Name: 使用寨卡病毒对 埃及伊 蚊的载体能力分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 了解寨卡病毒载体能力分析方法，使用埃及伊蚊评估不同地理种群传播风险。该实验技术帮助研究人员精准控制病毒株与蚊种，为公共卫生防控策略提供关键数据支持。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢世界新发病毒和节肢动物传播病毒参考中心（WRCEVA）的工作人员：Robert Tesh博士、Hilda Guzman、Kenneth Plante博士、Jessica Plante博士、Dionna Scharton和Divya Mirchandani，感谢他们为整理和提供用于本研究组及其他研究组媒介传播能力实验的多种病毒株所付出的不懈努力。本研究工作由McLaughlin博士后基金（SRA）以及美国国立卫生研究院（NIH）资助项目AI120942和AI121452支持。

本方案中执行的所有操作均完全遵守由伽利略德克萨斯大学医学分部机构生物安全委员会和机构动物护理与使用委员会批准的规程&#160;。
1. 在 Vero 细胞中扩增 ZIKV
<ol>
	<li>在含有10% v/v热灭活胎牛血清（FBS）和1%（v/v）青霉素-链霉素（分别为100 U/mL和100 μg/mL）的杜尔贝科改良伊格尔最低必需培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO2的湿化培养箱内，将Vero细胞（CCL-81或VeroE6）培养至150 cm2组织培养瓶中细胞融合度达80−90%。</li>
	<li>在生物安全柜（BSC）中，吸去培养基，并将其弃置于10%漂白剂或双季铵盐工作稀释液中（材料表）。立即接种1 mL病毒原液，使每个细胞感染0.1−1个感染性病毒颗粒。轻轻振荡培养瓶，确保接种物完全覆盖单层细胞。</li>
	<li>用补充了2% v/v热灭活FBS和1%（v/v）青霉素-链霉素的DMEM将培养基补足至5 mL体积。随后将培养瓶置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育60分钟。</li>
	<li>从培养箱中取出培养瓶并移入生物安全柜（BSC）中。使用补充了2% v/v热灭活FBS和1%（v/v）青霉素-链霉素的DMEM，将培养基补充至总体积15 mL。再将培养瓶放回37 °C、5% CO2的湿化培养箱中继续培养。</li>
	<li>每日在相差显微镜下观察培养瓶，检查细胞病变效应（CPE）的出现。当单层细胞中约有40−50%的细胞仍存活时，进行病毒收获（步骤1.7），通常在感染后3−5天完成，具体时间取决于所使用的ZIKV毒株。</li>
	<li>吸出上清液并转移至50 mL锥形管中。通过离心（3,500 x g，20分钟）去除细胞碎片，澄清上清液。 
	注：若多个培养瓶以相同方式感染，可将多个培养瓶的上清液合并至50 mL锥形管中。</li>
	<li>将50 mL锥形管中的上清液小心转移至新的离心管中，注意避免扰动沉淀。加入热灭活FBS使终浓度达到30%（v/v）。将此混合液分装至带螺旋盖的离心管中，于-80 °C冷冻保存，待后续使用。</li>
</ol>
2. 人工血餐的制备
<ol>
	<li>在蚊虫暴露于感染性血餐的当天，在节肢动物 containment 设施中打开电源（材料表），确保在蚊虫准备就绪前，喂饲装置（材料表）已预热完毕。</li>
	<li>采用以下方法之一制备人工血餐。
	<ol>
		<li>方法1：将商业购买的新鲜采集（一周内）的枸橼酸盐或肝素抗凝人血与病毒原液（按第1节所述方法制备）按1:1体积比混合。 
		注：此方法的前提是血液中不存在针对该病毒或病毒科的任何抗体。</li>
		<li>若无法确认无抗体存在，或已知血源曾暴露于黄病毒，需洗涤并手动浓缩红细胞。
		<ol>
			<li>在生物安全柜（BSC）内，将30 mL全人血加入50 mL锥形管中，并用磷酸盐缓冲液（PBS）补至50 mL。</li>
			<li>以3,500 × g 离心20分钟。</li>
			<li>通过轻轻倾倒至上层托盘（内含10%次氯酸钠或双季铵盐工作液）的方式吸除上清液，注意勿丢弃红细胞沉淀。</li>
			<li>加入10 mL PBS，轻敲锥形管底部，使其紧贴生物安全柜底部，以重悬红细胞沉淀。再用PBS补至50 mL总体积，通过轻柔倒置混匀。</li>
			<li>重复步骤2.2.2.1−2.2.2.4共4−6次，直至上清液澄清或仅微呈粉红色且不再浑浊。用移液管彻底移除所有上清液，将红细胞沉淀重悬于1−2 mL PBS中。</li>
			<li>配制血餐：350 μL浓缩红细胞、100 μL 10%蔗糖、200 μL热灭活胎牛血清（FBS）、900 μM重组ATP，以及用补充了2% v/v热灭活FBS和1%（v/v）青霉素-链霉素的DMEM稀释适量的病毒原液，总体积为2 mL。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用未感染小鼠的皮肤覆盖标准3 mL储液单元（材料表）（其他可选材料包括石蜡膜、胶原膜或香肠肠衣）。</li>
	<li>将覆盖好的储液器置于白色纸巾上。每次加入约1 mL感染性血餐，分次共加入约2 mL。检查喂饲器下方纸巾是否有渗漏迹象。若发现渗漏，回收血餐并丢弃覆盖物。用塞子密封喂饲器，再次确认无渗漏。</li>
</ol>
3. 血餐回滴定/噬斑测定
<ol>
	<li>使用已制备的血液餐剩余体积，用添加了2% v/v热灭活胎牛血清（FBS）和1% v/v青霉素-链霉素的DMEM培养基进行10倍系列稀释（即6个稀释度，从10倍稀释至1,000,000倍稀释）。</li>
	<li>将稀释液从最稀释到最浓缩的顺序，每孔加入100 µL至24孔或12孔板的孔中。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2培养箱中孵育1小时。</li>
	<li>1小时孵育结束后，将培养板移回生物安全柜（BSC），并分别向24孔板或12孔板中加入1 mL或2 mL甲基纤维素覆盖层。</li>
	<li>将加有覆盖层的培养板放回37 °C、5% CO2培养箱中，孵育3−7天（取决于病毒株）。</li>
	<li>孵育结束后，从培养箱中取出培养板并移入生物安全柜。将甲基纤维素覆盖层弃入含有10%漂白剂或双季铵盐消毒剂的托盘中。</li>
	<li>用PBS洗涤每个孔2次，每次洗涤液均弃入含有10%漂白剂或双季铵盐的托盘中。</li>
	<li>加入约1 mL甲醇:丙酮（1:1 v:v），在室温（RT）下的生物安全柜中固定细胞至少30分钟。根据机构对有机废弃物的处理政策丢弃甲醇:丙酮。</li>
	<li>使用以下两种方法之一检测ZIKV。
	<ol>
