在鼠模型中使用聚焦超声波打开位置特定血脑屏障开口的台面方法

用微泡剂聚焦超声波可以聚焦和瞬时打开血脑屏障。这项技术已被用于通过血脑屏障提供广泛的制剂。本文提供了一个详细的协议，本地化交付给啮齿动物的大脑有或没有MRI指导。

聚焦超声与循环微泡相结合，可用于在血脑屏障中提供临时毫米大小的开口。这使得全身循环药物能够无创地输送到目标大脑区域。首先，用盐水填充导管塞，然后用灯加热老鼠的尾巴，注意不要让动物过热。

插入一根 24 号尾静脉导管，该导管将用于输送微气泡、埃文斯蓝染料、钆布特醇 MRI 造影剂（如果使用 MRI）和感兴趣的实验剂。当静脉受到撞击时，血液会充满鞘。慢慢地，取出内针，同时将鞘进一步推入静脉。

输液港充满血液，就将导管塞拧入导管输液港的末端。小心地将实验室胶带缠绕在导管和尾部以将其固定到位，从顶部的一小块开始，沿尾部方向工作。让导管塞的最末端暴露在外。

将麻醉管插入立体定向框架上的麻醉连接器。然后将动物的头部固定在框架中，方法是将嘴放在咬杆上，将耳杆引导到两个耳道中并拧紧固定螺钉。将动物移至 MRI 床。

使用文本手稿中描述的参数，收集捕获整个大脑的冠状位和轴向 T2 加权图像以及用于坐标测量的 MRI 基准。在冠状面图像上，找到基准面最大的图像，指示基准面的中心。记录从基准顶部到感兴趣大脑区域的距离（以毫米为单位），包括内侧-外侧方向和背侧-腹侧方向。

在轴向图像上，找到显示基准最顶部的图像，并记录基准中心的 X 和 Y 坐标以及感兴趣大脑区域的 X 和 Y 坐标。计算从基准中心到目标大脑区域在喙尾和内侧外侧方向的距离。收集坐标后，收集扫描前图像。

将动物保持在这个立体定位框架中，将其从 MRI 床快速运送到台式 FUS 设置。确保动物在麻醉作用下保持睡眠状态。将镜框滑入镜架支架，并将其牢牢卡入到位。

用剪刀剃掉动物的头部，然后刷掉多余的毛发并在头皮上涂抹脱毛霜。静置 3 分钟，然后用水和纱布擦去。如果使用 MRI 引导，请连接指针并将指针移动到 MRI 基准点的位置。

然后将指针放在 MRI 基准点的最顶部和中心，这是计算 MRI 图像中所有距离的起点。移除指针并将定位器移动到内侧-外侧坐标和喙-尾坐标。轻触 null 位置按钮，然后按 up 50 按钮将定位器向上升高，以放置水浴和超声凝胶。

将超声凝胶涂抹在动物的头皮上，将水浴放在动物身上，将聚酰亚胺胶带窗口压在凝胶上，确保凝胶中没有气泡。用脱气水填充水浴。如果使用高功率传感器，请降低定位器，使磁体刚好高于水面。

小心地将传感器以一定角度放入水中并连接磁铁，将传感器连接到定位器上。将定位器降低到背腹坐标并打开 RF 功率放大器。通过将针尖插入导管塞并注射，每公斤 3% 伊文思蓝染料注射 1 毫升。

整只动物应该在几秒钟内变成蓝色，表明导管正确定位在尾静脉中。让染料循环 5 分钟，然后用气泡摇床猛烈摇晃微气泡，以激活微气泡。将此注射器倒置数次以获得均匀分布的微气泡，然后连接并填充带翼的输液器。

将注射器放在输液泵上，并将输液泵设置为以每小时 6 毫升的速度输送 0.2 毫升，在两分钟的 FUS 暴露中缓慢输注微气泡。将带翼的针头插入导管塞中。首先运行输液泵，等待 3 秒钟，然后按下开启按钮和函数发生器开始 FUS 治疗。

每个区域重复两次，中间间隔 5 分钟，让微气泡清除。当输液泵停止两分钟时，再次按下函数发生器上的开启按钮以停止 FUS 治疗。等待 5 分钟让微气泡清除，然后开始输液和第二次 FUS 治疗。

第二次 FUS 治疗后，立即注射钆布特醇造影剂和感兴趣的药物。所有药物的总输送量不应超过每公斤 5 毫升。要确认 BBB 打开，请将动物放回完全相同位置的 MRI 床上，并插入麻醉线。

使用与扫描前图像相同的成像参数收集扫描后 MRI，以确认 BBB 开口区域的钆布特醇 MRI 增强。该方案用于使用低功率浸入式换能器和高功率聚焦超声换能器诱导局部血脑屏障开放。首先，低功率浸入换能器针对大脑前半球或内侧半球。

在有或没有灌注的情况下处死动物，并通过 Evans 蓝染料自发荧光观察 BBB 开口。在后来的实验中，FUS 换能器针对海马体或前扣带回皮层。除伊文思蓝染料外，MRI 造影剂钆布特醇还用于验证 VIVO 中 BBB 的靶向开放。

处死动物后，埃文思蓝染料自发荧光确认了打开位置。为了评估该技术是否可用于靶向基因递送，在海马体血脑屏障打开后立即注射表达绿色荧光蛋白和钆布特醇造影剂的 AAV 9。对动物进行成像，以用钆布特醇造影剂验证开口。

然后，通过 GFP 表达确认基因递送。该方案为 MRI 引导聚焦超声介导的血脑屏障开放提供了一种台式方法，其他实验室可以很容易地对其进行调整，以提供立体定向手术的无创转化替代方案。