Name: 飞行酒吧研究乙醇诱导的行为抑制和敏感性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 学习使用Flypub实验方法研究乙醇诱导的行为抑制和敏感性，以黑腹果蝇为模型。该方法可检测去抑制行为，帮助研究人员探索酒精使用障碍的神经生物学机制。

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本工作由 NIAAA 1R15AA020996、NIMH R21MH109953 和 Brain 资助 &amp;#38; 行为研究基金会NARSAD以及NIMHD 2G12MD007592 NMD研究组资助。我们还感谢由NIH资助的RISE项目（NIGMS 5R25GM069621）对NMD和CMS的支持，UTEP COURI-SURPASS项目对NMD的支持，由NIH资助的MARC项目（NIGMS 2T34GM008048-31）对AA的支持，以及Keelung Hong博士研究生奖学金对EBS的支持。我们衷心感谢UTEP传播系：Darlene Barajas、Christian Rivera、Karina Moreno、Jose Loya Fernandez，以及音乐系：Stephen A. Haddad，在视频和配音制作过程中提供的帮助。最后，我们非常感谢Andreas Thum博士分享 tβh 突变体在 Canton-S 背景与对照组 Canton-S 果蝇；以及Jessica Burciaga在章鱼胺初步研究中的宝贵贡献，Han实验室成员的讨论与支持。