		<li>去除甲醇:丙酮后，立即用结晶紫溶液（0.25% w/v溶于30%甲醇）染色5分钟。用自来水冲洗2次，晾干后直接肉眼观察是否存在噬斑或单层细胞破坏。</li>
		<li>或者进行焦点形成实验。
		<ol>
			<li>让培养板自然风干，直至无有机固定剂残留。 
			注：在生物安全柜外自然风干约需2−3小时，也可在生物安全柜或化学通风橱中加速风干。</li>
			<li>在非无菌PBS（不含Mg2+和Ca2+）中，使用轨道摇床对每个孔洗涤3次，每次15分钟。吸去PBS后，每孔加入1 mL封闭液（PBS + 3% FBS），室温下摇动封闭15分钟。</li>
			<li>每孔加入100 μL α-ZIKV或α-黄病毒属的一抗（例如黄病毒属广谱杂交瘤D1-4G2-4-15 [4G2]），用封闭液按1:2,000稀释。室温下轻轻摇动孵育至少4小时（建议过夜，但不超过18小时）。</li>
			<li>吸去一抗，使用轨道摇床在PBS（不含Mg2+和Ca2+）中洗涤3次，每次15分钟。</li>
			<li>每孔加入100 µL二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG），用封闭液按1:2,000稀释。室温下摇动孵育1小时。</li>
			<li>使用轨道摇床在PBS（不含Mg2+和Ca2+）中洗涤3次，每次15分钟。</li>
			<li>每孔加入100 µL底物显色试剂（材料表）。室温下轻轻摇动反应15分钟。</li>
			<li>当焦点/噬斑显现后，立即移除底物，并用自来水冲洗培养板2次以终止反应。倒掉自来水后，将培养板风干，再进行定量分析。</li>
			<li>计数病毒焦点，以确定给定样本中的FFU数量。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 血餐的给予
<ol>
	<li>使用 埃及伊蚊 羽化后2−4天的蚊子。将雌蚊分选至带筛网盖的0.5 L纸板箱中，并停止供应糖源（通常在感染性血餐前36−48小时开始）。提供 随意摄取 通过水分饱和的棉球提供水分。</li>
	<li>在蚊子将暴露于感染性血餐的当天早晨，移除已吸饱水的棉球。</li>
	<li>将含有人工血餐的储液器连接到透明塑料手套箱内 feeding unit 的导管上。</li>
	<li>在手套箱内放置一个带筛网盖的0.5 L纸板箱，其中装有50−100只饥饿的 埃及伊蚊 蚊子，位于连接储液器的饲喂装置下方。 
	注意：适当饥饿的蚊虫通常会在20分钟内吸血。可根据需要延长喂血时间以增加较慢吸血种群的样本量，但总时长不应超过60分钟，因为约60分钟后喂血装置内的寨卡病毒（ZIKV）滴度可能下降。</li>
	<li>喂食结束后，移除储液器并浸入新配制的10%次氯酸钠溶液中。</li>
	<li>将蚊子置于-20 °C环境中孵育30秒，或在冰箱中孵育5分钟，以低温麻醉。</li>
	<li>在手套箱内，将蚊子倒入置于冰上的培养皿中。计数并区分吸血完全的雌蚊与未吸血的蚊子。将未吸血的蚊子浸入装有70%乙醇的50 mL离心管中销毁。在蚊子仍处于麻醉状态时，将其倒回0.5 L纸箱中，并迅速盖上金属网和盖子。修剪纸箱上多余的金属网，用胶带固定网罩。</li>
	<li>在每个纸盒的网罩内放入一个浸透无菌过滤10%蔗糖水溶液的棉球。将所有蚊虫纸盒置于一个较大的塑料次级容器中，并放入一块湿润的海绵以维持湿度。</li>
	<li>将装有蚊虫纸盒的次级容器放入培养箱中，培养箱温度设置为 27 ± 1 °C（或根据目标地区条件适当调整），相对湿度为 80% ± 10%，光照周期为 16 小时光照：8 小时黑暗。保持蚊虫的饲养条件为 随意摄取 实验完成前可自由获取10%蔗糖溶液。</li>
</ol>
5. 样本采集与处理
<ol>
	<li>在饲血后的指定天数，使用机械吸虫器在手套箱内从相应的纸盒中吸取预定数量的蚊虫。收集到所需数量的蚊虫后，用棉塞封住收集管管口。</li>
	<li>将蚊虫置于 -20 °C 冷冻 30 秒，或置于 4 °C 冷却 5 分钟，以进行低温麻醉。</li>
	<li>在手套箱内，将蚊虫倒入置于冰上的培养皿中。使用两对镊子，取下每只蚊虫的全部六条腿，并放入预先标记的含有灭菌不锈钢研磨珠（7/32”）和 500 μL 蚊虫收集液（MCM，由 DMEM、2% FBS、1% 青霉素-链霉素和 2.5 μg/mL 两性霉素 B 组成）的 2 mL 圆底微量离心管中。</li>
	<li>将蚊虫轻轻放置于一滴矿物油中以固定，注意避免矿物油与蚊虫头部及喙部接触。</li>
	<li>将蚊虫的喙插入装有 10 μL 热灭活 FBS 的 10 μL 移液器吸头中。 
	注意：也可使用蔗糖、血液或矿物油填充移液器吸头。矿物油可使唾液气泡在光学显微镜下直接可视化。</li>
	<li>让蚊虫唾液分泌 30 分钟。将含有 FBS 与唾液的微量移液器吸头弹入含有 100 μL MCM 的微量离心管中，然后将蚊虫尸体放入另一个含有灭菌钢珠和 500 μL MCM 的 2 mL 圆底微量离心管中。确保用于存放尸体、腿部和唾液的离心管均做好标记，以便明确三份样本均来自同一只蚊虫。</li>
	<li>在蚊虫进行唾液分泌的同时，对剩余蚊虫执行步骤 5.3−5.5。</li>
	<li>将装有尸体和腿部的离心管转移至生物安全柜内的珠磨组织匀浆仪中。在 26 Hz 条件下对所有尸体和腿部样本进行 5 分钟的匀浆处理，以释放病毒颗粒至上清液中。以 200 x g 离心 5 分钟，清除细胞碎片，获得澄清上清液。 
	注意：此时样本可于 -80 °C 冻存，或立即进行检测。</li>
</ol>
6. 通过感染性实验检测寨卡病毒（ZIKV）
<ol>
	<li>在生物安全柜中，于感染实验开始前24小时，准备含Vero细胞的24孔细胞培养板（每孔105个细胞）。为每孔标记单一蚊虫/样本的标识。</li>
	<li>若样本曾于-80 °C冷冻保存，需使其完全解冻。</li>
	<li>在接种样本前，逐板移除Vero细胞培养板中的培养基。</li>
	<li>对于含有蚊虫体或足的样本，小心吸取100 μL澄清上清液加入各孔中，注意避免扰动沉淀中的蚊虫细胞碎片。 
	注意：如需保留样本用于后续滴定，唾液样本可在接种前用MCM按1:1（v/v）稀释。</li>
	<li>将培养板转移至37 °C、5% CO2的培养箱中，孵育1小时。</li>
	<li>将培养板移回生物安全柜，向每孔加入约1 mL甲基纤维素覆盖层。将加有覆盖层的培养板重新放回37 °C、5% CO2培养箱中，孵育3−7天（根据病毒/毒株而定）。</li>
	<li>按照步骤3.6−3.9所述进行固定和显色处理。</li>
	<li>在进行焦点形成实验评分时，通过光学显微镜观察对阳性孔进行定量。若某孔中细胞出现胞质内染色，则表明存在病毒。样本仅被判定为焦点阳性或阴性。</li>
</ol>

