小鼠足垫接种模型用于研究病毒诱导的神经炎症反应

本方案可用于研究小鼠外周神经系统在病毒感染过程中神经炎症反应的启动与发展。利用该模型，感染从外周向周围神经系统及中枢神经系统传播的距离更长，从而能够最大程度地评估神经炎症反应的动力学特征。将5至7周龄的C57BL/6小鼠麻醉后置于手术垫上，仰卧位固定，确认其对足底反射无反应。

使用100至180目的砂板，在一只后足底面的足跟与承重垫之间的无毛皮肤区域轻轻摩擦约20次，以进行表皮磨损。然后用精细镊子缓慢剥离因摩擦而松脱的角质层，以暴露基底层。轻柔混合后，将20 µL适当滴度的病毒接种物局部涂抹于磨损的足垫处。

同时，在对照组动物的擦伤足垫中仅使用培养基进行模拟接种。每次接种后，每隔10分钟用针头针柄轻轻揉搓足垫10次，持续30分钟，以促进病毒吸附。当擦伤的足垫干燥后，观察小鼠直至其恢复胸卧位，然后将其放入单独的笼子中进行临床随访和取样。

在适当的实验时间点，采集暴露于病毒的器官，包括心脏、肺、脾、胰腺、肝脏、肾脏和膀胱，分别置于预冷的1.5毫升离心管中，并置于冰上。随后，采集足跟与行走垫之间的磨损足垫组织，将样品分别放入预冷的1.5毫升离心管中并置于冰上。接着，将小鼠置于俯卧位，并用70%乙醇润湿其毛发。

为了暴露脊柱，需在骨盆区域做一小切口，并将后肢的皮肤向头部方向剥离。使用剪刀沿脊柱两侧平行且紧贴脊柱剪切，以去除前肢和后肢。在颅底处切断并移除头部。

使用剪刀从枕骨大孔向额骨方向剪开颅骨。然后用镊子向两侧轻轻撑开颅骨。接着用镊子小心地取出脑组织，并将脑组织放入预冷的1.5毫升离心管中，置于冰上。

使用弯头剪刀清除脊柱上的肌肉、脂肪和软组织，并切除尾部。然后将完整的脊柱放入含有无菌冰冻 PBS 的 15 毫升离心管中，置于冰上保存，时间不超过三小时。解剖完成后，将脊髓转移至组织培养皿中，以便去除任何残留的软组织。

使用剃刀刀片在 S2、L1 和 T1 椎骨处对脊柱进行三处横向切割。将组织片段转移至分别盛有无菌冰冻 PBS 的 15 毫米培养皿中。注意记录并标记各节段的来源，以供后续分析。

接下来，用镊子固定一段组织，背侧朝上，使用刀片沿中线做一次纵向切割，将脊柱均分为两半。将两半组织放入一个新的培养皿中，培养皿内含有新鲜、无菌的冰浴 PBS，并保持原始方向，以便区分脊柱的左侧和右侧。在解剖显微镜下，用精细镊子从椎体的每一半中由头端向尾端方向轻轻剥离出脊髓组织。

然后将两条脊髓半侧分别放入含有500微升无菌冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）的1.5毫升微量离心管中，置于冰上。为暴露背根神经节，轻轻从脊柱一侧向另一侧去除脑脊膜。并将暴露出的白色脊神经从脊柱中拉出。

将圆形、透明的背根神经节从脊柱节段分离，并收集至含有冰冷 PBS 的 15 毫米培养皿中。按照上述方法，分别采集同侧和对侧的背根神经节。按照上述方法，从另外两个脊柱节段获取脊神经和背根神经节后，将所有装有组织的离心管进行高速离心。

然后吸除上清液，并将样品在液氮中速冻，于-80°C保存直至进行匀浆。组织匀浆时，先将冷冻组织管置于冰上解冻，称取每份样品100毫克，转移至含有无菌珠子和500 µL放射免疫沉淀分析缓冲液的2 mL微量离心管中。

接下来，在室温下使用匀浆器以每秒20个循环的速度匀浆组织2分钟，随后静置1分钟，再以每秒20个循环的速度继续匀浆2分钟。第二次匀浆完成后，高速离心组织样品，然后将每份上清液500 µL转移至新标记的合适试管中。于-20 °C保存，直至进行后续分析。

在对照组足垫中可见擦伤部位。在愈合过程中，擦伤部位形成结痂是典型现象。相比之下，在人道终点时，接种伪狂犬病病毒的小鼠足垫表现出严重炎症，其特征为肿胀和发红。

对接种部位的足垫和背根神经节进行组织病理学检查，发现伪狂犬病病毒感染小鼠足垫组织中存在表皮坏死及严重的真皮层炎症。在伪狂犬病病毒感染的背根神经节组织切片中也观察到中性粒细胞浸润。与对照组相比，在感染后7小时和82小时，伪狂犬病病毒感染小鼠的足垫和背根神经节中G-CSF蛋白表达水平均显著升高。

与对照组相比，在伪狂犬病毒感染小鼠的脊髓、脑、心脏和肝脏组织中，感染后82小时也观察到显著水平的G-CSF。此外，在感染后24小时起，可在伪狂犬病毒感染小鼠所有被检测组织中检测到显著水平的IL-6。在濒死状态下，可在足垫、背根神经节、脊髓和脑组织中检测到伪狂犬病毒。

在伪狂犬病毒感染小鼠的背根神经节神经元中，伪狂犬病毒糖蛋白gB在细胞质中高表达。为确保感染成功，柱状液滴中的病毒颗粒必须不从擦伤的足垫处脱落。该动物模型可作为评估抗炎和抗病毒药物疗效的平台，以预防病毒诱导的周围神经病变。