注意：方案部分详细描述了准备工作、Flypub 实验及分析步骤，包括（1）装置组装，（2）果蝇饲养与收集，（3）实验站设置，（4）乙醇暴露，（5）求偶行为评分与数据分析，以及（6）统计分析。进行 Flypub 实验及分析的关键步骤已在流程图中展示（图 1）。
1. 腔室的组装（图2）
<ol>
	<li>使用剃刀刀片在圆柱形 Drosophila 培养瓶的 25 mL 刻度处切去底部。</li>
	<li>使用加热的电烙铁在培养瓶的 50 mL 刻度处打一个直径为 5 mm 的孔。 
	注意：此孔为果蝇转移至实验腔室的入口。</li>
	<li>将网状材料裁剪成直径为 54 mm 的圆形，以适配于 Drosophila 培养瓶的 75 mL 刻度位置。</li>
	<li>使用热熔胶在培养瓶的 75 mL 刻度处固定该网状圆片。</li>
	<li>将聚碳酸酯塑料片裁剪成直径为 70 mm 的圆形。</li>
	<li>使用热熔胶将聚碳酸酯塑料圆片固定在培养瓶的 25 mL 刻度处（即步骤 1.1 中形成的底部开口区域）。</li>
	<li>用重物压紧，以确保聚碳酸酯圆片牢固地附着在瓶底。</li>
	<li>用乙醇清洗果蝇收集管以去除任何气味，并在流动的蒸馏水中多次彻底冲洗。剧烈振荡收集管以去除多余水分。</li>
	<li>将收集管水平放置于纸巾上，在室温下晾干。</li>
</ol>
2. 果蝇饲养与收集
<ol>
	<li>将果蝇饲养在标准的玉米粉/琼脂/糖/酵母培养基中（https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/harvardfood.html）。</li>
	<li>在二氧化碳（CO2）麻醉条件下，收集1至2日龄的雄性果蝇，每组33只，作为一个数据点。确保选择形态完整的果蝇，并将其放入食物小瓶中恢复。 
	注意：每组果蝇数量可允许多两至三只或少一至三只。行为可能对实验条件敏感，因此每批次实验的总果蝇数量可能需要根据对照果蝇品系进行调整。 
	注意：确保将食物小瓶平放，以免麻醉后的果蝇粘附在培养基上。</li>
	<li>在乙醇暴露前，将果蝇置于25 °C、相对湿度至少50%、12小时光照/12小时黑暗循环的培养箱中饲养2天。 
	注意：充分清除CO2至关重要，以消除任何由CO2引起的生理或行为效应，避免干扰乙醇诱导的反应。</li>
	<li>在进行乙醇暴露及求偶行为评分时，使用代码对实验人员设盲，使其无法识别果蝇的基因型或处理条件。 
	注意：设盲测试有助于消除实验偏倚。</li>
</ol>
3. 检测工作站设置（图3A）
<ol>
	<li>在通风良好的房间内，于实验台面上设置一个带有连接中心臂的拍摄架。 
	注意：拍摄架并非必需，任何能提供水平平台的支撑装置均可使用。</li>
	<li>将两个侧臂夹紧固定在支架上，每个侧臂距离支架中心约18 cm。</li>
	<li>在支架的每个侧臂上各放置一个荧光灯，并在中间位置也放置一个荧光灯。</li>
	<li>将录像设备连接至中心臂，高度约为基座中心上方38 cm处，以便从顶部视角记录果蝇行为。</li>
	<li>用白纸覆盖支架基座，有助于增强深色果蝇的视觉对比度。</li>
	<li>在暴露实验当天，打开荧光灯以及连接至拍摄架上摄像机的计算机（图3A）。 
	注意：光照强度维持在2100–2200 lux时，可获得适合评分的高质量行为录像。然而，实验室内的环境光照条件已足以观察乙醇诱导的求偶行为。</li>
	<li>准备用于乙醇暴露实验的物品，如图3B所示。</li>
	<li>为一组实验准备六个清洁且组装好的观察小室，并将其编号为1至6。 
	注意：确保将随机化编码应用于果蝇基因型或处理条件。</li>
</ol>
4. 乙醇暴露（图3）
<ol>
	<li>使用小漏斗，通过 Flypub 腔室 50 mL 刻度处的孔口，轻柔地转移一组 33 只雄性果蝇。 
	注意：为尽量减少对果蝇的机械刺激，转移过程中应在 Flypub 下方放置鼠标垫或任何缓冲材料。</li>
	<li>用胶带封住孔口。 
	注意：胶带用于封闭孔口，防止果蝇从 Flypub 中逃逸。</li>
	<li>将 Flypub 按 1 至 6 的顺序排列在平台上。</li>
	<li>让果蝇在腔室内适应 10 分钟（图 3D）。</li>
	<li>调整相机设置，包括对焦、变焦和亮度，并记录适应期最后 5 分钟的视频，以测量基础求偶水平。 
	注意：为消除 Flypub 表面反光造成的眩光，可在 Flypub 底部放置实验室擦拭纸（通常为 4 层或厚度小于 1 mm），以调整角度。</li>
	<li>准备用于乙醇递送的棉垫：使用干净的剪刀将棉垫剪成四个相等的象限，然后修剪角落，使其在适应期间能适配于培养皿中（图 3C）。 
	注意：切勿用手直接接触棉垫。应使用镊子操作棉垫，以避免任何潜在的气味污染。</li>
	<li>将一块棉垫放入每个培养皿中。</li>
	<li>向每块棉垫加入 1 mL 95% 乙醇，确保乙醇溶液均匀分布在棉垫整个表面。</li>
	<li>用双层实验室擦拭纸覆盖，以防止乙醇快速蒸发。</li>
	<li>在适应结束后，通过 Flypub 底部开口，将含有乙醇浸润棉垫和双层擦拭纸的小培养皿放入 Flypub 中。</li>
	<li>重新将 Flypub 在平台上对齐，开始录像并同时启动计时器。</li>
	<li>在乙醇暴露期间持续记录 Flypub 中果蝇的行为，直至果蝇因镇静而停止求偶或运动。</li>
	<li>当超过 90% 的果蝇处于镇静状态时，使用刮铲将各 Flypub 中含乙醇的培养皿取出。</li>
	<li>通过 Flypub 上 50 mL 刻度处的孔口，轻柔地将果蝇转移回指定的培养管中。 
	注意：在食物培养管口放置漏斗以辅助转移。确保将镇静的果蝇放置在食物培养管壁一侧，防止其陷入食物中。</li>
	<li>用乙醇清洗 Flypub 以去除任何残留气味，并用流动的蒸馏水彻底多次冲洗。剧烈振荡 Flypub 以去除多余水分。</li>
	<li>将 Flypub 水平放置在纸巾上，于室温下晾干。</li>
	<li>将果蝇置于 25 °C 培养箱中，保持相对湿度至少 50%，并维持 12 小时光照 / 12 小时黑暗的循环条件。</li>
	<li>连续六天每天重复步骤 4.1–4.17&#160;，并确保每天在相同时间进行乙醇暴露，以避免昼夜节律的影响。 
	注意：每 2–3 天更换一次食物培养管，以维持果蝇健康状态。</li>
</ol>
5. 求偶行为评分与数据分析（图 4-6）
<ol>
	<li>使用媒体播放器（例如 VLC）打开录制的视频，并放大视频以清晰观察果蝇行为，进行评分（图 4A）。</li>
	<li>将时间码附加到视频中（图 4B）。</li>
	<li>每 10 秒&#160;为一个时间区间，统计在此期间进行求偶行为的雄蝇数量，包括跟随、单侧展翅、求偶链、求偶圈、腹部弯曲及骑跨等行为31（图 5）。</li>
	<li>将每个 10 秒时间区间内表现出求偶行为的雄蝇数量输入工作表中（图 6A）。</li>
	<li>选取连续三个 10 秒时间区间中求偶雄蝇数量的最大值，作为代表性数据点（图 6B）。</li>
	<li>计算连续 10 个最高值数据点的平均值（图 6C），该值代表每只雄蝇的雄性间求偶行为百分比（图 6A）。</li>
</ol>
