Name: 小鼠脚垫接种模型，研究病毒引起的神经炎反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 了解小鼠脚垫接种模型，用于研究病毒诱导的神经炎症反应动力学。该方法通过C57BL/6小鼠评估外周神经系统中的病毒动力学和免疫病理过程，为开发神经炎症疾病治疗策略提供重要依据。

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作者感谢 Charles River 实验室在开展组织病理学分析过程中提供的出色技术支持。本研究由国家神经疾病和中风研究所（NINDS）（RO1 NS033506 和 RO1 NS060699）资助。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

所有动物实验均根据普林斯顿大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查并批准的方案（编号 2083-16 和 2083-19）进行。本工作严格遵循生物安全二级（BSL-2）要求，在普林斯顿大学生物安全委员会批准的配备齐全的实验室中开展。小鼠足垫擦伤、病毒接种、小鼠解剖及组织采集等操作均在普林斯顿大学生物防护动物设施房间的生物安全柜（BSC）内进行。操作人员穿戴一次性防护服、头套、护目用具、无菌手套、外科口罩和鞋套。
1. 小鼠足垫擦伤
<ol>
	<li>使用异氟烷气体麻醉剂，通过小型麻醉系统（麻醉舱）以3%的剂量对一只5–7周龄的C57BL/6小鼠进行麻醉。
	<ol>
		<li>在接种前，将小鼠仰卧置于手术麻醉平面。将带有隔膜（切口大小应足以容纳动物口鼻）的鼻罩连接至小鼠，并以1.5%–2.0%的恒定剂量输送异氟烷气体麻醉剂。</li>
		<li>使用镊子用力夹捏小鼠脚趾以产生疼痛刺激，密切监测小鼠是否出现反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用平头镊子轻轻夹住一只后足垫。
	<ol>
		<li>在足跟与行走垫之间，使用砂板（粒度100–180）轻轻摩擦后足垫无毛皮肤约20次。避免因摩擦过于频繁或压力过大而导致出血。</li>
		<li>使用精细镊子缓慢剥离因摩擦而松动的角质层，以暴露基底层。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 伪狂犬病毒足垫接种
<ol>
	<li>将病毒接种物用含有2%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基稀释至所需滴度（材料表）。
	<ol>
		<li>在PK15细胞上定量病毒储备液中的空斑形成单位（PFU）数量，以计算并标准化病毒剂量，并相应稀释病毒接种物。 
		注意：本研究使用强毒株伪狂犬病毒（PRV-Becker），剂量为8 × 106 PFU。该剂量已在先前的预实验中优化，以确保所有接种动物在接种后82小时（hpi）均出现临床症状。</li>
		<li>使用前将病毒接种物置于冰上，并轻轻混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将20 μL病毒接种物（8 × 106 PFU）滴加至划伤的足垫部位（局部给药）。同时平行进行模拟接种（仅使用培养基）。</li>
	<li>用针头杆部轻轻摩擦10次，以促进病毒吸附。避免使用针尖划伤。每10分钟重复此步骤一次。</li>
	<li>使小鼠保持麻醉状态30分钟，直至划伤的足垫干燥。</li>
	<li>停止麻醉后，持续监测小鼠直至其能够维持胸卧位，然后将其放入单独的笼子中进行临床观察和样本采集。</li>
</ol>
3. 小鼠解剖与组织采集
<ol>
	<li>感染后适当时间，采用窒息法（CO2）对小鼠实施安乐死。 
	注意：本研究中，PRV-Becker 感染小鼠的人道终点（动物开始出现濒死症状时）为感染后 82 小时。同时对对照组动物实施安乐死。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定于手术垫上，使用针或钉固定四肢。用 70% 乙醇润湿小鼠腹侧，以减少毛发污染。</li>
	<li>用镊子夹起外层毛皮和皮肤，使用精细剪刀在尿道口附近做一小切口。
	<ol>
		<li>从此切口开始，沿腹中线向上剪至下颌。</li>
		<li>分别向前后肢末端方向做两条侧向切口。</li>
		<li>将皮肤与下方肌肉层分离，并向两侧固定。</li>
		<li>打开腹腔，并向上剪至胸腔基底部。通过做两条横向切口完成腹腔的充分暴露。</li>
		<li>通过剪开两侧膈肌和肋骨打开胸腔。 
		注意：沿肋骨两侧剪开可避免损伤心脏。</li>
		<li>采集暴露的器官，包括心脏、肺、脾脏、胰腺、肝脏、肾脏和膀胱，分别置于 1.5 mL 微量离心管中。将管子置于冰上保存。</li>
		<li>剪取足垫磨损区域（足跟与行走垫之间）的组织，按步骤 3.3.6 所述方法将组织块放入管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠翻转为俯卧位，用 70% 乙醇润湿毛发。剪开皮肤层以暴露脊柱。
	<ol>
		<li>在骨盆区域做一小切口，将后肢皮肤向头部方向剥离。</li>
		<li>用剪刀沿脊柱两侧平行贴近脊柱剪除四肢。</li>
		<li>在颅底（C1–C2 水平）处剪下头部。</li>
		<li>用剪刀从枕骨大孔向额骨方向剪开颅骨。</li>
		<li>用镊子向两侧撑开颅骨。</li>
		<li>用镊子轻柔地取出脑组织，并按步骤 3.3.6 所述方法处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用弯头剪刀剪除肌肉、脂肪和软组织，清理脊柱。剪去尾部。将完整的脊柱放入含有无菌冰冻磷酸盐缓冲液（PBS）的 15 mL 管中。将管子置于冰上，待后续进行脊髓和背根神经节（DRG）的分离。</li>
</ol>
4. 脊髓和背根神经节提取
注意：在小鼠解剖后，直接从脊柱中提取脊髓和背根神经节（DRG）。脊髓和DRG提取方案改编自先前发表的研究7。
<ol>
	<li>从冰冻的 PBS 管中取出脊柱，并去除残留的软组织，冷藏后该步骤会更容易进行。</li>
	<li>使用剃刀片在脊柱上沿椎骨进行三个横向切割（分别位于 T1、L1 和 S2 水平），将三段组织放入含有无菌冰冻 PBS 的 15 mm 培养皿中。记录并标记各段来源，以便后续分析。</li>
