缺血性心脏病模型及利用人诱导多能干细胞来源心肌细胞进行心肌细胞收缩的视频比较
2020年5月5日
我们介绍一种利用人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞建立的缺血性心脏病模型，以及一种用于定量评估缺血所致组织损伤的方法。该模型可为缺血性心脏病的药物筛选及深入研究提供一个有用的平台。
心脏病研究通常在啮齿类等小型哺乳动物中进行。然而，人类心脏的生理特性与啮齿类动物心脏存在显著差异。本实验方案采用由人诱导多能干细胞（iPS细胞）分化而来的心肌细胞，建立缺血性心脏病模型，并对缺血性心肌细胞的损伤程度及功能障碍进行定量分析。
该方案可能为利用来自个体患者的诱导性多能干细胞（iPS细胞）进行个性化药物筛选提供一种便捷的方法。正确处理iPS细胞至关重要，例如使用新鲜培养基，并缓慢且及时地更换培养基，以确保成功分化为功能性心肌细胞。本次实验操作将由实验室的博士研究生陈王演示，参与人员包括刘云、梁音和王梦雪。为诱导人诱导性多能干细胞向心肌细胞分化，首先用含1.675微克/毫升层粘连蛋白的PBS溶液100微升包被96孔培养板的各孔。
在37摄氏度孵育30分钟后，向每个孔中加入含有10微摩尔Y27632的200微升IPS维持培养基，其中包含3×10⁴个干细胞，并将培养板放回细胞培养箱中。24小时后，每孔更换为200微升IPS生长培养基，然后将培养板放回细胞培养箱中继续培养2至3天。当细胞达到70%至80%汇合度时。
向每个孔中加入200微升预热的分化培养基A，替换原有培养基，并将培养板放回细胞培养箱中继续孵育48小时。孵育结束后，缓慢吸去各孔中的上清液，每孔加入200微升预热的分化培养基B，然后将培养板重新放回细胞培养箱中。两天后，将上清液更换为每孔200微升预热的心肌细胞维持培养基，并将培养板放回细胞培养箱中继续培养，最长可培养30天。
为了评估心肌细胞的收缩性，安装粒子图像测速 ImageJ 插件，并使用相差显微镜和叉状物镜以每秒约 20 帧的速度记录细胞视频图像，持续约 10 秒。然后将视频文件保存为待分析的 API 格式，并按照指示创建文件夹结构。为了分析细胞位移的离散二维矢量场，启动 VG 软件，选择“插件”、“宏”和“编辑”，打开矢量分析功能。
ijm，然后点击运行，分析将自动进行。对于缺血处理，将每孔中的上清液更换为200微升无葡萄糖和血清的DMEM，然后将培养板放入低氧培养箱中，并向箱内通入氮气，维持箱内氧气浓度为2%，二氧化碳浓度为5%，持续24小时。成功分化的细胞在显微镜下可见自发性收缩，通常在不到20天内，约50%的培养孔中可观察到自发性收缩现象。
心脏标志物蛋白也可用于确认分化是否成功。缺血组的细胞在MTT实验中通常表现出较低的存活率，以及比常氧对照组更低的收缩能力。缺血组中碘化丙啶阳性细胞的比例也高于对照组，表明细胞损伤的发生率更高。重要的是，您需准确定位捕获板中的感兴趣区域，以便比较心肌细胞的收缩能力。
该技术可用于基于患者来源的诱导多能干细胞进行药物筛选，同时也为深入阐明缺血性心脏病的发病机制提供了独特的平台
概述
本文介绍了一种利用人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞（hiPS-CMs）建立缺血性心脏病模型的实验方案。该方法能够在缺血条件下定量评估细胞损伤和功能障碍，为心脏病研究及个体化药物筛选提供具有临床相关性的研究平台。
关键研究组成部分
科学领域
- 心血管研究
- 干细胞生物学
- 细胞生理学
背景
- 缺血性心脏病是全球范围内导致死亡的主要原因。
- 啮齿类动物模型虽常用，但其心脏生理特征与人类存在显著差异。
- 人诱导多能干细胞来源的心肌细胞为研究人类心脏疾病提供了更具相关性的模型。
- 亟需能够在一个基于人类背景的体系中同时支持疾病建模和药物筛选的平台。
研究目的
- 建立将人iPS细胞分化为心肌细胞的实验方案。
- 利用hiPS-CMs在体外模拟缺血性心脏病。
- 量化缺血条件下细胞损伤和功能障碍的程度。
使用的方法
- 利用连续培养基和层粘连蛋白包被的培养板将人iPS细胞分化为心肌细胞。
- 在缺氧培养箱中，通过将hiPS-CMs暴露于2%氧气及无葡萄糖/无血清培养基中24小时以诱导缺血。