6. 统计分析（补充图1）
<ol>
	<li>打开统计分析软件（例如 Minitab 17），并将求偶行为数据添加到工作表中。 
	注意：可使用任何统计分析软件。</li>
	<li>为确定数据分布类型（正态或非正态分布），进入 Stat 选项卡，选择 Basic Statistics，然后点击 Normality Test 选项（补充图 1Ai）。</li>
	<li>在 Variable 中选择单个数据列（每列代表一个待研究的基因型或处理组的数据集），选择 Anderson-Darling 检验，然后点击 OK（补充图 1Aii）。 
	注意：正态概率图将显示计算出的 P 值：若 P 值大于 0.05，则数据呈正态分布；若 P 值小于 0.05，则数据为非正态分布（补充图 1Aiii）。</li>
	<li>对于多组比较，通过点击 Data 选项卡，选择 Stack，然后选择 Columns，将待比较的列进行堆叠（补充图 1Bi）。</li>
	<li>在 Stack Columns 窗口中，选择要堆叠的数据列，并选择堆叠方式为 New worksheet 或 Column of current worksheet，同时指定下一列用于表示下标（例如数据组标识；补充图 1Bii-1Biii）。</li>
	<li>点击 Stat 选项卡，选择 ANOVA 检验，选择 General Linear Model，然后点击 Fit General Linear Model（补充图 1Ci）。</li>
	<li>在 General Linear Model 窗口中，在 Responses 框中选择待比较的列，在 Factors 框中选择包含下标的列，然后点击 OK，即可得到统计分析结果（补充图 1Cii-1Ciii）。</li>
	<li>对于两组正态分布数据的比较，点击 Stat 选项卡，选择 Basic Statistics，然后选择 2-Sample t-test（补充图 1Di）。</li>
	<li>在 2-Sample t for the Mean 窗口中，选择 Each sample is in its own column，从下拉框中分别在 Sample 1 和 Sample 2 框中选择要比较的两个组，然后点击 OK，即可得到统计分析结果（补充图 1Dii-1Diii）。</li>
	<li>对于两组非正态分布数据的比较，进入 Stat 选项卡，选择 Nonparametrics，然后点击 Mann-Whitney（补充图 1Ei）。</li>
	<li>在 Mann-Whitney 窗口中，在 First Sample 和 Second Sample 框中分别选择要比较的两个组，然后点击 OK，即可得到统计分析结果（补充图 1Eii-1Eiii）。</li>
	<li>对于三组或更多组非正态分布数据的比较，进入 Stat 选项卡，选择 Nonparametrics，然后点击 Kruskal-Wallis test（补充图 1Fi）。</li>
	<li>在 Kruskal-Wallis 窗口中，在 Response 框中选择待比较的列，在 Factor 框中选择包含下标的列，然后点击 OK，即可得到统计分析结果（补充图 1Fii-1Fiii）。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本报告中，我们描述了Flypub检测的设置及详细实验方案；这是一种用于测量反复乙醇暴露如何引发去抑制求偶行为和行为敏感化的新方法。尽管Flypub检测相对简单，但多个步骤需要特别注意，以确保结果可靠。首先，用于测试的果蝇必须完全色素化（即完全发育成熟的成虫），健康且完整。身体畸形或损伤，尤其是翅膀或腿部的损伤，可能会影响雄性果蝇的求偶能力。其次，果蝇的年龄至关重要，对照组与实验组之间必须保持年龄一致（最佳年龄：首次乙醇暴露时为3–5天龄）。两周龄及更年长的野生型雄性果蝇往往表现出升高的去抑制求偶水平31。因此，研究中果蝇的年龄匹配对于避免结果波动至关重要。第三，每间“pub”中的果蝇数量非常关键（最佳数量：每间33只）。每间pub中果蝇数量过低或过高均会显著影响求偶评分（数据未显示）。第四，Flypub实验腔室必须具有相同的体积，如图2B所示。这可确保果蝇同步接触乙醇蒸气，从而产生一致的行为反应。第五，清晰的视频记录和精确的求偶行为评分至关重要。本方案高度依赖行为观察，因此严格遵循标准化的求偶评分流程是减少结果不一致性的基础。最后，强烈建议乙醇暴露和求偶评分步骤均采用盲法进行，即实验操作者对果蝇的基因型或实验处理情况不知情，以防止实验偏倚。
Flypub 检测具有多种优势。首先，可同时测试并比较多组果蝇。其次，该方法成本低廉、搭建简单、易于掌握，非常适合包括从小学、中学、本科生、研究生、博士后到教职人员等各个层次的研究者使用，也适用于空间和预算有限的教学实验室。第三，该方法可用于检测其他行为，例如雌性果蝇的去抑制求偶行为，以及乙醇或其他镇静剂的镇静效应，以评估初始敏感性以及耐受性的形成与维持31,32。综上所述，Flypub 是一种研究酒精使用障碍（AUD）多种特征的多功能方法。
Flypub 检测方法的主要局限在于其严格且繁琐的求偶行为评分流程。在乙醇影响下的求偶行为具有高度动态性，表现为求偶持续时间从不到一秒到数分钟不等，且参与求偶的果蝇频繁发生变化。本文所采用的评分方案旨在纳入这种动态特性，并为特定基因型在单次乙醇暴露下的表现提供一致的评分结果31,32。如实验方案中所述，求偶活动需人工评分，耗时较长。目前已开发出多种自动评分程序，以促进无偏倚的高通量行为筛选，这些程序均依赖于对个体果蝇运动轨迹和位置的追踪39,40,41,42,43,44,45。我们亦曾尝试开发计算机软件以自动统计求偶行为，但未能获得稳定可靠的结果。这可能是因为行为评分需同时涵盖多个果蝇的多种求偶步骤（例如跟随、单侧翅膀伸展、腹部弯曲及交配尝试）35,36,46。尽管存在此局限，经过充分培训的实验人员仍应能够一致且准确地量化乙醇诱导的求偶行为。然而，未来若能采用机器学习或其他先进算法作为后续手段，将具有重要意义并极大促进该领域的发展。
与啮齿类模型类似，果蝇模型中关于乙醇的研究也主要集中于乙醇对运动的兴奋作用和镇静作用。然而，Flypub 检测方法测量的是去抑制的求偶行为，这是一种新型的认知去抑制现象31,32。因此，Flypub 可有助于阐明参与行为去抑制和行为敏感化的关键分子、细胞通路、神经环路以及风险因素（例如年龄、睡眠、饮食或社会环境）。我们先前已证明，多巴胺信号传导对乙醇诱导的行为敏感化（EIBS）是必需的，这与啮齿类模型和人类研究的结果一致6,9,31。作为概念验证，我们还检测了缺乏章胺（OA，即去甲肾上腺素在无脊椎动物中的对应物）的 tβh 突变体，发现尽管章胺的作用相对多巴胺较小，但其在乙醇去抑制效应的行为敏感化过程中同样具有重要作用31。这一发现与 Scholz47 的观察结果形成对比：该研究指出 tβh 突变体果蝇在对乙醇运动激活效应的敏感化过程中并无明显缺陷47。这表明，介导行为敏感化的分子、细胞和神经通路在去抑制效应与运动激活效应之间存在差异。后续研究应进一步验证这一引人关注的观点。
总之，Flypub 是一种低成本、多层面且有效的方法，可用于研究对乙醇的行为反应，特别是去抑制和行为敏化，这可能有助于增进我们对酒精使用障碍（AUD）的理解，并为这种慢性疾病的干预措施提供见解。

