性麻痹速率来确定。对于麻痹实验，需使用同步化的 unc-54p::polyQ::YFP 在成虫期第3、5、7和9天对表达动物进行评分。根据需要增加额外的时间点，以扩展评分范围，从而能够评估基因扰动的影响。
	<ol>
		<li>在评分日（成虫期第3、5、7和9天），观察含有50只动物的6 cm培养皿，记录瘫痪动物的数量。将瘫痪的动物从培养皿中移除。若动物爬出培养皿或已死亡，应予以删失处理；记录该事件，以便在分析中予以考虑。 
		注意：当动物在暴露于光刺激或轻触刺激后未观察到任何运动时，即视为瘫痪。通过咽部泵动活动来判断无运动的动物是存活还是死亡。</li>
		<li>实验结束后，计算每种条件下各时间点的麻痹率。通过将麻痹动物数除以该时间点该条件下观察的动物总数来计算。若每个时间点每种条件设有多个培养皿（即重复培养皿），则需分别计算每个重复组的比例。</li>
		<li>在XY图（散点图）中绘制麻痹率的进展过程。X轴表示成虫天数，Y轴表示麻痹率。麻痹率的计算方法为 unc-54p::polyQ::YFP 动物与对照组动物进行比较（图1C）在各组之间进行统计分析；对于多次试验，应独立处理每次试验。采用Cox比例风险回归模型和Wald检验。大多数支持生存分析的数据分析工具也支持Cox模型。
		<ol>
			<li>转换数据：每种条件应包含两列，一列为时间，另一列为“事件”。在每个观察到的时间点，为每只瘫痪的动物添加一行，事件记为“0”，为每只删失的动物添加一行，事件记为“1”。总行数应等于该条件下起始动物的数量。</li>
			<li>进行Cox比例风险模型分析，随后根据所用统计软件的说明执行Wald检验。对于典型的实验设计，采用单变量模型是合适的。当涉及两个以上条件时，若包含所有条件的检验结果显示显著性（即p < 0.05），则应进一步进行成对比较以确定具体差异来源。 &#60; 0.005），可在各实验条件之间进行成对检验，以确定具体存在显著差异的条件对。 
			注意：Cox 模型依赖于一个假设，即测试条件随时间成比例地调节事件发生的概率。这意味着，例如，若一种条件下大多数动物在第1天即出现瘫痪，而另一种条件下大多数动物在第9天才出现瘫痪，则不适宜使用 Cox 模型进行比较。当比例风险假设不成立时，可采用 Cox 模型的扩展方法或其他在每个时间点比较瘫痪比例的统计方法，详见27,28,29,30.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 利用表达多聚谷氨酰胺的动物测量神经组织中蛋白质稳态的下降。
注意：采用两种互补的方法来检测神经元中蛋白质稳态的衰退：（1）通过量化衰老过程中蛋白质聚集体（荧光焦点）的形成；（2）通过基于运动行为的检测方法测量与年龄相关的神经元蛋白质组的衰退。
<ol>
	<li>在衰老过程中成像神经元中的多聚谷氨酰胺聚集物形成 
	注：与之前在肌肉组织中讨论的检测方法类似，通过表达由神经元特异性启动子 rgef-1 驱动的 polyQ::YFP 融合蛋白，对神经元中蛋白质聚集的年龄依赖性进展进行成像。具体使用 AM101： rmIs110 [rgef-1p::Q40::YFP]，即 YFP 与 40 个谷氨酰胺的融合蛋白16。为可视化 rgef-1p::polyQ::YFP，使用配备荧光功能、40 倍物镜的复式显微镜。AM101 可从 CGC 获取：https://cgc.umn.edu/strain/AM101。
	<ol>