<ol><li>Azar, S. R., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+Competence%3A+What+Has+Zika+Virus+Taught+Us%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us.</a> Viruses. 11 (9), 867(2019).</li>
<li>Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+vector+competence+studies%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%2C+Genetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti vector competence studies: A review.</a> Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).</li>
<li>Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+in+the+Mosquito+Vector+Aedes+taeniorhynchus%3A+Infection+Initiated+by+a+Small+Number+of+Susceptible+Epithelial+Cells+and+a+Population+Bottleneck%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck.</a> Virology. 372 (1), 176-186 (2008).</li>
<li>Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arboviral+bottlenecks+and+challenges+to+maintaining+diversity+and+fitness+during+mosquito+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission.</a> Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).</li>
<li>Kramer, L. D., Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+vectorial+capacity+for+mosquito-borne+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses.</a> Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).</li>
<li>Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+Barriers+for+Western+Equine+Encephalomyelitis+Virus+in+Culex+tarsalis+infected+after+Ingestion+of+Low+Viral+Doses%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).</li>
<li>Lounibos, L. P., Kramer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasiveness+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+and+Vectorial+Capacity+for+Chikungunya+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214, suppl 5 453-458 (2016).</li>
<li>Heitmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+Salivation+as+a+Method+to+Analyze+Vector+Competence+of+Mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57980(2018).</li>
<li>Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Mosquito+Vector+Competence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Genetics of Mosquito Vector Competence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).</li>
<li>Guo, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culex+pipiens+quinquefasciatus%3A+a+potential+vector+to+transmit+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus.</a> Emerging Microbes & Infections. 5 (9), 102(2016).</li>
<li>Secundino, N. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+transmission+to+mouse+ear+by+mosquito+bite%3A+a+laboratory+model+that+replicates+the+natural+transmission+process%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process.</a> Parasites & Vectors. 10 (1), 346(2017).</li>
<li>Smith, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+Transmission+and+Effect+on+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).</li>
<li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+of+Zika+Virus+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis.</a> Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).</li>
<li>Morrison, T. E., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Zika+Virus+Infection%2C+Pathogenesis%2C+and+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity.</a> Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).</li>
<li>Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Overview+of+Animal+Models+for+Arthropod-Borne+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses.</a> Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).</li>
<li>Rossi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Novel+Murine+Model+to+Study+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).</li>
<li>Styer, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquitoes+inoculate+high+doses+of+West+Nile+virus+as+they+probe+and+feed+on+live+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts.</a> PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).</li>
<li>Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+infected+Aedes+aegypti+collected+during+a+Zika+virus+outbreak+have+viral+titres+consistent+with+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission.</a> Emerging Microbes & Infections. 8 (1), 242-244 (2019).</li>
<li>Dzul-Manzanilla, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+vertical+transmission+and+co-circulation+of+chikungunya+and+dengue+viruses+in+field+populations+of+Aedes+aegypti+%28L.%29+from+Guerrero%2C+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).</li>
<li>Grard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+in+Gabon+%28Central+Africa%29+%E2%80%93+2007%3A+a+new+threat+from+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681(2014).</li>
<li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+epidemiology+reveals+multiple+introductions+of+Zika+virus+into+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States.</a> Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).</li>
<li>Guerbois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+Zika+Virus+Infection%2C+Chiapas+State%2C+Mexico%2C+2015%2C+and+First+Confirmed+Transmission+by+Aedes+aegyti+Mosquitoes+in+the+America%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).</li>
<li>Lundstrom, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sindbis+virus+polyarthritis+outbreak+signalled+by+virus+prevalence+in+the+mosquito+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702(2019).</li>
<li>Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemic+yellow+fever+caused+by+an+incompetent+mosquito+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Medicine+and+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector.</a> Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).</li>
<li>Brown, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+Mosquito+Traps+in+Measuring+Species+Abundance+and+Composition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).</li>
<li>Gorsich, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+assessment+of+adult+mosquito+trapping+methods+to+estimate+spatial+patterns+of+abundance+and+community+composition+in+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa.</a> Parasites & Vectors. 12 (1), 462(2019).</li>
<li>Azar, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZIKV+Demonstrates+Minimal+Pathologic+Effects+and+Mosquito+Infectivity+in+Viremic+Cynomolgus+Macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques.</a> Viruses. 10 (11), 661(2018).</li>
<li>Azar, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Vector+Competency+of+Aedes+albopictus+Populations+from+the+Americas+for+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).</li>
<li>Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Support+for+the+Transmission-Clearance+Trade-Off+Hypothesis+from+a+Study+of+Zika+Virus+Delivered+by+Mosquito+Bite+to+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice.</a> Viruses. 11 (11), 1072(2019).</li>
<li>Hart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Vector+Competency+of+Mosquitoes%2C+Gulf+Coast%2C+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).</li>
<li>Karna, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonized+Sabethes+cyaneus%2C+a+Sylvatic+New+World+Mosquito+Species%2C+Shows+a+Low+Vector+Competence+for+Zika+Virus+Relative+to+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti.</a> Viruses. 10 (8), 434(2018).</li>
<li>Roundy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+Aedes+aegypti+Mosquito+Competence+for+Zika+Virus+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).</li>
<li>Wilson, A. J., Harrup, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+and+relevance+in+insect-arbovirus+infection+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies.</a> Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).</li>
<li>Hagan, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dehydration+prompts+increased+activity+and+blood+feeding+by+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6804(2018).</li>
<li>Guo, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Feeding+Patterns+of+Mosquitoes+in+a+Rural+Malaria-Endemic+Region+in+Hainan+Island%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Mosquito+Control+Association%22%5BJournal%5D)">Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).</li>
<li>Kuno, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+history+of+laboratory+breeding+of+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29+focusing+on+the+origins+and+use+of+selected+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains.</a> Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).</li>
<li>Mayilsamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+Long+Viability+of+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29+Eggs+Stored+Under+Normal+Room+Condition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition.</a> Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).</li>
<li>Althouse, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+Zika+Virus+to+Establish+a+Sylvatic+Transmission+Cycle+in+the+Americas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055(2016).</li>
<li>Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fever+from+the+forest%3A+prospects+for+the+continued+emergence+of+sylvatic+dengue+virus+and+its+impact+on+public+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).</li>
<li>Vasilakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+ancestral+sylvatic+dengue-2+viruses+to+re-emerge%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge.</a> Virology. 358 (2), 402-412 (2007).</li>
</ol>