酒精是全球最易获得且被广泛使用的精神活性物质之一。它具有很高的滥用和成瘾风险，但其背后的作用机制尚未被完全阐明。乙醇可在蠕虫1、果蝇1,2,3、小鼠4、大鼠5以及人类6中引发去抑制、欣快感、认知功能损害、活动过度、运动控制能力丧失及镇静等效应，表明从无脊椎动物到包括人类在内的哺乳动物之间，存在共同的神经生物学机制介导乙醇的作用。长期摄入乙醇会导致神经系统的适应性改变和行为学变化，这些变化构成了酒精使用障碍（AUD）的基础。其中一种适应性变化是行为敏化，即在反复接触乙醇7,8,9&#160;或其他成瘾性物质10,11,12后，机体反应性增强的现象。
数十年来，关于乙醇诱导的行为敏化（EIBS）的研究主要集中在乙醇的运动刺激效应上，该效应被用作欣快反应的替代指标7,8,9,13。例如，大鼠或小鼠在重复给予乙醇（每24、48或72小时一次）后，其行走速度所衡量的运动活动显著增强8,14,15,16,17,18,19,20,21。类似地，果蝇在首次暴露于乙醇蒸气后4小时再次暴露时，其行走速度所反映的运动反应也显著增强22。尽管目前尚无关于果蝇中乙醇运动刺激效应相关EIBS机制的信息，但在大鼠和小鼠中的研究已揭示了参与EIBS的关键分子与信号通路（例如多巴胺、谷氨酸和GABA系统），以及相关的神经基础和神经环路（例如腹侧被盖区、伏隔核、杏仁核和前额叶皮层）6,9,23。
去抑制是乙醇的主要效应之一，可导致通常受到限制的行为表现出来。这种去抑制效应作用于运动、情绪、社交、性行为和认知功能，可能在人类和动物模型中引发不适当的性行为、言语或身体攻击以及冲动行为24,25,26,27,28,29。乙醇诱导的去抑制已在动物模型中用于机制研究，包括啮齿类动物和猴子的运动冲动性与攻击行为，以及线虫的觅食去抑制行为6,9,24,28,29,30。我们已证明，果蝇在乙醇影响下会表现出性行为去抑制31。具体而言，野生型雄性果蝇在无乙醇时极少对其他雄性进行求偶行为31，即使发生此类行为，被求偶个体也会主动拒绝求偶者。然而，在乙醇作用下，雄性果蝇对其他雄性的求偶行为增加，而被求偶个体的拒绝行为减少，从而导致总体雄性间求偶行为增强。值得注意的是，果蝇在反复暴露于乙醇后会对去抑制效应产生行为敏感化，这一特性使其成为研究乙醇诱导行为敏感化（EIBS）的独特系统31,32。
在本报告中，我们描述了如何建立、实施、排查问题以及分析 Flypub 检测及其数据，以研究乙醇诱导的果蝇Drosophila melanogaster去抑制和敏感化现象。为了验证该方法的实用性和有效性，我们测试了野生型Canton-S（CS；对照果蝇品系）以及缺乏酪胺β-羟化酶（tβh）的果蝇，后者无法合成章胺（OA）。章胺（OA）是无脊椎动物中的主要神经调质33,34，并在果蝇乙醇耐受性的形成中发挥关键作用22。本文首次报道了章胺（OA）在乙醇诱导的去抑制和敏感化（EIBS）中具有重要作用。