		<li>在成像日（成年期第 4、6、8 和 10 天），挑选 20 只线虫，置于含有 3% 琼脂糖垫的载玻片上，并加入 5 μL 10 mM 叠氮化钠（用 M9 缓冲液稀释）。</li>
		<li>待所有线虫被叠氮化钠固定（约 5 分钟）后，使用 40 倍物镜对线虫头部进行 z 轴层扫成像（图 2A）。成像后丢弃载玻片。</li>
		<li>获取图像后，对&#160;z 轴层扫图像进行处理，获得最大投影图像，并用于量化位于神经环区域神经元中的聚集灶数量。聚集灶表现为比背景中弥散的可溶性信号更亮的点状信号。 
		注：我们特别选择神经环区域来量化 rgef-1p::polyQ::YFP 聚集物，因为该区域是大多数神经元汇聚并形成突触连接的部位。然而，若需测量运动神经元中的聚集物形成水平，可对位于背侧或腹侧神经索的 rgef-1p::polyQ::YFP 聚集物进行量化。</li>
		<li>绘制从成年期第 4 天（D4）、第 6 天（D6）、第 8 天（D8）到第 10 天（D10）YFP 聚集灶积累的进展图。使用 XY 图，X 轴表示成年天数，Y 轴表示 rgef-1p::polyQ::YFP 聚集灶数量（图 2B）。将实验条件（如基因下调或过表达）下的聚集灶数量与对照组线虫进行比较。神经元中聚集灶数量的统计分析方法与肌肉中 polyQ 聚集灶相同；参见步骤 4.1.4&#160;及相关注释。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过体弯曲次数作为神经元中多聚谷氨酰胺蛋白毒性作用的替代指标进行测量。 
	注：通过“翻滚实验”检测运动神经元缺陷，从而确定神经元中 polyQ 聚集物逐渐积累所诱导的蛋白毒性应激。在 M9 生理缓冲液中悬浮状态下，量化 30 秒内的体弯曲次数（补充文件 1）。
	<ol>
		<li>在成年期第 2 天，从培养皿中挑选 10 只同步化的线虫，置于载玻片上 10 μL M9 缓冲液液滴中。重复此步骤至少四次，以获得 40 只或更多的样本线虫。</li>
		<li>使用配备摄像功能的体视显微镜，对置于载玻片上含 10 μL M9 缓冲液中的 10 只线虫进行 30 秒的视频记录。重复此步骤 4 次，共获得 40 只线虫的样本。调整放大倍数和位置，确保所有线虫在 30 秒内始终完整出现在视野中。</li>
		<li>在所有待分析线虫的视频记录完成后，播放视频并记录每只线虫的体弯曲次数。一次体弯曲定义为线虫阴门从一侧移动至另一侧，并完全返回起始位置的过程。 
		注：我们发现野生型线虫在 30 秒内通常有 49 ± 0.79 次体弯曲。</li>
		<li>在柱状图中绘制每只线虫的体弯曲次数，每个点代表 30 秒内的体弯曲次数（Y 轴），X 轴表示不同的实验条件。将 unc-54p::polyQ::YFP 线虫的体弯曲次数与对照组线虫进行比较（图 2C）。对每次实验中的各组独立进行统计分析；若在多个时间点重复该实验，则对每个时间点的数据独立分析。
		<ol>
			<li>当仅比较两种条件时，采用独立样本 t 检验。</li>
			<li>当同时比较两种以上条件时，首先进行整体单因素方差分析（one-way ANOVA），包括该次实验/时间点所有条件的数据。若整体 ANOVA 得到显著性 p 值（即 p &#60; 0.005），则进一步进行事后检验（post-hoc analysis），使用成对独立样本 t 检验确定哪些特定条件之间的体弯曲次数存在显著差异。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