作者无任何披露信息。

本文所述方法提供了一种开展媒介效能分析的通用工作流程。作为一个通用框架，这些方法中的许多在现有文献中均被广泛采用。然而，该流程在实际应用中仍存在较大的修改空间（详见 Azar 和 Weaver1 的综述）。已知病毒因素（如病毒谱系、攻毒病毒的保存方式、病毒传代历史）、昆虫学因素（如蚊虫种群的实验室驯化、蚊虫先天免疫、蚊虫微生物组/病毒组）以及实验变量（如血餐成分、连续血饲、孵育温度）均会影响媒介效能。在寨卡病毒（ZIKV）暴发的背景下，媒介效能研究中方法学的差异性已带来显著问题，因其阻碍了系统性荟萃分析的开展1,33。
在该通用方法中，适当饥饿处理蚊虫以及血液餐成分的重要性再怎么强调也不为过。已知脱水会促使蚊虫在实验室范式中表现出吸血行为。34，强调了在提供感染性血餐前进行糖源和水源饥饿处理的重要性。尽管在接触血餐前对蚊虫进行36–48小时的糖源剥夺和2–4小时的水源剥夺...

媒介能力（vector competence）是指特定节肢动物（如蚊子、蜱或白蛉）在物种、种群甚至个体水平上，通过在节肢动物体内进行复制或发育，生物学性地获取并传播病原体的能力1,2。对于蚊子和节肢动物传播的病毒（即虫媒病毒，arboviruses），雌性蚊子从病毒血症宿主体内吸食摄入病毒。摄入后，病毒必须成功感染中肠上皮细胞中的少数细胞3，并克服多种生理障碍，例如消化酶引起的蛋白水解降解、肠道微生物群的存在（中肠感染屏障，MIB）以及分泌的围食膜基质。中肠上皮感染之后，病毒需进行复制，并最终从中肠逸出进入蚊子的开放式循环系统（即血淋巴），这一过程标志着弥散性感染的开始，并突破了中肠逸出屏障（MEB）。此时，病毒可感染次级组织（如神经、肌肉和脂肪体）并持续复制，尽管此类次级复制对于病毒感染唾液腺腺泡细胞（突破唾液腺感染屏障）并非绝对必要。病毒从唾液腺腺泡细胞释放至其顶端腔隙，再进入唾液导管，从而在蚊子叮咬后续宿主时将病毒 inoculate（接种）入新宿主体内，完成传播循环1,2,4,5,6,7。
鉴于蚊媒体内这一机制已被充分表征且在不同蚊种间普遍保守，实验室对媒介能力的评估通常在方法学上较为相似，尽管各研究间的具体方案仍存在差异1,2。通常情况下，在蚊子经口暴露于病毒后，需将其解剖，以便分别检测中肠、足、卵巢或唾液腺等组织中的病毒感染情况、扩散性感染、扩散性感染/潜在的经卵传播，以及扩散性感染/潜在的传播能力8。然而，仅在唾液腺中检测到病毒并不足以确证其具有传播能力，因为在某些媒介-病毒组合中存在唾液腺逃逸/释放屏障（SGEB）的证据1,2,4,5,7,9。目前证明传播能力的标准方法仍是通过蚊子将病毒传播给易感动物10,11,12。然而，对于许多节肢动物传播病毒而言，该方法需要使用免疫缺陷的小鼠模型13,14,15,16，因而往往成本过高而难以实施。一种常用的替代方法是收集蚊子的唾液，随后可通过反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）或感染性检测来分析病毒基因组或感染性病毒颗粒的存在。需要注意的是，此类体外唾液收集方法可能高估12或低估17活体吸血过程中实际沉积的病毒量，表明对此类数据的解读必须谨慎。尽管如此，从唾液中病毒是否存在的角度分析，该体外方法仍具有重要价值，可用于指示传播潜力。
确定蚊媒在虫媒病毒病暴发中作用的主要方法有两种。第一种方法是现场监测，即在病毒活跃传播的背景下采集蚊虫样本18,19,20,21,22,23,24。然而，由于感染率通常极低（例如，在美国寨卡病毒（ZIKV）活跃传播地区，蚊虫的估计感染率为0.061%21），对潜在传播媒介种类的归因可能严重受到捕蚊方法25,26和随机因素的影响（例如，在1600只未感染个体中恰好采样到1只感染个体）21。考虑到这一点，某项研究可能在蚊虫数量总数或物种多样性方面均不足以充分代表参与传播的蚊虫群体。相比之下，媒介效能分析在实验室条件下进行，可严格控制口服接种剂量等参数。尽管此类实验尚不能完全模拟自然环境中蚊虫感染与传播能力的真实复杂性，但这些实验室评估仍是虫媒病毒学领域中的有力工具。
基于多种蚊媒种类、种群和方法对寨卡病毒（ZIKV）进行的媒介能力分析27,28,29,30,31,32，以及近期关于媒介能力评估的综述1，本文描述了典型媒介能力研究流程中的若干实验方案。在这些实验中，来自美洲地区的三个埃及伊蚊（Ae. aegypti）种群（巴西萨尔瓦多市、多米尼加共和国以及美国德克萨斯州里奥格兰德河下游河谷地区）通过人工血餐暴露于单一ZIKV毒株（Mex 1-7，GenBank登录号：KX247632.1），感染剂量分别为4、5或6 log10 焦点形成单位（FFU）/mL。随后，在不同的外潜伏期（2、4、7、10和14天）后，通过组织解剖和基于细胞培养的感染性检测方法，分析蚊虫的感染证据、播散性感染以及传播能力。尽管当前的工作流程/方案针对ZIKV进行了优化，但其中许多环节可直接适用于其他在节肢动物防护与生物安全二级或三级（ACL/BSL2 或 ACL/BSL3）条件下研究的蚊媒虫媒病毒。

