Name: 穆林心脏移植袖口技术的优化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: 了解优化小鼠心脏移植袖口技术的方法，通过内置管辅助血管外翻并采用双人协作模式，显著缩短手术时间并提高移植成功率。该技术为心脏移植手术效率提升提供了新方案。

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本工作得到福建省卫生教育联合研究项目（WKJ2016-2-20）、国家自然科学基金（81771271 和 81800664）、国家重点研发计划&amp;中国国家重点研发计划（2018YFA0108304）、福建省高校教育科研项目（青年骨干教师）（JAT170714）、中国湖南省自然科学基金（2019JJ50842）及湖南省“湖湘”青年英才计划（2019RS2013）。

动物（BALB/c、C57BL/6，雄性，8–12周龄）饲养于厦门大学实验动物中心的特定病原体-free设施中。C57BL/6用作受体，BALB/c用作供体。所有操作均依照机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南进行。
注意：手术需要一套显微外科器械，包括显微剪刀、显微直镊、显微弯镊和显微持针器（表格与材料，图1B, C, D, E）。需要一对一次性使用的小型鳄嘴钳（图1F）。在显微镜下使用10号手术刀片切割定制的聚酰胺管，制备用于颈外静脉和颈总动脉的两个套管。静脉和动脉套管的直径分别为0.9 mm和0.55 mm。此外，相应静脉套管内管的直径为0.6 mm，相应动脉套管内管的直径为0.28&#160;mm（图1G）。
1. 受体准备
<ol>
	<li>使用戊巴比妥（60 mg/kg，腹腔注射）麻醉受体小鼠。使用无创机械剪毛器去除右侧颈外侧区域的毛发。</li>
	<li>用无菌棉签蘸取碘伏对手术区域进行消毒，随后用70%乙醇擦拭。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定于手术平台，用无菌纱布覆盖小鼠身体。</li>
	<li>使用眼科剪从颈部下三分之一中线处横向剪开，切口延伸至右侧肩锁关节。</li>
	<li>用显微弯镊分离右侧颈外静脉，充分暴露其长度，通过电凝切断分支，并在远端用6-0丝线结扎血管。</li>
	<li> proximally）用蚊式钳夹闭颈外静脉，随后用显微剪在结扎线近端横断静脉。</li>
	<li>用100 U/mL、0–4 °C的肝素化生理盐水冲洗血管腔，以清除残留血液。</li>
	<li>用显微直镊将颈外静脉通过静脉套管引出，将静脉内管插入血管腔作为支架，并用显微直镊将血管壁外翻覆盖在套管上（图2A）。</li>
	<li>用环形8-0丝线在套管近端固定外翻的血管内皮（图2B）。</li>
	<li>用显微直镊将静脉内管从血管中抽出。</li>
	<li>用显微弯镊钝性分离，暴露位于胸锁乳突肌内侧缘附近的右侧颈总动脉。</li>
	<li>用蚊式钳近端夹闭右侧颈总动脉，远端用6-0丝线结扎，并用显微剪在结扎线近端横断颈总动脉。</li>
	<li>用100 U/mL、0–4 °C的肝素化生理盐水冲洗颈总动脉，以清除残留血液。</li>
	<li>用显微直镊将颈总动脉穿过动脉套管，并将动脉内管插入动脉血管内（图2C）。</li>