衰老的特征是蛋白质稳态的逐渐衰退。蛋白质稳态由一个复杂的系统——蛋白质稳态网络——所维持，该网络可协调、动态地响应应激，调控蛋白质的折叠、降解和翻译过程。目前对衰老过程中蛋白质稳态为何失衡仍缺乏充分理解，但表观基因组的退化、应激反应诱导能力的下降以及补偿性交互调控的丧失均与这一崩溃过程同时发生。在C. elegans中，由于应激相关基因位点上抑制性染色质标记的形成，多种应激反应的转录诱导能力在生殖开始后数小时内迅速下降2,34,35。蛋白质稳态的崩溃是一个重大的临床问题，因为它构成了蛋白质错误折叠疾病发生的基础。因此，建立一种适用于遗传学分析的方法，以在活体条件下定量评估细胞内的蛋白质稳态水平，对于深入理解生物体如何维持蛋白质组的正确折叠与功能至关重要。
在组织特异性表达聚谷氨酰胺荧光报告基因的转基因 C. elegans 是研究衰老依赖性蛋白质稳态功能下降的有...

蛋白质稳态（proteostasis）是指细胞维持蛋白质组正确功能和折叠状态的能力。蛋白质稳态面临的一个内在挑战是确保所有蛋白质都能正确折叠并保持天然构象，而蛋白质在大小、氨基酸组成、结构构象、稳定性、周转率、表达水平、亚细胞区室化以及翻译后修饰等方面的多样性进一步加剧了这一挑战1。蛋白质稳态依赖于一个由约2000种独特蛋白质组成的、协调运作的蛋白质稳态网络，该网络调控蛋白质组内的正确合成、折叠、转运和降解过程2,3。蛋白质稳态网络中的核心功能成分是九个主要类别的分子伴侣家族4。每种组织和细胞类型倾向于优先利用特定的分子伴侣子集，这可能与其各自不同的蛋白质组需求相适应5。
正常生物体衰老的一个显著特征是细胞蛋白质稳态（proteostasis）的进行性衰退与崩溃，这被认为是越来越多与年龄相关疾病发生和发展的基础。例如，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病以及肌萎缩侧索硬化症（ALS）具有一项共同特征：这些神经退行性疾病的表型均由遗传变异引发，这些变异使突变蛋白易于发生聚集（分别为 amyloid-β/Tau、α-synuclein、HTT、FUS/TDP-43/SOD-1）6,7,8,9,10。在衰老过程中，蛋白质稳态网络的完整性及其可诱导性逐渐下降，导致毒性蛋白聚集体积累，进而引发细胞功能障碍和神经退行性病变。值得注意的是，蛋白质构象异常疾病并非神经元所特有，而是广泛存在于多种组织中，如二型糖尿病、多发性骨髓瘤和囊性纤维化即为典型例证11,12,13,14。因此，阐明能够维持蛋白质稳态的机制，将有助于开发针对性干预措施，用于疾病治疗并促进健康衰老。
小型土壤线虫Caenorhabditis elegans（C. elegans）在发现调控蛋白质稳态的基因和阐明相关通路方面发挥了重要作用。蛋白质稳态网络的许多组分以及调控蛋白质稳态的信号转导通路在进化上是保守的。此外，与脊椎动物系统相比，C. elegans具有较低的复杂性和冗余性，更易于进行遗传分析和基因发现。促使C. elegans被广泛用作研究蛋白质稳态的模式系统还包括以下优势：强大的遗传学和功能基因组学工具、较短的生命周期（3天）和寿命（3周）、紧凑且注释完善的基因组、丰富的遗传突变体资源，以及利用荧光报告基因轻松观察细胞生物学中组织特异性变化的能力。
在衰老过程中，蛋白质稳态的进行性衰退在 C. elegans 中易于量化。Morimoto 实验室首次证明，将一段多聚谷氨酰胺扩展序列与黄色荧光蛋白融合（polyQ::YFP）可用于量化 C. elegans 在衰老过程中的蛋白质稳态衰退15,16,17,18。当谷氨酰胺重复序列达到35次或更多时，其与YFP的融合会导致随年龄增长而出现荧光焦点的形成，并伴随细胞病理学特征。值得注意的是，该谷氨酰胺扩展范围与亨廷顿蛋白（Huntingtin）中多聚谷氨酰胺 tract 的长度相对应，即在人类中开始出现亨廷顿病病理特征的阈值（通常为 &#62;35 个 CAG 重复）19。已有多种品系被用于表达肌肉、肠道或神经元细胞中的 polyQ::YFP，以证实蛋白质稳态的年龄相关性衰退存在于不同类型的细胞和组织中。其中，肌肉特异性表达的 polyQ::YFP 报告系统（例如 unc-54p::Q35::YFP）应用最为广泛，因为在成虫早期的数天内，利用简单的荧光解剖显微镜即可方便地对积累的荧光焦点进行定量分析（图1A-1B）。此外，由于报告蛋白的蛋白毒性作用导致肌肉蛋白质组崩溃，动物在中年期会出现瘫痪现象（图1C）。类似地，通过直接定量荧光焦点/聚集体的形成以及将动物置于液体中后身体协调弯曲能力的年龄相关性下降，可以追踪神经元蛋白质稳态的年龄相关衰退过程（rgef-1p::Q40::YFP）（图2）。
本文详细介绍了一种用于检测在 C. elegans 神经元和肌肉组织中表达多聚谷氨酰胺重复序列所导致的蛋白质聚集物随年龄累积及其相关蛋白毒性进展的实验方案。我们提供了利用这些品系和方法获得的典型实验结果示例。此外，我们展示了如何应用这些方法研究蛋白质稳态网络的转录调控机制，并讨论了这些报告系统与其他现有试剂整合或改进用于大规模筛选的多种可行策略。