<table><tbody><tr><td>3 mL 标准储液器</td><td>R37P30</td><td>Hemotek Ltd</td><td>昆虫饲养设备</td></tr><tr><td>7/32&quot; 不锈钢 440C 级钢珠</td><td>4RJH9</td><td>Grainger</td><td>研磨介质</td></tr><tr><td>丙酮，组织学级，Fisher Chemicals，聚乙烯瓶装，4 L，每箱 4 瓶</td><td>A16-P4</td><td>FisherScientific</td><td>固定剂</td></tr><tr><td>腺苷-5'-三磷酸二钠盐水合物，微生物来源，BioReagent，适用于细胞培养</td><td>A6419-1G</td><td>MilliporeSigma</td><td>试剂</td></tr><tr><td>抗黄病毒属群特异性抗原抗体，克隆号 D1-4G2-4-15</td><td>MAB10216</td><td>MilliporeSigma</td><td>蚀斑形成实验用一抗</td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG (H+L) 抗体，经人血清吸附且辣根过氧化物酶标记，1.0 mL/瓶</td><td>5450-0011</td><td>KPL/Seracare</td><td>蚀斑形成实验用二抗</td></tr><tr><td>次氯酸钠溶液（漂白剂）</td><td>NC0427256</td><td>FisherScientific</td><td>去污消毒</td></tr><tr><td>Corning 细胞培养处理烧瓶，150 cm²，带透气盖，每箱 50 个</td><td>10-126-34</td><td>FisherScientific</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>Costar 细胞培养板，24 孔，每袋 5 块，每箱 100 块，Corning</td><td>07-200-740</td><td>FisherScientific</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>Costar 细胞培养板，96 孔，每袋 5 块，每箱 100 块，Corning</td><td>07-200-91</td><td>FisherScientific</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>C0775-100G</td><td>MilliporeSigma</td><td>染色剂</td></tr><tr><td>Eppendorf Snap Cap 微量离心安全锁 2 mL 管，每箱 500 支</td><td>05-402-7</td><td>FisherScientific</td><td>塑料耗材</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 圆锥形离心管</td><td>14-959-70C</td><td>FisherScientific</td><td>塑料耗材</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 圆锥形离心管</td><td>14-959-49A</td><td>FisherScientific</td><td>塑料耗材</td></tr><tr><td>Falcon 一次性聚苯乙烯移液管，10 mL，每箱 200 支</td><td>13-675-20</td><td>FisherScientific</td><td>塑料耗材</td></tr><tr><td>Falcon 一次性聚苯乙烯移液管，1 mL，每箱 1000 支</td><td>13-675-15B</td><td>FisherScientific</td><td>塑料耗材</td></tr><tr><td>Falcon 一次性聚苯乙烯移液管，25 mL，每箱 200 支</td><td>13-675-30</td><td>FisherScientific</td><td>塑料耗材</td></tr><tr><td>Falcon 一次性聚苯乙烯移液管，5 mL，每箱 200 支</td><td>13-675-22</td><td>FisherScientific</td><td>塑料耗材</td></tr><tr><td>Falcon 标准组织培养皿</td><td>08-772B</td><td>FisherScientific</td><td>塑料耗材</td></tr><tr><td>胎牛血清-优质，500 mL</td><td>S11150</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>细胞培养试剂</td></tr><tr><td>Fisherbrand 经济型普通载玻片，玻璃材质</td><td>12-550-A3</td><td>FisherScientific</td><td>蚊虫固定</td></tr><tr><td>FU1 饲喂装置</td><td>FU1-0</td><td>Hemotek Ltd</td><td>昆虫饲养设备；饲喂单元</td></tr><tr><td>Gibco 含钙镁离子的 DPBS，10 × 500 mL 瓶装</td><td>140-040-182</td><td>FisherScientific</td><td>细胞培养试剂</td></tr><tr><td>Gibco Fungizone（两性霉素 B），250&amp;mu;g/mL，50 mL/瓶</td><td>15-290-026</td><td>Fisher Scientific</td><td>细胞培养试剂</td></tr><tr><td>Gibco 青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL），100 mL/瓶，每箱 20 瓶</td><td>15-140-163</td><td>FisherScientific</td><td>细胞培养试剂</td></tr><tr><td>Gibco 胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.25%），含酚红，20 × 100 mL 瓶装</td><td>25-200-114</td><td>FisherScientific</td><td>细胞培养试剂</td></tr><tr><td>Gibco DMEM 培养基，高糖型，10 × 500 mL 瓶装</td><td>11-965-118</td><td>FisherScientific</td><td>细胞培养试剂</td></tr><tr><td>人血，性别未指定，柠檬酸钠抗凝，1 单位</td><td>7203706</td><td>Lampire</td><td>血液餐制备</td></tr><tr><td>InsectaVac 吸虫器</td><td>2809B</td><td>Bioquip</td><td>昆虫饲养设备</td></tr><tr><td>甲醇，ACS 认证级，Fisher Chemicals，琥珀色玻璃瓶装，4 L，每箱 4 瓶</td><td>A412-4</td><td>FisherScientific</td><td>固定剂</td></tr><tr><td>甲基纤维素，黏度：3,500–5,600 cP，2% 水溶液（20 &amp;deg;C），250 g/瓶</td><td>M0512-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>细胞培养试剂</td></tr><tr><td>Micro-chem Plus 消毒清洁剂</td><td>C849T34</td><td>Thomas Scientific</td><td>去污消毒；双季铵盐类工作稀释液</td></tr><tr><td>矿物油，BioReagent，适用于分子生物学</td><td>M5904-5X5ML</td><td>MilliporeSigma</td><td>蚊虫固定</td></tr><tr><td>O 型密封圈</td><td>OR37-25</td><td>Hemotek Ltd</td><td>昆虫饲养设备</td></tr><tr><td>塑料塞</td><td>PP5-250</td><td>Hemotek Ltd</td><td>昆虫饲养设备</td></tr><tr><td>PS6 电源装置（110–120 V）</td><td>PS6120</td><td>Hemotek Ltd</td><td>昆虫饲养设备；电源</td></tr><tr><td>Rubis 镊子，偏移式刀片，超细尖端</td><td>4525</td><td>Bioquip</td><td>昆虫饲养设备</td></tr><tr><td>Sarstedt 公司，2 mL 螺口微量离心管，锥底，带 O 型圈盖，无菌，每箱 1000 支</td><td>50-809-242</td><td>FisherScientific</td><td>塑料耗材</td></tr><tr><td>蔗糖，BioUltra 级，适用于分子生物学</td><td>84097-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>试剂</td></tr><tr><td>ThermoScientific ART 防污染低吸附移液枪头，1000&amp;mu;L，每架 100 个，每包 8 架，每箱 4 包</td><td>21-402-487</td><td>FisherScientific</td><td>塑料耗材</td></tr><tr><td>ThermoScientific ART 防污染低吸附移液枪头，200&amp;mu;L，每架 96 个，每包 10 架，每箱 5 包</td><td>21-402-486</td><td>FisherScientific</td><td>塑料耗材</td></tr><tr><td>ThermoScientific ART 防污染低吸附移液枪头，20&amp;mu;L，每架 96 个，每包 10 架，每箱 5 包</td><td>21-402-484</td><td>FisherScientific</td><td>塑料耗材</td></tr><tr><td>ThermoScientific ART 防污染低吸附延长型移液枪头，10&amp;mu;L，每架 96 个，每包 10 架，每箱 5 包</td><td>21-402-482</td><td>FisherScientific</td><td>塑料耗材</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>85300</td><td>QIAGEN</td><td>匀浆处理</td></tr><tr><td>TrueBlue 过氧化物酶底物试剂盒，200 mL</td><td>5510-0030</td><td>Seracare</td><td>蚀斑形成实验显色液</td></tr><tr><td>Vero</td><td>CCL-81</td><td>American Type Culture Collection</td><td>用于病毒扩增和感染性实验的哺乳动物细胞系</td></tr><tr><td>Vero C1008 [Vero 76, 克隆 E6, Vero E6]</td><td>CRL-1586</td><td>American Type Culture Collection</td><td>用于病毒扩增和感染性实验的哺乳动物细胞系</td></tr></tbody></table>

媒介能力分析 埃及伊蚊 蚊子传播寨卡病毒

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

本文所述方法介绍了一种在实验室条件下使埃及伊蚊（Aedes aegypti）感染寨卡病毒的通用实验流程，用于测定该蚊虫种群的感染率、播散性感染率以及病毒的潜在传播能力。这些方法在全球范围内的媒介传播能力评估中被广泛应用，并根据具体研究需求进行了多种改进。该方法对于确定特定蚊虫（即物种、种群或个体）在特定病原体传播过程中可能发挥的作用具有重要意义。