	<li>取其中一段，用镊子夹住，背侧朝上。使用剃刀片沿中线做一次纵向切割，将脊柱均分为两半。</li>
	<li>将两半组织放入新的含有新鲜无菌冰冻 PBS 的培养皿中。确保组织段方向正确，以便区分左右两侧。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用精细镊子从每半段脊柱中由头端向尾端方向轻轻剥离出脊髓。</li>
	<li>将两段脊髓放入含有 500 μL 无菌冰冻 PBS 的 1.5 mL 微量离心管中。将离心管置于冰上保存。</li>
	<li>从脊柱一侧轻轻去除脑膜组织至另一侧，以暴露背根神经节（DRG）。</li>
	<li>抓住暴露的脊神经，逐个将每个 DRG 轻柔地拉出脊柱。将收集的 DRG 放入含有冰冻 PBS 的 15 mm 培养皿中。从脊柱段上分别采集所有同侧和对侧的 DRG，并按步骤 4.5 所述继续操作。 
	注意：DRG 沿白色脊神经呈圆形透明结构，肉眼可见。</li>
	<li>在 30–45 分钟内，对另外两个脊柱段重复步骤 4.3–4.7。</li>
	<li>将所有离心管在 4 °C 条件下以高速（17,900 x g）离心 3 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将离心管在液氮中快速冷冻。将样品储存在 -80 °C，用于后续组织匀浆处理。</li>
	<li>或者，在步骤 4.9 之后，可对清洁后的 DRG 及其他小鼠组织进行固定和切片，用于组织病理学分析和/或免疫荧光染色。</li>
</ol>
5. 组织匀浆
<ol>
	<li>将含有冷冻组织样本的管子置于冰上解冻。</li>
	<li>称取 100 mg 组织，放入含有无菌钢珠和 500 μL RIPA 裂解缓冲液的 2 mL 微量离心管中，RIPA 缓冲液包含 0.5 M EDTA（pH = 8.0）、1 M Tris-HCl（pH = 8.0）、5 M NaCl、10% SDS 以及蛋白酶抑制剂混合片剂。</li>
	<li>在室温（RT）下使用匀浆器以每秒 20 个循环的速度匀浆 2 分钟，随后静置 1 分钟，再以相同速度继续匀浆 2 分钟。</li>
	<li>在室温下以高速（17,900 x g）离心 10 分钟。</li>
	<li>收集上清液（500 μL）至新管中，并于 -20 °C 保存，用于后续 ELISA 和 qPCR 检测，分别用于定量炎症标志物和病毒载量。 
	注意：进行 qPCR 时，所有样本均需使用无 RNase 的耗材（如钢珠、离心管等），并使用含有 1% 巯基乙醇的 RNA 裂解缓冲液进行组织破碎（材料表）。</li>
</ol>
6. 冷冻背根神经节切片的制备与免疫荧光染色
<ol>
	<li>组织处理
	<ol>
		<li>将解剖并清洗干净的背根神经节（DRG）用1%多聚甲醛（PFA）在室温下固定2小时。</li>
		<li>将组织转移至含有PBS中10%蔗糖的15 mL离心管中，4 °C过夜孵育。</li>
		<li>将组织转移至含有PBS中20%蔗糖的15 mL离心管中，4 °C过夜孵育。</li>
		<li>将组织转移至含有PBS中30%蔗糖的15 mL离心管中，4 °C过夜孵育。</li>
		<li>使用冷冻模具将组织包埋于OCT包埋剂中，并将组织块置于干冰上进行快速冷冻。</li>
		<li>将样品储存于-80 °C，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冷冻切片制备
	<ol>
		<li>从-80 °C取出冷冻组织块，在冷冻切片机腔室内平衡30分钟。</li>
		<li>对背根神经节进行15 µm厚度的冷冻切片，并将切片贴附于载玻片上。</li>
		<li>使用疏水笔在载玻片上的组织周围画出疏水圈。</li>
		<li>将载玻片置于4 °C保存，直至染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光染色
	<ol>
		<li>在室温下用PBS洗涤背根神经节切片，每次10分钟，共洗涤3次。</li>
		<li>每张切片加入100 µL所需的一抗（例如：抗PRV糖蛋白B的小鼠抗体），在37 °C孵育1小时。将一抗用含10%正常山羊血清的PBS稀释。</li>
		<li>重复步骤6.3.1。</li>
		<li>每张切片加入100 µL所需的二抗（山羊抗小鼠Alexa Fluor 488），在37 °C孵育50分钟。二抗仅用PBS稀释。</li>
		<li>向切片上加入100 µL用PBS稀释的DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）染料，在37 °C继续孵育10分钟。</li>
		<li>重复步骤6.3.1。</li>
		<li>使用荧光封片剂将样品封固于玻璃载玻片上，并加盖盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 石蜡包埋组织切片的制备及苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色
<ol>
	<li>将组织在4 °C条件下用10%福尔马林固定24小时。</li>
	<li>对固定组织进行常规石蜡包埋和切片处理。将固定组织转移至70%乙醇，并按升级浓度的醇类梯度脱水，随后经二甲苯透明，最后浸入石蜡，步骤如前所述8。 
	注意：使用聚酯海绵将小块组织样本（如背根神经节）保留在包埋盒内。</li>
	<li>对组织切片进行常规脱蜡，随后进行苏木精-伊红（H&E）染色，步骤如前所述9。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的足垫接种模型可用于研究α疱疹病毒感染过程中神经炎症反应的启动与发展。此外，该体内模型还可用于建立α疱疹病毒从周围神经系统（PNS）向中枢神经系统（CNS）复制与扩散的动力学过程。该模型是其他接种模型的替代方法，例如依赖深部真皮划痕的侧腹皮肤接种模型13，或直接将病毒引入中枢神经系统的颅内接种途径14,15,16。因此，采用足垫模型可更详细地评估病毒复制与扩散的动力学特征，以及神经系统中相关的局部和远端免疫病理过程11,12。
在本实验方案中，足垫的摩擦损伤及随后的病毒接种是关键步骤。实际上，必须在充分摩擦后完全去除角质层，以暴露基底层并使其接触病毒接种物，从而实现成功感染。然而，摩擦操作必须轻柔，且不能引起出血，以避免病毒进...