<table><tbody><tr><td>24 孔培养板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#662102</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 96 孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#780286</td><td></td></tr><tr><td>600 &amp;micro;L 96 孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#786261</td><td></td></tr><tr><td>96 针平板复制器</td><td>Nunc</td><td>250520</td><td></td></tr><tr><td>透气性板封膜</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>细菌学琼脂</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>VWR</td><td>90000-368</td><td></td></tr><tr><td>HT115 细菌中的 C. elegans RNAi 克隆文库 - Ahringer</td><td>Source Bioscience</td><td>C. elegans RNAi 文库 (Ahringer)</td><td>另见 Kamath 等, Nature 2003。</td></tr><tr><td>HT115 细菌中的 C. elegans RNAi 克隆文库 - Vidal</td><td>Source Bioscience</td><td>C. elegans ORF-RNAi 资源库 (Vidal)</td><td>另见 Rual 等, Genome Research 2004。该文库也可从 Dharmacon 获取。</td></tr><tr><td>FuDR (5-氟-2'-脱氧尿苷)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16497</td><td></td></tr><tr><td>玻璃显微镜盖玻片</td><td>VWR</td><td>48404-455</td><td></td></tr><tr><td>玻璃显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>160004-422</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)</td><td>Gold Bio</td><td>12481C100</td><td></td></tr><tr><td>矩形单孔未处理板，128×86 mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>242811</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠，CAS #26628-22-8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>配备 AxioVision v4.8.2.0 软件的 Zeiss Axio Imager M2m 显微镜</td><td>Zeiss</td><td>unknown</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad 显微镜</td><td>Zeiss</td><td>unknown</td><td></td></tr></tbody></table>

量化组织特异性蛋白质稳态衰退在 caenorhabditis elegans 中的变化

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

在正常衰老过程中，维持蛋白质组（蛋白稳态）正常功能和正确折叠的能力逐渐下降，从而促进越来越多与年龄相关疾病的发病。例如，含有聚谷氨酰胺扩展序列的蛋白质易于发生聚集，亨廷顿蛋白（huntingtin蛋白）及其引发的亨廷顿病即为典型实例。通过使用表达与黄色荧光蛋白（YFP）融合的多聚谷氨酰胺重复序列（polyQ）的转基因线虫Caenorhabditis elegans，科研人员已广泛研究了蛋白质组随年龄增长而衰退的现象。这种polyQ::YFP转基因动物模型可通过成像技术直接观察荧光焦点（即蛋白质聚集体）的逐步形成以及随之出现的运动功能障碍，从而实现对蛋白质组衰退程度的定量评估，而这些表型正是蛋白质组功能崩溃的结果。此外，polyQ::YFP转基因的表达可由组织特异性启动子驱动，使得能够在完整多细胞生物体背景下评估不同组织中的蛋白稳态状况。该模型非常适合进行遗传学分析，因此提供了一种可与寿命测定互补的衰老量化方法。本文描述了如何在衰老过程中精确测量神经元或体壁肌肉中polyQ::YFP聚集体的形成及其后续行为缺陷的发生。接着，我们阐述了如何将这些方法改进以适应更高通量的需求，并探讨了结合其他新兴的C. elegans遗传分析策略所可能拓展的未来应用方向。

在 秀丽隐杆线虫，多聚谷氨酰胺重复模型在鉴定调控蛋白质稳态网络的基因方面发挥了重要作用。例如，我们先前研究表明，同源结构域相互作用蛋白激酶（hpk-1），一种转录共调节因子，通过调控自噬及分子伴侣的表达，在衰老过程中影响蛋白质稳态31我们发现，缺失 hpk-1，无论是通过RNAi沉默还是在 hpk-1(pk1393) 缺失突变动物，增加数量 Q35::YFP 在衰老过程中积累的聚集体。第2天成年对照组动物显示有18.0 ± 2.7个聚集体，而 hpk-1(pk1393) 无效突变体和 hpk-1 RNAi处理的 Q35::YFP 动物分别平均形成 28 ± 5.3 和 26.0 ± 5.1 个聚集体（图3A-D）。同样，在成虫期第8天，77–78%的 hpk-1(RNAi) 和 hpk-1(pk1393) 动物在50%的...