来自美洲的三个埃及伊蚊（Ae. aegypti）种群（巴西萨尔瓦多、多米尼加共和国以及美国德克萨斯州里奥格兰德河谷）被暴露于源自美洲的一株寨卡病毒（ZIKV Mex 1-7，墨西哥恰帕斯州，2015年）中，病毒通过以洗涤的人类红细胞为基础的人工血餐提供，血餐中的病毒滴度范围为4、5和6 log10 FFU/mL。在感染后的第2、4、7、10和14天，分别处理部分蚊虫样本，以测定感染率、扩散率以及潜在传播率。
当ZIKV Mex 1−7的血餐滴度为4 log10 FFU/mL时，来自巴西萨尔瓦多的埃及伊蚊（Ae. aegypti）在体外孵育4天和14天后的感染率分别为12.5%和11.1%，在检测的腿部样本中未发现扩散性感染的证据，唾液中也未检测到病毒（图1a）。将滴度提高至5 log10 FFU/mL后，感染率在感染后第4、10和14天分别为22.2%、33.3%和22.2%，感染性略有上升。与暴露于4 log1...

本方案可在封闭环境中测定埃及伊蚊（Aedes aegypti）种群对特定病毒（如寨卡病毒）的传播能力。

文中所述步骤介绍了一种在实验室条件下感染埃及伊蚊（Aedes aegypti）以确定寨卡病毒（Zika virus）感染情况的通用方法

在由节肢动物传播病毒（arbovirus）引发的疫情中，防控措施主要局限于蚊虫的消杀。因此，媒介能力分析是关键的预防策略，因为这些分析能够确定哪些蚊虫种群或物种可作为特定节肢动物传播病毒的传播媒介，从而明确应针对的目标。因此，在评估蚊虫及其他媒介在传染病传播中作用的工具箱中，最重要的组成部分之一便是媒介能力研究。这类实验能够高度精确地控制多种因素，不仅包括蚊子或蜱等媒介的物种，还包括其地理种系，以及不同病毒或其他病原体的特定毒株，从而获得关于不同物种在世界特定地区传播不同病原体风险的精确且受控的数据。操作感染性蚊虫需要专用设施、专业培训、实践经验以及周密的规划，以最大限度降低实验人员暴露风险以及感染蚊虫逃逸的风险。因此，对于进入此类设施的新进人员而言，花时间使用未感染的蚊虫进行练习，熟悉相关技术与操作流程，显得尤为重要。在暴露当天，于节肢动物 containment 设施中打开电源，以预热饲喂装置。将新鲜采集的枸橼酸盐或肝素抗凝人血与病毒原液按体积比1:1混合，并在标准的3毫升储液单元上覆盖一只未感染的健康小鼠的皮肤。将覆盖好的储液器置于白色纸巾上，分次加入约2毫升感染性血液，每次加入1毫升。然后用纸巾检查，确认无泄漏。在进行感染性实验前24小时，准备含有Vero细胞的24孔细胞培养板，并用蚊虫编号和样品信息标记每个孔。在蚊虫将暴露于感染性血液餐的当天早晨，移除吸满水的棉球，并使用透明塑料密闭手套箱将含人工血液餐的储液器连接至饲喂装置的导联上。将装有饥饿蚊虫的纸板箱放入喂养装置下方的手套箱中。喂养结束后，取下储液器并将其浸入新配制的10%次氯酸钠溶液中。在手套箱内，将经低温麻醉的蚊虫倒入置于冰上的培养皿中，并将吸血饱满的蚊虫与未吸血的蚊虫分离开。将吸饱血的蚊子倒回纸板箱中，迅速用筛网和盖子盖好。剪去纸箱上多余的筛网，用胶带固定盖子。在筛网上放置一个浸透无菌过滤的10%蔗糖溶液的棉球，并将纸箱放入一个装有湿润海绵的大塑料次级容器中，以维持湿度。将次级容器置于27摄氏度下孵育，使蚊虫可随意取食蔗糖，直至实验结束。使用机械吸虫器从纸箱中收集预定数量的孵育蚊虫，收集完毕后用棉塞封住收集管。在手套箱内操作，将经低温麻醉的蚊虫倒入置于冰上的培养皿中。取下每只蚊子的全部六条腿，放入已预先标记的2毫升微量离心管中，管内加入一个灭菌的不锈钢研磨珠和500微升蚊子采集介质（MCM）。