- 采用MTT检测和碘化丙啶染色评估细胞活力。
- 通过相差显微镜结合粒子图像测速软件进行位移矢量场分析，测量细胞收缩力。
主要结果
- 缺血条件下，受损细胞比例增加，表现为碘化丙啶染色增强。
- 与对照组相比，缺血组细胞活力下降。
- 在缺血条件下，人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPS-CMs）的收缩能力降低。
- 约50%的培养孔在分化后20天内出现自发性收缩。
结论
- 该方案利用人源心肌细胞，为缺血性心脏病提供了一种可靠的体外模型。
- 该系统可对细胞损伤和功能障碍进行定量分析。
- 该模型适用于缺血性心脏病的个体化药物筛选及深入的机制研究。
常见问题
行业重要性概述
人诱导多能干细胞（iPSC）来源的心肌细胞模型弥补了啮齿类动物研究与人类心脏疾病之间的转化鸿沟，为缺血性心脏病的早期发现提供了更具预测性的研究平台。基于视频的定量收缩力分析和细胞活力检测可为目标靶点验证和作用机制去风险化提供可操作的数据支持。该平台有助于在心血管药物研发中进行风险评估优化的投资组合决策，并支持个性化药物筛选策略。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在与人类相关的系统中研究缺血性损伤机制。
- 通过定量收缩力和活力检测，支持功能靶点的验证。
- 通过模拟与疾病相关的细胞反应，助力机制层面的风险评估。
- 提高心血管项目早期组合筛选的预测可靠性。
筛选与检测方法开发
- 提供标准化的hiPSC心肌细胞平台，用于可重复的化合物评价。
- 通过位移矢量场分析提供定量的收缩力指标。
- 支持基于视频的高通量筛选，用于评估缺血条件下的功能损伤。
- 支持下游药物筛选和机制研究的检测就绪应用。
转化与临床前研究
- 将体外研究结果与人类疾病生物学相整合，实现转化研究的连续性。
- 可利用患者来源的细胞进行个体化药物反应谱型分析。
- 减少对非人类模型的依赖，提高临床前数据的疾病相关性。
- 在具有临床相关性的背景下支持生物标志物的发现与验证。
流程与工作流整合
这种hiPSC心肌细胞缺血模型通过提供人类特异性的功能和存活率终点指标，在早期发现、先导物识别和转化研究之间架起了桥梁。
- 发现生物学：量化缺血性损伤和收缩功能障碍，用于假设检验和通路分析。
- 筛选：提供可重复、定量的收缩力和活力检测结果，用于化合物初筛。
- 分析：整合基于视频的位移分析与活力检测，实现可靠的统计学比较。
- 转化研究：支持患者特异性建模，并促进生物标志物与临床终点的关联分析。
- 企业级复用：建立可复用、可扩展的平台，用于心血管药物发现和机制研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：标准化功能检测方法，支持可扩展、可重复的工作流程。
- 战略价值：为决策提供依据，通过降低后期生物学风险提升资本使用效率。
- 组合影响：实现基于风险调整的心血管领域项目的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备 hiPSC 培养、分化及心肌标志物验证方面的专业知识。
- 需要具备低氧培养箱、相差显微镜和视频分析软件的使用条件。
- 要求跨团队标准化操作，以确保实验的可重复性和数据的可比性。
- 针对不同患者来源的 iPSC 系或疾病亚型，可能需要进行方案调整。
- 准确的收缩力比较依赖于谨慎选择感兴趣区域。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:05
Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC) Cardiac Differentiation Induction
2:30
Induced Pluripotent Stem Cell-Cardiomyocyte (iPS-CM) Contractility Assessment
3:15
Ischemia Exposure
3:42
Results: Representative Cardiac Cell Differentiation
4:27
Conclusion