本研究描述了一种足垫接种模型，用于研究病毒从周围神经系统（PNS）向中枢神经系统（CNS）的复制与扩散过程，以及相关的神经炎症反应。该足垫接种模型已被广泛用于研究甲型疱疹病毒感染神经元的过程1,2,3。此模型的主要目的是使嗜神经病毒在到达中枢神经系统之前，能够通过周围神经系统行进尽可能长的距离。本文中，该模型被用于深入探究伪狂犬病病毒（PRV）感染小鼠后特定神经病变（神经性瘙痒）的发展过程。
伪狂犬病毒（PRV）是一种α-疱疹病毒，与多种著名的病原体相关（例如单纯疱疹病毒1型和2型[HSV1和HSV2]以及水痘-带状疱疹病毒[VZV]），分别引起唇疱疹、生殖器病变和水痘4。这些病毒均具有泛嗜性，能够感染多种不同类型的细胞，而对特定组织类型无明显亲和性。然而，它们均表现出特征性的嗜神经性，可侵入宿主物种的周围神经系统（PNS），有时也会侵入中枢神经系统（CNS）。PRV的自然宿主是猪，但其可感染大多数哺乳动物。在非自然宿主中，PRV感染周围神经系统并引发一种严重的瘙痒症状，称为“狂痒症（mad itch）”，随后出现急性致死性病程5,6。目前，神经免疫反应在PRV感染的临床结局和致病机制中的作用仍知之甚少。
足垫接种模型可使伪狂犬病毒（PRV）在足垫表皮细胞中启动感染，随后感染扩散至支配表皮、汗腺和真皮的感觉神经纤维和交感神经纤维。病毒颗粒经坐骨神经在约60小时内传播至背根神经节（DRG）。随着感染沿脊髓上行，最终在动物濒死时到达后脑（感染后82小时）。在此时间窗口内，可采集、处理并分析组织样本，以检测病毒复制情况及免疫反应标志物。例如，可通过不同组织的组织学检查和病毒载量定量分析，建立临床表现、病毒学特征及神经炎症过程在PRV致病机制中起始与发展阶段的相关性。
利用足垫接种模型，可以研究PRV诱导的小鼠瘙痒的细胞和分子机制。此外，该模型可为疱疹病毒感染过程中病毒诱导的神经炎症的发生与发展提供新的见解。更深入地理解α疱疹病毒引起神经病变的潜在机制，可能有助于开发创新的治疗策略。例如，该模型可用于研究带状疱疹后遗症（如水痘-带状疱疹病毒引起的带状疱疹）患者神经性瘙痒的机制，并在小鼠中针对相应的人类疾病测试新的治疗靶点。