蛋白质稳态的衰退是衰老的一个标志，会促进神经退行性疾病的发生。我们提出了一种实验方案，通过异源表达与荧光报告蛋白融合的多聚谷氨酰胺重复序列，定量测量两种不同组织中秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的蛋白质稳态水平。该模型可用于快速开展体内蛋白质稳态的遗传学分析。

量化组织特异性蛋白质稳态衰退在 Caenorhabditis elegans 中的变化

蛋白质组（蛋白质稳态）维持正常功能和正确折叠的能力在正常衰老过程中逐渐下降，促进了……的发生

在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中利用组织特异性表达的多聚谷氨酰胺荧光报告基因具有重要意义，因为它能够在完整的多细胞生物背景下发现并表征蛋白稳态调节因子。该技术的主要优势在于，它能够实现对与年龄相关的细胞内蛋白稳态功能下降进行活体可视化和定量分析，这对于深入理解生物体如何维持蛋白质组的正确折叠与功能以及衰老的影响至关重要。阐明能够维持蛋白稳态的机制，将有助于开发针对蛋白稳态受损的衰老相关疾病的靶向干预措施，并促进健康衰老。蛋白质稳态失衡是一个重大的临床问题，因为它与蛋白质错误折叠疾病的发生密切相关，包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病以及肌萎缩侧索硬化症。首先使用直径为6厘米的培养皿，为每种测试条件制备五个琼脂平板。对于RNAi实验，需在转化后的HT115大肠杆菌中诱导dsRNA的产生，并使用含RNAi的琼脂平板。在无需RNAi的实验中，使用标准NGM琼脂培养OP50大肠杆菌。将大肠杆菌培养物在37摄氏度、220 RPM振荡条件下过夜培养。次日，以2,400 G离心15至20分钟收集菌体，吸除上清液后，将菌体沉淀重悬于初始LB培养液体积的十分之一中。将200微升浓缩细菌分装至每块培养板中，将敞口的培养板置于洁净环境中干燥，直至所有液体被吸收。为通过次氯酸盐处理同步秀丽隐杆线虫（C. Elegans），用M9缓冲液洗涤成年雌雄同体线虫两次，然后将其转移至新的离心管中，加入5毫升次氯酸盐溶液，振荡孵育5分钟，每隔1分钟振荡一次。孵育结束后，离心收集线虫，并用M9缓冲液洗涤三次。将胚胎置于含有3毫升M9溶液的离心管中，在20摄氏度下旋转过夜，使其孵化。通过将10微升L1期幼虫溶液滴加到6厘米培养皿中三次，计数L1期幼虫的数量，以计算L1期动物的密度。定期混匀L1期溶液，防止动物沉降。每块培养皿接种约50条L1期幼虫，计数并记录接种数量，然后将培养皿转移至20摄氏度培养箱中。或者，可通过产卵同步化动物：将5至10条年轻、怀卵的成虫放置于每块培养皿中，持续4至6小时，使其产卵直至每皿约有50枚卵。移除所有怀卵成虫，并将带有卵的培养皿转移至20摄氏度培养箱中。将动物培养至L4期，约需在20摄氏度下培养40小时。随后加入50微升160倍浓度的FUDR。为检测肌肉组织中蛋白质稳态的下降情况，挑选20只动物，将其置于载玻片上，载玻片上预先放置3%琼脂糖垫，并加入5微升10毫摩尔叠氮化钠溶液。所有线虫固定后，使用 10 X 倍率物镜对动物的整个身体进行成像。采用 FITC 或 YFP 滤光片，并对每个动物使用相同的曝光时间。完成后，弃置载玻片。统计整个动物体壁肌肉中焦点的数量。焦点是比背景中较弱的可溶性信号更亮的点状信号，可与之区分。在评分当天，观察培养皿中的动物，记录瘫痪动物的数量，然后将瘫痪的动物从培养皿中移除。实验结束后，计算每种条件下的麻痹率，并绘制麻痹进程曲线。为检测神经组织中蛋白质稳态的下降情况，按照前述方法将线虫置于载玻片上，使用40倍物镜在复式显微镜下对动物头部进行Z轴层扫成像。成像完成后丢弃载玻片。获取图像后，将Z轴层叠图像进行压平处理，并用于量化位于神经环区域的神经元中的焦点数量。绘制第4、6、8和10天YFP焦点累积的变化趋势。在成虫期第二天，从培养皿中挑选10只同步发育的动物，置于载玻片上10微升M9缓冲液液滴中。重复此步骤至少四次，以获得40只或更多动物的样本。使用具备摄像功能的体视显微镜，对动物的运动进行30秒的视频记录。当所有待分析动物的视频录制完成后，播放视频并记录每只动物的身体弯曲次数。将每只动物的体节弯曲次数绘制成柱状图，其中每个点代表在 Y 轴上 30 秒内的体节弯曲次数，X 轴代表测试的不同条件。多聚谷氨酰胺重复模型在鉴定调控蛋白质稳态网络的基因方面发挥了重要作用。肌肉特异性表达 polyQ-YFP 会导致荧光焦点的积累，在简单的荧光解剖显微镜下易于定量。动物在中年时期会因报告基因的蛋白毒性导致肌肉内蛋白质组崩溃而出现瘫痪。通过将动物放入液体后直接定量聚集物的形成以及协调性体弯的减少，可以追踪与年龄相关的神经元蛋白质稳态的下降。该方法已被用于证明同源结构域相互作用蛋白激酶（一种转录共调节因子）可通过调控自噬和分子伴侣的表达来影响衰老过程中的蛋白质稳态。HPK-1的缺失会增加Q35-YFP聚集体在衰老过程中积累的数量。对照组动物平均有18个聚集体，而HPK1基因敲除突变体和HPK1 RNAi处理的动物平均分别有28个和26个聚集体。在成年第八天时，77%至78%的HPK1缺陷型动物出现瘫痪，而对照组仅有50%出现瘫痪。此外，HPK1 的过表达被证明可调控蛋白质聚集体的形成，并在衰老过程中保护动物免受 Q35-YFP 相关麻痹的影响。该方法用于测量特定细胞类型内蛋白质组的整体衰退情况。目前已有多种方法可用于评估蛋白质网络中特定组分的变化。它们共同提供了全面的图景。蛋白质稳态的下降是衰老的一个标志。这种方法使研究人员能够量化这种下降。与基因分析结合时，它是一种强大的发现工具。