将蚊子轻轻放置在一滴矿物油上，注意避免油接触蚊子的头部或喙。将微移液器吸头（内含10微升热灭活胎牛血清）插入蚊子的喙中，让蚊子唾液分泌30分钟。将含有唾液的移液枪头弹入一个含有100 µL MCM的微量离心管中，并将尸体放入另一个含有灭菌钢珠和500 µL MCM的2 mm离心管中。在生物安全柜内将这些离心管转移至珠磨组织匀浆仪中，以26赫兹对所有躯体和腿部样本进行5分钟的研磨，以释放病毒颗粒至悬浮液中。通过以200 ×g离心5分钟，使所有样本澄清，以沉淀细胞碎片。在接种样品前立即从预先准备的Vero细胞中移除培养基。小心地将来自虫体或虫腿的澄清上清液各100微升分装至每个孔中，注意不要扰动沉淀中的蚊细胞碎片。随后，将培养板孵育1小时。孵育结束后，向每个孔中加入一毫升甲基纤维素覆盖液，然后将培养板放回培养箱中继续孵育三至七天。从培养箱中取出覆盖板，移至生物安全柜中。将甲基纤维素覆盖液弃入含有10%次氯酸钠的托盘中，并用PBS洗涤每个孔两次，每次洗涤液均弃入该托盘中。吸去 PBS，每孔加入 1 毫升甲醇-丙酮，使细胞在培养板上固定 30 分钟。随后弃去固定液，将培养板静置晾干。用非无菌 PBS 在轨道摇床上洗涤每孔 3 次，每次洗涤 15 分钟。然后每孔加入 1 毫升封闭液，在摇床上继续孵育 15 分钟。向每个孔中加入 100 微升抗寨卡病毒或抗黄病毒属的一抗，将酶标板置于摇床上孵育过夜。次日，移除一抗，并用 PBS 重复洗涤。最后一次洗涤后，向每孔加入 100 微升二抗，在摇床上孵育一小时。用 PBS 重复洗涤，然后每孔加入 100 微升底物显色试剂，将培养板轻轻摇动 15 分钟。当病灶或空斑形成后，用自来水冲洗培养板以终止反应。倒掉自来水，让培养板自然风干，随后对病毒病灶进行定量，以确定给定样本中焦点形成单位的数量。三个蚊子种群被暴露于不同血餐滴度的寨卡病毒暴发株。在接下来的两周内，对部分蚊子进行处理，以确定感染率、扩散率以及潜在传播率。在较低的血餐滴度下，来自巴西萨尔瓦多的蚊子在4天、10天和14天的外潜伏期后均出现感染，但在检测的腿部样本中未观察到扩散性感染的证据。在最高滴度下，可在蚊虫腿部检测到病毒，但在唾液中未检测到。来自多米尼加共和国的蚊虫对感染最为易感，并且在所有测试的血餐滴度下均表现出最强的传播能力。喂食三种剂量的蚊虫均在感染后7天内表现出病毒扩散，并在感染后14天具备传播能力。在德克萨斯州里奥格兰德河谷地区，暴露于较低病毒血餐滴度的蚊子在感染后第4天即出现感染，而播散性感染则在感染后14天被发现。在暴露于最高滴度的蚊子群体中，从感染后第2天开始观察到感染，并在第4、10和14天达到高峰。播散性感染在第7天被观察到，且仅有一只蚊子在感染后第10天具备传播能力。在进行本方案时，重要的是要以安全为首要考虑，而非追求速度。因此，在去除蚊虫腿部或翅膀之前，始终应在手套箱或生物安全柜内操作感染或可能感染的蚊虫。基本的媒介传播能力工作流程可进行调整，以制备用于后续分析的感染蚊虫，例如传播研究，以及用于研究蚊虫、病毒与微生物组之间的相互作用。媒介能力一直是理解蚊子在病毒性疾病暴发期间传播病毒作用的重要工具，这一情况已持续数十年。但这一方法也随着我们对病毒与蚊媒之间相互作用认识的不断深入而逐年发展。仅举两例而言，病毒的遗传种群特征以及在蚊体内的种群复杂性，被发现对其传播能力具有重要意义；如今，我们已可通过新的病毒种群测序方法，将这些因素纳入媒介能力研究之中。我们现在还了解到，生活在蚊子胃肠道中的细菌及其他生物群落也会显著影响其传播病原体的能力，而借助新的测序方法，我们如今能够评估这些生物群落。因此，媒介效能的研究方法随着对这些复杂相互作用的深入理解而不断发展，并将持续演进。