<table><tbody><tr><td>抗PRV gB抗体</td><td>Made by the lab</td><td></td><td>1/500 稀释</td></tr><tr><td>红色Aqua-hold2防溢笔</td><td>Fisher scientific</td><td>2886909</td><td></td></tr><tr><td>便携式指甲锉（24片装，100/180目）</td><td>Revlon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>完全型无EDTA蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6小鼠（5-7周龄）</td><td>The Jackson Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI溶液（1mg/ml）</td><td>Fisher scientific</td><td>62248</td><td>1/1000 稀释</td></tr><tr><td>一次性无菌聚苯乙烯培养皿（100 × 15 mm）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731500</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td><td>SH30022</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td><td>SH30028</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Hyclone, GE Healthcare life Sciences</td><td>SH30088</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢精细弯剪</td><td>FST</td><td>14095-11</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G封片介质</td><td>Fisher scientific</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林溶液（10%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（Isothesia Isoflurane）</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 微量离心管</td><td>Denville Scientific</td><td>1000945</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>SARSTEDT</td><td>72692005</td><td></td></tr><tr><td>阴性山羊血清</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>154022</td><td></td></tr><tr><td>Precision Glide 针头（18G）</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>带钢背的剃须刀片</td><td>Personna</td><td>9412071</td><td></td></tr><tr><td>RNA裂解缓冲液（RLT）</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢珠，5 mm</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost/plus显微载玻片</td><td>Fisher scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Tissue lyser LT组织研磨仪</td><td>Qiagen</td><td>69980</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT包埋剂</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>488标记山羊抗小鼠二抗</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>1/2000 稀释</td></tr></tbody></table>