	<li>用显微直镊将血管外翻覆盖在套管上，并用环形8-0丝线固定外翻的血管内皮（图2D）。</li>
	<li>用显微直镊将动脉内管从动脉血管中抽出。 
	注意：保留受体小鼠的下颌下腺。</li>
</ol>
2. 供体准备
<ol>
	<li>用戊巴比妥（60 mg/kg，腹腔注射）麻醉供体小鼠。使用无创机械剪毛器去除腹部区域的毛发。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定于手术台上，并用无菌纱布覆盖小鼠。</li>
	<li>用无菌棉签蘸取碘伏消毒剂擦拭手术区域，随后用70%乙醇脱碘。</li>
	<li>使用眼科剪在腹部正中线做切口，暴露腹腔。</li>
	<li>用显微弯镊暴露下腔静脉，然后经下腔静脉静脉注射每20 g体重200 μL、100 U/mL、0–4 °C的肝素化生理盐水。</li>
	<li>使用眼科剪行胸廓切开术，经双侧腋中线切口剪断肋骨，将前胸壁向外翻转以暴露胸腔。</li>
	<li>用显微弯镊切除胸腺。</li>
	<li>暴露主动脉，经主动脉弓向冠状动脉灌注200 µL、100 U/mL、0–4 °C的肝素化生理盐水。 
	注意：避免将任何气泡灌注入供体心脏。</li>
	<li>使用显微剪在主动脉弓起始处横断升主动脉。</li>
	<li>使用显微剪在左右肺动脉主干起始处分叉处横断肺动脉。</li>
	<li>使用6-0丝线近端结扎上腔静脉和下腔静脉，并用显微剪在结扎线远端剪断静脉。</li>
	<li>使用单根6-0丝线环形结扎所有肺静脉，然后用显微剪在结扎线远端剪断肺静脉分支。</li>
	<li>将心脏移植物从周围软组织中游离取出，并保存于0–4 °C的肝素化生理盐水中。</li>
</ol>
3. 心脏移植
<ol>
	<li>将供体心脏倒置于受体的右侧颈部区域。</li>
	<li>使用微型直镊将供体心脏的肺动脉穿入6-0丝线环中。</li>
	<li>将血管腔包裹在静脉套管上，然后收紧6-0丝线缝合环，固定套管以结扎血管吻合口。</li>
	<li>按照步骤3.2所述方法，完成移植物主动脉与动脉套管的吻合。</li>
	<li>依次松开夹闭的颈静脉和颈动脉。保持血管吻合口无扭曲，并确保血流通畅。 
	注：若窦性心律在1分钟内恢复至200次以上，视为正常。</li>
	<li>用预热（37 °C）的生理盐水湿润供体心脏，检查移植物是否出血。将搏动的心脏移植物置入皮下腔隙，随后缝合切口。</li>
</ol>
4. 术后护理与移植物评估
<ol>
	<li>记录复灌后恢复窦性心律的时间，以及夹闭解除后至少维持5分钟正常窦性心律的情况，以监测术后移植物功能。</li>
	<li>将受体单独置于保温毯上，直至其从麻醉中苏醒。手术结束时皮下注射布托啡诺镇痛剂（0.05 mg/kg），术后每12小时给药一次，持续72小时。</li>
	<li>每日记录受体体重及术后恢复状况。若体重较手术当日下降&#62;15%，或出现偏瘫、感染等情况，应通过终末期异氟烷吸入实施安乐死21。</li>
	<li>每日通过触诊监测移植物存活情况。若小鼠同种异体移植物存活超过&#62;72小时，则视为手术成功。移植物功能评分参照既往报道22：3级——搏动有力且频率正常；2级——搏动减弱；1级——颤动并即将发生排斥；0级——心脏停搏且完全排斥。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