vector-competence-analyses-on-aedes-aegypti-mosquitoes-using-zika

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用寨卡病毒对 埃及伊 蚊的载体能力分析

本方案描述了从双质粒感染性cDNA克隆中回收具有感染性的寨卡病毒的方法。...

从一种新型寨卡病毒感染性克隆中拯救与鉴定重组病毒

Aedes aegypti 蚊子感染 Wolbachia 后被释放到自然种群中，以抑制节肢动物传播病毒的传播。本文描述了在实验室中培育携带 Wolbachia 感染的 Ae. aegypti...

维持感染 Wolbachia 的 Aedes aegypti 蚊子

目前用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒的多重诊断方法需要复杂的样品制备过程和昂贵的仪器设备，难以在资源有限的环境中应用。我们展示了一种基于等温扩增技术并结合靶标特异性链置换探针的诊断方法，可高灵敏度、高特异性地检测并区分这些病毒。...

基于多重等温扩增的诊断平台用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒1型

为了有效控制蚊媒病毒的传播，了解相应蚊虫的媒介潜能尤为重要。本文将强制唾液分泌法描述为一种用于分析蚊虫媒介能力的方法。 白纹伊蚊 以及三种不同的 库蚊...

强迫唾液分泌作为分析蚊虫传播能力的方法

我们描述了一种利用人血清、原代人细胞以及实时定量聚合酶链式反应进行感染定量的方法，用于评估针对登革病毒的预存免疫对寨卡病毒感染的影响。...

寨卡病毒在原代人细胞中抗体依赖性增强作用的定量分析

高效位点特异性突变的胚胎显微注射技术 致倦库蚊

一种培养微孢子虫寄生虫Edhazardia aedis的实验方案。该寄生虫通过幼虫阶段的水平传播和成虫阶段的垂直传播，从一代埃及伊蚊（Aedes...

Edhazardia aedis 微孢子虫寄生虫在中国台湾伊蚊（Aedes aegypti）中的传播

该方法包括口服喂养和胸腔内注射感染，可有效评估中肠和/或唾液腺屏障对节肢动物传播病毒感染的影响。...

成年蚊虫通过口服饲喂和微量注射进行病毒实验感染

描述了研究刺探和摄食行为的步骤 Culex...

交流-直流电穿透图技术用于研究刺探与取食行为 Culex tarsalis 人手上的蚊子

本实验方案提供了克隆细胞系筛选及钙依赖性生物发光检测的方法，用于分析合成节肢动物神经肽与其同源G蛋白偶联受体之间的构效关系。该检测方法可用于受体去孤儿化研究，以及合成类似物设计和肽类/药物先导物发现中的构效关系研究。...

一种用于蚊子（Aedes aegypti）和蜱虫（Rhipicephalus microplus）G蛋白偶联受体功能分析的钙离子生物发光检测法

了解寨卡病毒载体能力分析方法，使用埃及伊蚊评估不同地理种群传播风险。该实验技术帮助研究人员精准控制病毒株与蚊种，为公共卫生防控策略提供关键数据支持。

媒介能力分析埃及伊蚊蚊子传播寨卡病毒

探索更多视频

媒介能力分析 埃及伊蚊 蚊子传播寨卡病毒

探索更多视频

媒介能力分析埃及伊蚊蚊子传播寨卡病毒