小鼠足垫接种模型用于研究病毒诱导的神经炎症反应

Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses

本方案描述了一种用于研究甲型疱疹病毒（alphaherpesvirus）感染小鼠过程中神经炎症反应启动与发展机制的足垫接种模型。由于甲型疱疹病毒是外周神经系统（PNS）的主要侵袭性病原体，该模型适用于表征病毒复制的动力学特征、其从PNS向中枢神经系统（CNS）的传播过程以及相关的神经炎症反应。在足垫接种模型中，病毒颗粒从足垫表皮的初始感染部位扩散至支配表皮、汗腺和真皮的感觉神经与交感神经纤维。感染随后经坐骨神经传播至背根神经节（DRG），最终通过脊髓到达脑部。在此模型中，小鼠足垫接种伪狂犬病病毒（PRV），该病毒是一种与单纯疱疹病毒（HSV）和水痘-带状疱疹病毒（VZV）密切相关的甲型疱疹病毒。该模型显示，PRV感染可诱导严重的炎症反应，其特征为中性粒细胞在足垫和DRG中的浸润。通过ELISA可在组织匀浆中检测到高水平的炎症细胞因子。此外，在DRG中PRV基因和蛋白的表达（通过qPCR和免疫荧光染色检测）与促炎细胞因子的产生之间存在显著相关性。因此，足垫接种模型有助于深入理解甲型疱疹病毒诱导的神经病变的潜在机制，并可能推动创新治疗策略的开发。此外，该模型还可为多发性硬化等外周神经病变以及病毒诱导的PNS损伤相关研究提供指导。最终，该模型可作为一种经济高效的体内工具，用于药物研发。

小鼠足垫接种模型可用于在体内表征α疱疹病毒感染的免疫病理发生过程，包括病毒在接种足垫内的复制与扩散、向神经系统传播以及特异性神经炎症反应的诱导。
在本研究中，我们首先对小鼠后足垫进行擦伤处理，随后在擦伤区域进行模拟接种或接种伪狂犬病毒强毒株（PRV-Becker）。在对照组足垫中，擦伤部位清晰可见，并在愈合过程中形成结痂（图1，黑色箭头）。相比之下，接种PRV的小鼠在人道终点（82 hpi）表现出严重的炎症反应，特征为足垫肿胀和发红。
在用强毒性的PRV-Becker毒株进行足垫接种后，小鼠于接种后72小时开始出现临床症状，表现为接种侧足垫肿胀及震颤频率逐渐增加。至接种后82小时，感染PRV-Becker的小鼠出现持续性的患肢震颤以及典型的PRV症状，包括对接种足部的剧烈搔抓和啃咬行为。足垫部位还观察到严重的炎症反应。随后进一步表征了PRV感染过程中诱导的炎症反应，包括免疫细胞向组织中的浸润情况。
对多种组织进行...