<table><tbody><tr><td>95 % 乙醇</td><td>VWR Chemicals</td><td>BDH1158-4LP</td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;坎顿-S&lt;/i&gt;</td><td>-</td><td>-</td><td>用作对照的野生型菌株</td></tr><tr><td>带臂式复制架</td><td>Kaiser</td><td>205411</td><td>型号 RS 2-XA，带有一个中央臂和两个侧臂；用于建立果蝇培养站</td></tr><tr><td>棉片</td><td>瑞士奶酪切片器</td><td>COT-027</td><td>递送乙醇</td></tr><tr><td>Excel</td><td>微软</td><td>-</td><td>用于分析数据；可使用任意工作表或电子表格软件</td></tr><tr><td>荧光灯泡</td><td>美国之光</td><td>7108N</td><td>最大功率（120 V-70 W 最大）；用于照亮果蝇培养站</td></tr><tr><td>Microsoft LifeCam 软件</td><td>微软</td><td>-</td><td>版本 3.60；用于录制 flypubs 视频</td></tr><tr><td>Microsoft LifeCam Studio</td><td>微软</td><td>Q2F-00013</td><td>1080P 高清传感器；用于拍摄果蝇行为视频</td></tr><tr><td>Minitab 17</td><td>Minitab</td><td>-</td><td>版本17；用于进行统计分析；可使用任何统计分析软件</td></tr><tr><td>尼龙网片</td><td>Sefar Nitex</td><td>-</td><td>型号 B0043D1TVY，不透明白色，200 微米网孔；用于制作果蝇饲养杯</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Falcon</td><td>08-757-100A</td><td>35 x 10 mm；用于输送乙醇</td></tr><tr><td>中等尺寸塑料漏斗</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-348A</td><td>直径65 mm，高67 mm；用于将麻醉后的果蝇从果蝇培养瓶转移至食物管</td></tr><tr><td>小型塑料漏斗</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-202-121</td><td>直径4 mm，高46 mm；用于将果蝇从试剂瓶转移至果蝇培养管</td></tr><tr><td>聚碳酸酯板</td><td>Lexan</td><td>-</td><td>0.762 mm 厚度，透明，610 x 1220 mm（标称尺寸）；用于制作 flypub</td></tr><tr><td>圆底烧瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS115</td><td>聚丙烯，高103 mm，直径60 mm，容量177 ml；用于制作果蝇培养瓶</td></tr><tr><td>电烙铁</td><td>Weller</td><td>WES51</td><td>在果蝇培养瓶上打孔</td></tr><tr><td>时间码</td><td>-</td><td>-</td><td>.smi 文件，由韩实验室创建的字幕时间码，用于在求偶行为评分期间监控时间；可使用任何时间字幕</td></tr><tr><td>&lt;i&gt;酪胺 &amp;#946; 羟化酶（t&amp;#946;h)&lt;/i&gt;</td><td>-</td><td>-</td><td>突变果蝇品系（&lt;i&gt;nM18&lt;/i&gt; 无效等位基因）缺陷的 &lt;i&gt;t&amp;#946;h&lt;/i&gt; 在野生型中 &lt;i&gt;Canton-S&lt;/i&gt; 背景；由德国莱比锡大学Andreas Thum博士提供</td></tr><tr><td>VLC 媒体播放器</td><td>VideoLAN</td><td>-</td><td>版本 3.0.8；可使用任意媒体播放器对求偶行为进行评分</td></tr></tbody></table>

