媒介能力分析 埃及伊蚊 蚊子传播寨卡病毒

在由节肢动物传播病毒（arbovirus）引发的疫情中，防控措施主要局限于蚊虫的消杀。因此，媒介能力分析是关键的预防策略，因为这些分析能够确定哪些蚊虫种群或物种可作为特定节肢动物传播病毒的传播媒介，从而明确应针对的目标。因此，在评估蚊虫及其他媒介在传染病传播中作用的工具箱中，最重要的组成部分之一便是媒介能力研究。这类实验能够高度精确地控制多种因素，不仅包括蚊子或蜱等媒介的物种，还包括其地理种系，以及不同病毒或其他病原体的特定毒株，从而获得关于不同物种在世界特定地区传播不同病原体风险的精确且受控的数据。操作感染性蚊虫需要专用设施、专业培训、实践经验以及周密的规划，以最大限度降低实验人员暴露风险以及感染蚊虫逃逸的风险。因此，对于进入此类设施的新进人员而言，花时间使用未感染的蚊虫进行练习，熟悉相关技术与操作流程，显得尤为重要。

在暴露当天，于节肢动物 containment 设施中打开电源，以预热饲喂装置。将新鲜采集的枸橼酸盐或肝素抗凝人血与病毒原液按体积比1:1混合，并在标准的3毫升储液单元上覆盖一只未感染的健康小鼠的皮肤。将覆盖好的储液器置于白色纸巾上，分次加入约2毫升感染性血液，每次加入1毫升。

然后用纸巾检查，确认无泄漏。在进行感染性实验前24小时，准备含有Vero细胞的24孔细胞培养板，并用蚊虫编号和样品信息标记每个孔。在蚊虫将暴露于感染性血液餐的当天早晨，移除吸满水的棉球，并使用透明塑料密闭手套箱将含人工血液餐的储液器连接至饲喂装置的导联上。

将装有饥饿蚊虫的纸板箱放入喂养装置下方的手套箱中。喂养结束后，取下储液器并将其浸入新配制的10%次氯酸钠溶液中。在手套箱内，将经低温麻醉的蚊虫倒入置于冰上的培养皿中，并将吸血饱满的蚊虫与未吸血的蚊虫分离开。

将吸饱血的蚊子倒回纸板箱中，迅速用筛网和盖子盖好。剪去纸箱上多余的筛网，用胶带固定盖子。在筛网上放置一个浸透无菌过滤的10%蔗糖溶液的棉球，并将纸箱放入一个装有湿润海绵的大塑料次级容器中，以维持湿度。

将次级容器置于27摄氏度下孵育，使蚊虫可随意取食蔗糖，直至实验结束。使用机械吸虫器从纸箱中收集预定数量的孵育蚊虫，收集完毕后用棉塞封住收集管。在手套箱内操作，将经低温麻醉的蚊虫倒入置于冰上的培养皿中。

取下每只蚊子的全部六条腿，放入已预先标记的2毫升微量离心管中，管内加入一个灭菌的不锈钢研磨珠和500微升蚊子采集介质（MCM）。将蚊子轻轻放置在一滴矿物油上，注意避免油接触蚊子的头部或喙。将微移液器吸头（内含10微升热灭活胎牛血清）插入蚊子的喙中，让蚊子唾液分泌30分钟。

将含有唾液的移液枪头弹入一个含有100 µL MCM的微量离心管中，并将尸体放入另一个含有灭菌钢珠和500 µL MCM的2 mm离心管中。在生物安全柜内将这些离心管转移至珠磨组织匀浆仪中，以26赫兹对所有躯体和腿部样本进行5分钟的研磨，以释放病毒颗粒至悬浮液中。通过以200 ×g离心5分钟，使所有样本澄清，以沉淀细胞碎片。

在接种样品前立即从预先准备的Vero细胞中移除培养基。小心地将来自虫体或虫腿的澄清上清液各100微升分装至每个孔中，注意不要扰动沉淀中的蚊细胞碎片。随后，将培养板孵育1小时。

孵育结束后，向每个孔中加入一毫升甲基纤维素覆盖液，然后将培养板放回培养箱中继续孵育三至七天。从培养箱中取出覆盖板，移至生物安全柜中。将甲基纤维素覆盖液弃入含有10%次氯酸钠的托盘中，并用PBS洗涤每个孔两次，每次洗涤液均弃入该托盘中。

吸去 PBS，每孔加入 1 毫升甲醇-丙酮，使细胞在培养板上固定 30 分钟。随后弃去固定液，将培养板静置晾干。用非无菌 PBS 在轨道摇床上洗涤每孔 3 次，每次洗涤 15 分钟。然后每孔加入 1 毫升封闭液，在摇床上继续孵育 15 分钟。

向每个孔中加入 100 微升抗寨卡病毒或抗黄病毒属的一抗，将酶标板置于摇床上孵育过夜。次日，移除一抗，并用 PBS 重复洗涤。最后一次洗涤后，向每孔加入 100 微升二抗，在摇床上孵育一小时。

用 PBS 重复洗涤，然后每孔加入 100 微升底物显色试剂，将培养板轻轻摇动 15 分钟。当病灶或空斑形成后，用自来水冲洗培养板以终止反应。倒掉自来水，让培养板自然风干，随后对病毒病灶进行定量，以确定给定样本中焦点形成单位的数量。

三个蚊子种群被暴露于不同血餐滴度的寨卡病毒暴发株。在接下来的两周内，对部分蚊子进行处理，以确定感染率、扩散率以及潜在传播率。在较低的血餐滴度下，来自巴西萨尔瓦多的蚊子在4天、10天和14天的外潜伏期后均出现感染，但在检测的腿部样本中未观察到扩散性感染的证据。

在最高滴度下，可在蚊虫腿部检测到病毒，但在唾液中未检测到。来自多米尼加共和国的蚊虫对感染最为易感，并且在所有测试的血餐滴度下均表现出最强的传播能力。喂食三种剂量的蚊虫均在感染后7天内表现出病毒扩散，并在感染后14天具备传播能力。

在德克萨斯州里奥格兰德河谷地区，暴露于较低病毒血餐滴度的蚊子在感染后第4天即出现感染，而播散性感染则在感染后14天被发现。在暴露于最高滴度的蚊子群体中，从感染后第2天开始观察到感染，并在第4、10和14天达到高峰。播散性感染在第7天被观察到，且仅有一只蚊子在感染后第10天具备传播能力。

在进行本方案时，重要的是要以安全为首要考虑，而非追求速度。因此，在去除蚊虫腿部或翅膀之前，始终应在手套箱或生物安全柜内操作感染或可能感染的蚊虫。基本的媒介传播能力工作流程可进行调整，以制备用于后续分析的感染蚊虫，例如传播研究，以及用于研究蚊虫、病毒与微生物组之间的相互作用。

媒介能力一直是理解蚊子在病毒性疾病暴发期间传播病毒作用的重要工具，这一情况已持续数十年。但这一方法也随着我们对病毒与蚊媒之间相互作用认识的不断深入而逐年发展。仅举两例而言，病毒的遗传种群特征以及在蚊体内的种群复杂性，被发现对其传播能力具有重要意义；如今，我们已可通过新的病毒种群测序方法，将这些因素纳入媒介能力研究之中。

我们现在还了解到，生活在蚊子胃肠道中的细菌及其他生物群落也会显著影响其传播病原体的能力，而借助新的测序方法，我们如今能够评估这些生物群落。因此，媒介效能的研究方法随着对这些复杂相互作用的深入理解而不断发展，并将持续演进。