小鼠心脏移植模型是移植免疫学研究的重要工具，可用于评估该模型的免疫机制，并且有大量基因修饰小鼠可供使用。然而，由于显微外科技术上的挑战，例如血管缝合与外翻操作，限制了该模型的广泛应用。在本研究中，我们探讨了小鼠心脏移植中某些核心技术难题，并取得了良好的结果。该方案中的一个关键步骤是将内管插入管腔作为支架，使血管壁能够翻转至套管外。这一优化步骤解决了因需要大幅拉伸而导致动脉血管外翻困难的技术问题。即使没有显微外科经验的人员，在经过两个月的培训后也可开始实施该技术，这将有助于推动该模型的广泛使用。
根据我们的经验，合适的内管可提高移植效果。内管的外径应略小于受体血管的内径。此外，应使用表面光滑的钝头聚丙烯管或圆筒作为临时内核，以避免损伤血管内皮。在我们的操作中，即使吻合口血栓形成是使用缝合技术后失败的主要因素，但在失败的5%模型中并未发生血栓。利用这些成熟的小鼠模型，我们的实验室已发表多篇基础研究论文，并得到了同行评审专家的认可14,15,<sup...

1973年，通过在腹部进行端对端吻合的小鼠异位心脏移植模型的建立，是基础移植免疫学研究中的一个重要里程碑1。该模型为分析缺血再灌注损伤2、免疫排斥反应以及免疫耐受的机制提供了重要且有效的工具3,4。然而，该手术操作复杂且耗时较长，加之存在感染风险，可能导致严重的围手术期腹腔粘连和炎症反应，从而导致异位心脏移植模型的建模效率较低。
颈动脉异位心脏移植技术最初由Chen于1991年描述5。在此模型中，受体的颈外静脉与移植物的肺动脉吻合，颈总动脉与移植物的升主动脉吻合。该方法的主要优点在于便于监测，并可减少对受体的创伤。同年，Matsuura描述了一种改进的技术，即将受体颈外静脉和颈总动脉的断端外翻至聚四氟乙烯（Teflon）套管上，并用环形丝线结扎固定6。一些研究人员在将套管插入受体颈外静脉之前，还会先将其固定于供体心脏的右肺动脉上7。迄今为止，套管技术已广泛应用于多种带血管蒂的器官移植模型中，包括肺8、肝9和肾10移植。
迄今为止，套管技术存在若干困难。例如，由于颈动脉具有额外的弹性，难以将其翻转至套管上，容易导致组织向后翻折。因此，完成此步骤可能需要额外的练习以及显微外科扩张器。此外，颈部血管的准备工作可能耗时长达25分钟。
为解决这些问题，我们引入了内管技术，该技术基于套管法，通过使用内管将套管固定于颈外静脉和颈动脉上，以辅助血管壁的外翻。此外，经过简单培训后，受体准备时间可缩短至15.5分钟。该技术降低了手术复杂性，无需额外练习或使用血管扩张器。该方法可广泛应用于所有移植免疫学研究，尤其适用于验证第三方免疫耐受的研究，即受体动物接受两个心脏异体移植物，一个位于腹腔，另一个位于颈部11。我们还建议由两位熟练的外科医生协作建立该模型，其中一位负责受体动物的准备，另一位负责供体心脏的获取与移植。这种合作模式可将手术总时间缩短至25分钟。通过这一优化的操作流程，我们已成功建立了同系、同种异体12,13,14,15,16,17,18,19以及异种小鼠心脏移植模型20。
建立内管技术的原理在于缩短小鼠心脏移植模型的手术时间，同时保持较高的成功率。与传统的缝合和套管技术相比，颈段心脏移植模型的优化有助于在较短的手术时间内获得较高的成功率21。此外，双人协作手术模式相较于单人操作，可进一步缩短供体心脏的热缺血时间。

<table><tbody><tr><td>动脉套管</td><td>自制</td><td></td><td>聚酰胺管，直径：0.55 mm，长度：1.0 mm</td></tr><tr><td>动脉内管</td><td>自制</td><td></td><td>聚酰胺管，直径：0.28 mm</td></tr><tr><td>显微弯镊</td><td>上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂</td><td>WA3050</td><td>1/8 弧形，尖端宽度：0.3 mm，无钩</td></tr><tr><td>显微持针器</td><td>上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂</td><td>WA2050</td><td>尖端宽度：0.2 mm</td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td>上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂</td><td>WA1050</td><td>直型，刀刃长度：10 mm</td></tr><tr><td>显微直镊</td><td>上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂</td><td>WA3060</td><td>尖端宽度：0.15 mm，无钩</td></tr><tr><td>Scanlan Vascu-Statt 血管夹</td><td>Scanlan International Inc</td><td>1001-531</td><td>夹闭压力：20&amp;ndash;25 克</td></tr><tr><td>静脉套管</td><td>自制</td><td></td><td>聚酰胺管，直径：0.9 mm，长度：1.2 mm</td></tr><tr><td>静脉内管</td><td>自制</td><td></td><td>聚酰胺管，直径：0.6 mm</td></tr></tbody></table>

小鼠心脏移植袖套法的技术优化

Optimization of the Cuff Technique for Murine Heart Transplantation

小鼠心脏移植手术已有40多年的历史。随着显微外科技术的进步，一些新技术已被用于提高手术效率。在我们的实验室中，我们对套管技术进行了两项主要优化。首先，我们采用内管技术，将一根临时内管插入颈外静脉和颈总动脉血管中，以方便将血管外翻覆盖在套管上。其次，我们通过两名经验丰富的外科医生协作，完成完全异位心脏移植。这些改进措施将手术时间有效缩短至25分钟，成功率高达95%。在本报告中，我们详细描述了这些操作步骤，并提供了补充视频。我们认为，本篇关于改进型套管技术的报告将为小鼠异位心脏移植提供实用的操作指导，并提升该小鼠模型在基础研究中的应用价值。

手术操作时间
经过训练后，熟练的外科医生使用内管技术可在35分钟内成功完成手术，其中受体准备约需15.5分钟，供体准备需10.9分钟，供体心脏吻合需4.4分钟。与使用套管技术但未使用内管技术及缝合技术的手术相比，冷缺血和热缺血时间（从供体准备到心脏植入）缩短至15.3分钟（表1）21。
我们设计了一种协作模式，以进一步提高操作效率。如示意图所示（图3），一名外科医生首先开始进行受体准备，4-5分钟后，另一名外科医生开始供体准备工作。约15-16分钟后，第一位外科医生应已完成受体准备，此时第二位外科医生也已完成供体心脏的获取，随即开始将供体心脏在受体体内进行吻合。该协作模式要求每位外科医生仅需接受套管技术中单一环节的培训，从而进一步将总手术时间缩短至约25分钟。一项分析显示 &gt;过去两年间，厦门大学器官移植研究所的两位外科医生合作完成了600例异位小鼠...