研究乙醇诱导的行为去抑制与敏感化现象的 flypub

Flypub To Study Ethanol Induced Behavioral Disinhibition and Sensitization

酒精使用障碍（AUD）在当今社会仍然是一个严重的问题。为了开发有效的成瘾干预措施，理解其潜在的神经生物学机制至关重要，而这需要多种实验方法和模型系统。酒精饮料的主要成分为乙醇，长期摄入会引起中枢神经系统和行为的适应性改变。其中，行为敏化（即反应增强）是成瘾背后的关键适应性变化之一。目前大多数关于乙醇诱导行为敏化的动物模型研究，主要集中在乙醇对运动活性的促进作用。乙醇的一个显著效应是导致行为去抑制。然而，针对乙醇去抑制效应的行为敏化研究却相对不足。为解决这一问题，我们开发了Flypub检测方法，可在重复乙醇暴露条件下，定量测量黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中去抑制求偶行为的增强效应。&#160;本文详细报告了Flypub检测的逐步操作流程，包括乙醇暴露室的组装、检测工作站的设置、果蝇饲养与收集的标准、乙醇递送方式、去抑制求偶行为的量化、数据处理及统计分析方法。同时提供了关键步骤的故障排除策略、局限性的克服方法，以及该方法在评估其他乙醇诱导行为中的拓展应用。Flypub检测结合黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）强大的遗传工具，将有助于揭示乙醇诱导行为敏化的潜在机制。