足垫接种模型是体内表征病毒诱导的神经炎症反应的有力工具。特别是，该模型可清晰评估外周神经系统中启动的病毒动力学及相关的免疫病理过程。

本方案描述了一种足垫接种模型，用于研究甲型疱疹病毒（alphaherpesvirus）感染过程中神经炎症反应的启动与发展。

本方案可用于研究小鼠外周神经系统在病毒感染过程中神经炎症反应的启动与发展。利用该模型，感染从外周向周围神经系统及中枢神经系统传播的距离更长，从而能够最大程度地评估神经炎症反应的动力学特征。将5至7周龄的C57BL/6小鼠麻醉后置于手术垫上，仰卧位固定，确认其对足底反射无反应。使用100至180目的砂板，在一只后足底面的足跟与承重垫之间的无毛皮肤区域轻轻摩擦约20次，以进行表皮磨损。然后用精细镊子缓慢剥离因摩擦而松脱的角质层，以暴露基底层。轻柔混合后，将20 µL适当滴度的病毒接种物局部涂抹于磨损的足垫处。同时，在对照组动物的擦伤足垫中仅使用培养基进行模拟接种。每次接种后，每隔10分钟用针头针柄轻轻揉搓足垫10次，持续30分钟，以促进病毒吸附。当擦伤的足垫干燥后，观察小鼠直至其恢复胸卧位，然后将其放入单独的笼子中进行临床随访和取样。在适当的实验时间点，采集暴露于病毒的器官，包括心脏、肺、脾、胰腺、肝脏、肾脏和膀胱，分别置于预冷的1.5毫升离心管中，并置于冰上。随后，采集足跟与行走垫之间的磨损足垫组织，将样品分别放入预冷的1.5毫升离心管中并置于冰上。接着，将小鼠置于俯卧位，并用70%乙醇润湿其毛发。为了暴露脊柱，需在骨盆区域做一小切口，并将后肢的皮肤向头部方向剥离。使用剪刀沿脊柱两侧平行且紧贴脊柱剪切，以去除前肢和后肢。在颅底处切断并移除头部。使用剪刀从枕骨大孔向额骨方向剪开颅骨。然后用镊子向两侧轻轻撑开颅骨。接着用镊子小心地取出脑组织，并将脑组织放入预冷的1.5毫升离心管中，置于冰上。使用弯头剪刀清除脊柱上的肌肉、脂肪和软组织，并切除尾部。然后将完整的脊柱放入含有无菌冰冻 PBS 的 15 毫升离心管中，置于冰上保存，时间不超过三小时。解剖完成后，将脊髓转移至组织培养皿中，以便去除任何残留的软组织。使用剃刀刀片在 S2、L1 和 T1 椎骨处对脊柱进行三处横向切割。将组织片段转移至分别盛有无菌冰冻 PBS 的 15 毫米培养皿中。注意记录并标记各节段的来源，以供后续分析。接下来，用镊子固定一段组织，背侧朝上，使用刀片沿中线做一次纵向切割，将脊柱均分为两半。将两半组织放入一个新的培养皿中，培养皿内含有新鲜、无菌的冰浴 PBS，并保持原始方向，以便区分脊柱的左侧和右侧。在解剖显微镜下，用精细镊子从椎体的每一半中由头端向尾端方向轻轻剥离出脊髓组织。然后将两条脊髓半侧分别放入含有500微升无菌冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）的1.5毫升微量离心管中，置于冰上。为暴露背根神经节，轻轻从脊柱一侧向另一侧去除脑脊膜。并将暴露出的白色脊神经从脊柱中拉出。将圆形、透明的背根神经节从脊柱节段分离，并收集至含有冰冷 PBS 的 15 毫米培养皿中。按照上述方法，分别采集同侧和对侧的背根神经节。按照上述方法，从另外两个脊柱节段获取脊神经和背根神经节后，将所有装有组织的离心管进行高速离心。然后吸除上清液，并将样品在液氮中速冻，于-80°C保存直至进行匀浆。组织匀浆时，先将冷冻组织管置于冰上解冻，称取每份样品100毫克，转移至含有无菌珠子和500 µL放射免疫沉淀分析缓冲液的2 mL微量离心管中。接下来，在室温下使用匀浆器以每秒20个循环的速度匀浆组织2分钟，随后静置1分钟，再以每秒20个循环的速度继续匀浆2分钟。第二次匀浆完成后，高速离心组织样品，然后将每份上清液500 µL转移至新标记的合适试管中。于-20 °C保存，直至进行后续分析。在对照组足垫中可见擦伤部位。在愈合过程中，擦伤部位形成结痂是典型现象。相比之下，在人道终点时，接种伪狂犬病病毒的小鼠足垫表现出严重炎症，其特征为肿胀和发红。对接种部位的足垫和背根神经节进行组织病理学检查，发现伪狂犬病病毒感染小鼠足垫组织中存在表皮坏死及严重的真皮层炎症。在伪狂犬病病毒感染的背根神经节组织切片中也观察到中性粒细胞浸润。与对照组相比，在感染后7小时和82小时，伪狂犬病病毒感染小鼠的足垫和背根神经节中G-CSF蛋白表达水平均显著升高。与对照组相比，在伪狂犬病毒感染小鼠的脊髓、脑、心脏和肝脏组织中，感染后82小时也观察到显著水平的G-CSF。此外，在感染后24小时起，可在伪狂犬病毒感染小鼠所有被检测组织中检测到显著水平的IL-6。在濒死状态下，可在足垫、背根神经节、脊髓和脑组织中检测到伪狂犬病毒。在伪狂犬病毒感染小鼠的背根神经节神经元中，伪狂犬病毒糖蛋白gB在细胞质中高表达。为确保感染成功，柱状液滴中的病毒颗粒必须不从擦伤的足垫处脱落。该动物模型可作为评估抗炎和抗病毒药物疗效的平台，以预防病毒诱导的周围神经病变。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