我们介绍一种内管辅助的套管技术，用于小鼠颈部异位心脏移植，以帮助将血管外翻覆盖在套管上。我们发现，两名经验丰富的外科医生相互配合可显著缩短手术时间。

小鼠心脏移植手术已开展超过40年。随着显微外科技术的进步，一些新技术已被用于……

大家好，我叫Dr.Zhongquan Qi。众所周知，套管技术自1991年以来已被用作心脏移植的方法。尽管在外科手术和新型手术技术方面已取得显著进展，但基于套管技术仍存在一些困难。这是一种揭示方式，他们将向您展示一种优化的半侧技术，该技术可显著提高手术效率。主要步骤是将一根临时导管插入护目镜中。校对 ISO 几乎完成了一半。插入导管技术。经验丰富的外科医生可在35分钟内完成手术，成功率可达95%。随后可使用热能外科手术模块，该模块可进一步提高手术效率，如在模拟中所示，手术时间将缩短至约35分钟。谢谢。这一步将配方与戊巴比妥的剂量关联起来。使用无创机械式剪毛器去除右侧颈后部区域的毛发。使用无菌棉签蘸取碘伏消毒剂擦拭手术区域，随后用70%乙醇擦拭。将小鼠仰卧位固定于手术平台上，并用无菌纱布覆盖小鼠。使用眼科剪从下三分之一 NACMEC 线至右侧肩锁关节处做横向切口。用显微弯镊分离右侧颈外静脉，充分暴露其长度。通过电凝切断分支。使用6-0缝线在远端定位血管。使用动脉夹近端夹闭颈外静脉，然后用显微剪刀将静脉向结扎处近端游离。用含有100单位/毫升肝素、4摄氏度的生理盐水冲洗血管腔，以去除任何残留血液。使用微型直镊将外部颈静脉穿过下腔静脉。将静脉内管作为支架插入血管腔内，并用微型直镊将其覆盖在血管壁的弯曲处。使用环形的8-0缝线在弯曲段近端固定刺激物Faso内皮。用微型直镊将静脉内管从静脉血管中抽出。用微型镊子进行钝性分离，以游离右侧颈总动脉，该动脉位于胸锁乳突肌内侧边缘附近。使用Babcock钳近端夹闭右侧颈动脉。使用6-0缝线定位远端的颈动脉。然后使用显微剪刀在结扎线近端横断颈动脉。用含有每毫升100单位、4摄氏度的肝素生理盐水冲洗颈动脉，以去除任何残留血液。将颈动脉穿过动脉弯管，使用显微直镊将动脉内管插入动脉血管中。使用显微直镊，将血管对准弯管上方。使用环状八到06缝线固定翻转的血管内皮。用显微直镊将动脉内端从动脉血管中抽出。麻醉方法及其感染处理与受体相同。使用眼科剪在腹部正中线做切口，暴露腹腔。用微弯镊子暴露下腔静脉，然后通过下腔静脉向体内静脉注射每20克体重200微升、含100单位/毫升、4摄氏度的肝素生理盐水。使用眼科剪进行开胸手术。通过腋前线 Romita 手术切口剪断肋骨。将前胸壁向外翻开，以暴露胸腔。使用显微镊子切除胸腺。暴露主动脉，然后通过主动脉弓向冠状动脉灌注200微升含100单位/毫升、4摄氏度的肝素生理盐水。使用显微剪在主动脉弓起始处横断升主动脉。使用显微剪刀在肺动脉两大主分支起始处横断肺动脉。利用6-0缝线大致定位上腔静脉和下腔静脉，并用显微剪刀在结扎线远端横断静脉。用一根6-06缝线将肺静脉整体环形定位，并使用显微剪刀在结扎线远端切断静脉分支。将心脏移植物从周围软组织中分离。将供体心脏倒置于受体的右侧颈部区域。用显微直镊将供体心脏的肺动脉插入6-0环线中。将血管腔绕过腔静脉，然后收紧6-0缝线环，使血管吻合口弯曲。进行移植物主动脉与动脉弓的吻合。随后松开结扎的颈静脉，再松开结扎的颈动脉。保持血管吻合并扭转，确保血流畅通无阻。将跳动的心脏移植物置入皮下腔隙，随后缝合切口。记录钳夹松开后恢复正常窦性心律的时间，以及钳夹松开后至少五分钟内维持正常窦性心律的情况，以监测术后移植物功能。将受体单独放置在一条毯子上，直至其从麻醉中苏醒。综上所述，尽管本手术采用的套管技术已有报道，但我们在此基础上建立了内核技术。通过优化技术降低了手术难度，并缩短了吻合时间。我们建议采用双手术结合的方案，以进一步提高示意图中所示手术操作的效率，且手术时间将缩短至约25分钟。完全MHC不匹配的BALB/C同种异体心脏移植物在移植到C57BL/6受体小鼠后，可在8天内被排斥。在我们的研究中，同系心脏移植除一例因术后体重较术前正常体重下降15%而罕见死亡外，其余均存活超过100天。移植后第7天的异体移植物组织病理学检查显示急性排斥反应的典型特征，包括大量细胞浸润和组织坏死。同系移植物接近正常，未见心肌细胞坏死或炎性细胞浸润的证据。同基因心脏移植后100天，可采集吻合部位的血管内皮并进行免疫荧光染色。本分析结果显示，血管壁未见异常狭窄、血栓形成或内膜增厚。电镜成像显示，内皮表面光滑，内皮细胞排列整齐紧密，表面无明显沉积物，且具有规则的纵向壳状结构。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