本部分展示了代表性 Flypub 实验的结果。Drosophila 雄性极少对其他雄性进行求偶35,36。在首次乙醇暴露期间，野生型 Canton-S（CS）雄性的非抑制性雄性间求偶行为略有增加，但无统计学意义31（图 7A）。然而，CS 雄性在后续的乙醇暴露中表现出非抑制性求偶行为的显著增强（ANOVA GLM，CS：R2=0.83，F(5,66)=65.21，p &lt; 0.0001；n = 12；图 7A），表明对乙醇的去抑制效应产生了行为敏化。我们此前已证明，这种乙醇诱导的行为敏化（EIBS）需要多巴胺及其受体 DopEcR 在蘑菇体神经元中的参与31,32。
为了确定是否有其他神经调质参与乙醇诱导的去抑制行为（EIBS），我们通过检测缺乏酪胺β-羟化酶（tyramine β hydroxylase）的果蝇（tβh; nM18 null allele）37,38来研究章胺（OA）的作用。该酶是章胺生物合成中的限速酶，因此这些果蝇体内缺乏章胺。在CS遗传背景下（由德国莱比锡大学Andreas Thum博士惠赠）的tβh雄性果蝇，在每日乙醇暴露后表现出敏感化的去抑制求偶反应（ANOVA GLM，tβh：R2=0.67，F(5,66)=27.60，p &lt; 0.0001；n = 12；图7B），但其反应水平低于CS品系（ANOVA GLM，交互作用效应：F=2.50，p &lt; 0.034）。在事后分析中，与CS相比，tβh雄性果蝇在每次乙醇暴露后的雄性间求偶行为水平均较低，这种差异在第四至第六次乙醇暴露期间尤为明显（双样本t检验：EXP4中p &lt; 0.002，EXP5中p &lt; 0.004，EXP6中p &lt; 0.021；n = 12；图7C）。综上所述，这些结果表明章胺可能在乙醇诱导的去抑制效应中发挥作用。更重要的是，这些数据明确展示了Flypub检测方法在研究乙醇诱导的去抑制和行为敏感化方面的实用性和有效性。
<img alt="Flypub 检测流程示意图；收集雄性果蝇、乙醇暴露、视频评分、数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：Flypub 检测工作流程。 该工作流程图展示了进行 Flypub 检测的关键步骤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="水力平衡装置，包含施工工具和塑料杯改装示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：Flypub装置的材料与组装。（A）构建Flypub装置所需的材料包括（i）热熔胶棒，（ii）热熔胶枪，（iii）剃须刀片，（iv）电烙铁，（v）直尺，（vi）网筛，（vii）聚碳酸酯塑料板，以及（viii）圆底Drosophila培养瓶。（B）Flypub装置组装的示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="植物生长培养箱设置、材料、纸条切割过程以及在琼脂平板上的萌发试验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：乙醇暴露实验。（A）组装完成的 Flypub 装置。（B）乙醇暴露实验所需材料包括（i）P1000 移液器，（ii）胶带，（iii）棉垫，（iv）培养皿，（v）实验室擦拭纸，（vi）小型漏斗，（vii）计时器，（viii）中型漏斗，（ix）鼠标垫，（x）剪刀，（xi）95% 乙醇，（xii）镊子以及（xiii）刮刀。（C）切割棉垫的操作步骤。（D）载物台上排列好的“pubs”顶部视图图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示视频编辑工具的VLC软件界面：效果、滤镜、几何调整、交互式缩放分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：行为评分的视频设置。图中展示了分步操作指南：（A）如何对视频进行放大，以及（B）如何将时间码文件导入VLC媒体播放器以进行行为评分。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="果蝇行为研究；显示分组模式的示意图；昆虫学研究视觉数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：雄性求偶行为。代表性图像展示了黑腹果蝇（Drosophila）雄性求偶行为，包括跟随行为和单侧翅膀伸展，用于记录（A）求偶鸣唱、（B）求偶链、（C）求偶环、（D）腹部弯曲以及（E）交配攀爬等行为评分。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="使用 MAX 和 AVERAGE 函数进行电子表格公式分析；数据部分表示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图6：数据输入与分析。（A）每10秒时间段内参与求偶行为的雄性个体数量被记录到工作表中。三个连续的10秒时间段内求偶雄性数量的最大值（绿色箭头）被用作代表性数据点。每家酒吧（pub）中连续10个代表性数据点（蓝色或橙色括号）的平均值中具有最大值者，代表雄性间求偶行为的百分比[橙色括号；MAX（平均值），黑色箭头]。（B,C）用于计算每家酒吧代表性数据点最大值以及连续10个代表性数据点最大平均值的工作表公式。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="实验中雄性间求偶行为百分比；图A和图B，回归线，R²值。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61123/61123fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：乙醇引起的行为去抑制与敏感化 CS 和 tβh. (A,B）该 CS 和 tβh 雄性在反复暴露于乙醇后表现出敏感化的求偶去抑制行为（ANOVA GLM， CS： R2=0.83, F(5,66)=65.21, p &lt; 0.0001; tβh: R2=0.67, F(5,66)=27.60, p &lt; 0.0001; n = 12). (C）该 tβh 雄性表现出的抑制解除求偶行为较对照组少 CS （n=12）。该 p 事后分析的数值显示在横线上方。雄性间求偶行为的分析基于每次乙醇暴露所生成的视频数据。所有数据均以均值 ± 均值标准误表示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充图1：统计分析。 在 Minitab 17 软件中执行以下操作的步骤：（A）正态性检验，（B）数据堆叠，（C）一般线性模型方差分析检验，（D）双样本t检验，（E）Mann-Whitney 检验，以及（F）Kruskal-Wallis 检验。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61123/61123supfig1large.jpg" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

Flypub 检测法用于测量果蝇 Drosophila melanogaster 在乙醇作用下所表现出的行为。该检测方法易于各级实验人员掌握，并可应用于多种挥发性刺激物，有助于物质滥用和成瘾研究。