小鼠脚垫接种模型，研究病毒引起的神经炎反应

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小鼠模型中实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

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建立中枢神经系统感染的小鼠模型

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在小鼠模型中诱导病毒性神经炎症

在本视频中，采用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）建立小鼠多发性硬化模型。将含有神经元肽和佐剂的乳剂注射至小鼠体内，引发免疫反应，激活自身反应性T细胞。随后注射百日咳毒素（PTX）以增加血脑屏障通透性，使自身反应性T细胞得以浸润脑组织。此类浸润启动信号级联反应，最终导致髓鞘损伤，模拟多发性硬化症的脱髓鞘病变状态。...

本视频展示了通过注射百日咳毒素以及含有模拟髓鞘肽段和佐剂的接种物，在小鼠模型中评估运动功能障碍的过程，随后进行跑台实验以评估运动功能，并评价因免疫激活和脱髓鞘所导致的神经损伤。...

评估实验性自身免疫性神经炎小鼠模型中的运动功能

本文介绍了一种用于检测TMEV感染小鼠进行性神经功能障碍的优化型Rotarod性能测试方案。...

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本报告重点介绍了利用小鼠背根神经节的器官型培养和分离的原代培养体系，以研究与神经元-胶质细胞相互作用、神经可塑性、神经炎症以及对病毒感染反应相关的多种机制。...

成年小鼠背根神经节外植体与分离细胞模型用于研究神经可塑性及对包括病毒感染在内的环境损伤的反应

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本文介绍了一种建立免疫健全的ICR（Institute of Cancer...

一种模拟登革病毒感染所致急性病毒性脑炎的小鼠模型

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在两种性别中建模多发性硬化症：MOG35-55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎

了解小鼠脚垫接种模型，用于研究病毒诱导的神经炎症反应动力学。该方法通过C57BL/6小鼠评估外周神经系统中的病毒动力学和免疫病理过程，为开发神经炎症疾病治疗策略提供重要依据。

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