穆林心脏移植袖口技术的优化

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采用改良套管技术的小鼠颈部心脏移植模型

该论文描述了在小鼠中进行异位心脏移植所需的步骤。...

小鼠异位心脏移植技术

套管技术通过避免对小血管进行技术难度较高的缝合吻合，从而缩短并简化了小鼠异位颈部心脏移植模型的建立过程。本视频论文中展示的技术细节应有助于研究人员在其实验室中成功建立该模型。...

小鼠异位颈部心脏移植

本文介绍了一种在小鼠颈部分异位主动脉移植模型中应用无缝合套管技术的小鼠异位主动脉移植方案。该模型可用于研究慢性移植物血管病变（CAV）的潜在病理机制，并有助于评估新的治疗药物以预防其发生。...

采用改良无缝合套管技术的小鼠颈动脉主动脉移植模型

在本实验方案中，采用小鼠心脏移植模型来研究心脏同种异体移植物排斥反应的机制。在此异位心脏移植模型中，通过改良的套管技术进行颈部端对端吻合式心脏移植，可提高手术效率，并确保心脏移植物的存活。...

一种改良的套管法小鼠颈部异位心脏移植模型

小鼠心脏移植模型是研究移植免疫学的重要研究工具。本方案详细介绍了小鼠异位颈部心脏移植技术，该技术涉及在受体的颈总动脉和供体的肺动脉干上放置套管，以实现层流血流。...

利用血管套环的小鼠异位颈部心脏移植

本方案提供了利用套管技术在小鼠原位肝移植中进行血管重建的技术信息。...

小鼠原位肝移植中采用套管技术进行血管重建

本方案介绍了一种无需使用套管、基于缝合的鼠类颈部异位心脏移植技术，旨在通过生理条件下最小化异物材料干扰，可靠地植入第二个异位心脏移植物，以评估供体特异性免疫耐受。...

用于评估小鼠供体特异性免疫耐受的免套管缝合式颈部异位心脏移植模型

本方案介绍了一种简化的、端对侧缝合吻合技术，用于小鼠颈部心脏移植，为研究移植免疫学提供了一个稳定且可重复的模型。...

采用端侧吻合技术进行颈部异位小鼠心脏移植以研究移植免疫学

在本视频中，我们演示了从小鼠C57BL/6脾细胞中分离并激活扩增B细胞的实验步骤，这些B细胞可作为模型抗原呈递细胞（APC）用于研究免疫应答的诱导。...

小鼠B细胞CD40激活模型

了解优化小鼠心脏移植袖口技术的方法，通过内置管辅助血管外翻并采用双人协作模式，显著缩短手术时间并提高移植成功率。该技术为心脏移植手术效率提升提供了新方案。

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