研究乙醇诱导的行为去抑制与敏感化现象的 Flypub

酒精使用障碍（AUD）在我们的社会中仍然是一个严重的问题。为了开发有效的成瘾干预措施，有必要理解……

果蝇行为检测（Flypub检测）用于测量在酒精影响下的去抑制行为，从而促进对酒精使用障碍的机制研究。酒精是全球最容易获得且被广泛滥用的药物之一。然而，酒精使用障碍的神经生物学机制尚未完全阐明。果蝇（Drosophila melanogaster）已被广泛用于研究乙醇对欣快感、运动能力、抑制解除以及镇静作用的影响。此外，它也被用于研究与成瘾相关的行为长期且持久的改变，例如耐受性、敏感化以及对乙醇的主动寻求行为。在果蝇及其他动物模型中的许多研究主要关注乙醇对运动行为的激活作用。乙醇的另一种显著效应是行为去抑制，然而对这一效应的研究却相对不足。为了解决这一关键问题，我们开发了Flypub实验，用于检测在乙醇影响下的去抑制行为。组装Flypub装置时，取一个圆形瓶，用剃刀片在25毫升刻度处将其底部切掉。然后使用加热的电烙铁在50毫升刻度处打一个孔。这是引入果蝇的入口。在75毫升刻度处放置一个直径为54毫米的圆形网筛，并使用热熔胶固定。在底部开口端放置一个直径为70毫米的透明塑料片，并使用热熔胶固定。为确保塑料圆片牢固地附着在底部，需使用重物施加压力。将33只雄性果蝇收集为一组，放置于培养管的一侧。 将它们置于25 °C、相对湿度至少50%、12小时光照/12小时黑暗循环的培养箱中，乙醇暴露前培养2天。打开照明、计算机和摄像机以进行视频记录，准备Flypub检测装置。每组实验准备六个pub。用数字1到6进行标记。使用小型漏斗将果蝇轻轻引入交配箱中。用胶带封闭交配箱。让果蝇适应环境10分钟。在适应期间，调整相机焦距并记录适应期的最后五分钟。在适应期间，准备用于递送乙醇的棉垫。将一块棉垫剪成四个相等的象限，然后修去角落以便放入培养皿中。将一块棉垫放入培养皿中。向棉垫中加入1毫升95%乙醇。确保乙醇溶液均匀分布在垫片的整个区域。迅速用实验室擦拭纸盖住培养皿。小心地将含有乙醇的培养皿放置在每个酒馆下方。将果蝇在载物台上排列整齐。开始录制的同时启动计时器。持续录制，直至果蝇停止求偶或移动。当超过90%的果蝇被麻醉后，移去含有乙醇的培养皿。轻轻将麻醉后的果蝇转移回食物小瓶中。将其放回培养箱。连续六天，每天重复上述步骤一次。使用媒体播放器打开视频，随后每10秒记录一次参与求偶行为的雄性个体数量。需要评分的求偶行为包括：单侧翅膀伸展、求偶链、求偶环、腹部弯曲和骑跨。图中显示了果蝇行为的代表性记录。在适应阶段，雄性果蝇活动较少。在首次暴露期间，雄性表现出零星的求偶行为；在第六次暴露期间，雄性表现出活跃的求偶行为。请记录在10秒时间段内表现出求偶行为的雄性数量。将求偶雄蝇的最大数量按连续三个10秒时间段记录，作为代表性数据点。取连续10个数据点中数值最高的平均值，代表每只雄蝇的雄性间求偶百分比。野生型Canton-S在反复暴露于乙醇后，表现出逐渐增强的去抑制求偶行为活性。这代表了对乙醇去抑制效应的行为敏化。我们通过检测缺乏酪胺β-羟化酶（T beta H）因而缺乏章鱼胺的果蝇，来研究章鱼胺在敏化过程中的作用。与Canton-S类似，T beta H突变体在重复暴露于乙醇后也表现出增强的反应，但程度较低。在比较 T beta H 和 Canton-S 时，我们观察到在每次暴露条件下，T beta H 突变型雄性果蝇的去抑制求偶行为均少于 Canton-S 雄性果蝇，这表明章胺可能在敏感化过程中发挥重要作用。现在，您可以使用 Flypub 检测来建立、实施并分析乙醇诱导的行为。需要牢记的关键点包括：第一，正确组装实验装置。二、乙醇递送稳定；三、行为学评分精确且无偏倚。Flypub 检测具有多种优势：操作简单、建立成本低廉且易于掌握。此外，可同时对多组果蝇进行检测，有助于研究遗传或实验操作所产生的效应。Flypub 检测法适用于从小学、中学、本科到研究生阶段的学生，以及博士后和教职人员等各个层次的研究人员。总之，Flypub 检测法将帮助您鉴定出参与酒精使用障碍的分子因子、细胞通路、脑神经环路以及风险因素。

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Research

科研

JoVE Journal

Behavior

行为

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研究乙醇诱导的行为去抑制与敏感化现象的 Flypub

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