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科研

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生物学

量化秀丽隐杆线虫中组织特异性蛋白静剂下降

本文介绍了一种在固体培养基上以紫外线灭活的细菌作为食物来源饲养线虫时，测定其寿命的通用实验方案。...

测量 秀丽隐杆线虫 固体培养基上的寿命测定

本视频演示了一种 体内 基于成像的检测方法以确定由衰老引起的蛋白质稳态衰退。该检测方法利用 秀丽隐杆线虫...

基于荧光报告基因的麻痹检测法：一种评估年龄相关性多聚谷氨酰胺荧光报告基因进行性形成及其相关麻痹的技术Caenorhabditis elegans

为了研究蛋白质稳态、应激与衰老之间的关系，我们利用遗传操作简便的多细胞生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

使用 Caenorhabditis elegans 作为模式系统研究多细胞生物中的蛋白质稳态

本文所介绍方法的目的是研究模式生物 C. elegans...

研究固有蛋白质聚集随年龄变化的方法 秀丽隐杆线虫

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复制集方法：一种高通量定量测定秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）寿命的实验技术

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Caenorhabditis elegans 中的核酸与蛋白质联合提取

本文通过检测荧光转录报告基因的激活以及生物体对生理应激的敏感性，对线虫C.

生理应激反应的测量 秀丽隐杆线虫

本文介绍并描述了一种非放射性、非侵入性的方法，用于在体内评估新生蛋白质的合成，该方法利用线虫Caenorhabditis...

Caenorhabditis elegans 中新生蛋白质合成速率的评估

本文介绍了一种用于分析线虫Caenorhabditis...

监测蛋白质聚集动力学 在体 内 使用自动包涵体计数在 秀丽隐杆线虫

评估测量寿命和健康寿命的低成本方法 秀丽隐杆线虫

学习利用组织特异性多聚谷氨酰胺荧光报告基因在秀丽隐杆线虫中定量分析蛋白质稳态下降的方法。该技术可可视化并量化衰老相关的细胞蛋白质稳态衰退，为研究衰老机制和开发神经退行性疾病治疗策略提供重要工具。

量化组织特异性蛋白质稳态衰退在 Caenorhabditis elegans 中的变化

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