利用染色质免疫沉淀-外切酶技术（ChIP-Exo）在小鼠干细胞来源的神经元中进行蛋白质-DNA相互作用的高分辨率作图
2020年8月14日
精确测定蛋白质在整个基因组上的结合位点对于理解基因调控至关重要。本文描述了一种 基因组定位方法，该方法对染色质免疫沉淀获得的DNA进行外切酶消化处理（ChIP-exo），随后进行高通量测序。该方法可在哺乳类神经元中以接近单碱基对分辨率和高信噪比检测蛋白质-DNA相互作用。
与传统的染色质免疫沉淀方法相比，我们采用的ChIP-exo方法的主要优势在于提高了细胞内蛋白质与DNA相互作用的定位分辨率。为进行ChIP实验，准备蛋白G磁珠时，需将磁珠充分混匀至均匀状态，然后取25 µL磁珠加入2 mL低吸附蛋白管中。
向珠子中加入一毫升封闭液。用移液器充分混匀，然后将离心管置于磁力架上静置一分钟。待上清液变澄清后，移除上清液。
接下来，向珠子中加入一毫升封闭液。将离心管置于4°C的摇床上，轻轻摇动10分钟，然后短暂离心。将离心管放在磁力架上，吸除上清液。
向磁珠中加入 500 µL 封闭液。短暂离心抗 Islet-1 抗体，然后将 4 µg 该抗体加入含有磁珠的离心管中。将含有磁珠和 Islet-1 抗体的离心管置于 4 °C 的摇床上，轻轻摇动孵育 6 至 24 小时。
开始染色质免疫沉淀时，用一毫升封闭溶液洗涤包被抗体的磁珠。将含有包被抗体磁珠的离心管置于摇床上，在四摄氏度下孵育五分钟。短暂离心后，将离心管置于磁力架上，移除上清液。
将抗体包被的磁珠重悬于50微升封闭液中。向抗体包被的磁珠中加入1毫升超声处理的裂解液，然后在4摄氏度下于摇床上孵育过夜。样品孵育过夜后，短暂离心收集管盖上的液体，然后将管子置于磁力架上。
一分钟后，用移液器小心吸去上清液。接下来，按如下步骤进行一系列洗涤：向样品中加入1毫升含有CPI的冰冷洗涤缓冲液。
将样品在4°C的摇床平台上混匀5分钟。短暂离心样品管，然后置于磁力架上。一分钟后，用移液器吸去上清液。
对于第一步的酶促反应以及修复和DA加尾，向样品中加入38微升经高压灭菌的双蒸水，然后加入末端修复反应混合液和末端修复酶混合液。用移液器吹打混匀管内溶液，随后在20摄氏度孵育30分钟。接下来，按照前述方法依次用高盐洗涤缓冲液、氯化锂洗涤缓冲液和10毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液洗涤样品磁珠。
进行接头连接反应时，向样品中加入27微升冰冷的10毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液。然后加入接头、连接增强剂和连接酶预混液。将样品在20摄氏度孵育15分钟。
再次用高盐洗涤缓冲液、氯化锂洗涤缓冲液和10毫摩尔/升Tris盐酸缓冲液洗涤样品磁珠。然后向样品中加入47微升冰冷的10毫摩尔/升Tris盐酸缓冲液。为修复因缺少磷酸二酯键而导致的DNA切口，向样品中加入11.1微升填平反应混合液。
将样品在30摄氏度下孵育20分钟。经过一系列洗涤后，向样品中加入50微升冷的经高压灭菌的双蒸水。为了从5'到3'方向消化ChIP DNA，加入λ外切酶缓冲液和λ外切酶，并用移液器吹打混匀样品。
将样品在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。消化完成后，再次重复三次洗涤步骤。为从磁珠中洗脱 ChIP 样品，将样品重悬于 75 µL ChIP 洗脱缓冲液中，并在 130 ×g 条件下于 65 摄氏度孵育 15 分钟。向样品中加入 2.5 µL 的 20 mg/mL 蛋白酶 K。
将样品短暂涡旋，然后在65摄氏度下孵育过夜。短暂离心样品并置于磁力架上。一分钟后，将上清液转移至新的1.5毫升离心管中。
纯化并洗脱DNA。纯化洗脱的DNA后，将16微升提取的DNA样品转移至PCR管中。向样品中加入1.2微升变性与引物退火混合液。
使用文稿中表六所述程序，使引物与模板DNA发生变性并退火。向样品中加入3微升引物延伸混合液，并运行文稿中表七所述的PCR程序。向样品中加入4.1微升DA加尾混合液，并使用文稿中表八所述的PCR程序进行扩增。
然后向样品中加入 21.5 µL 通用接头连接混合液，在 20 °C 下孵育 15 分钟。向样品中加入 29 µL LM-PCR 混合液，然后按照手稿中表 10 的程序运行样品。经过 18 个循环的 LM-PCR 后，对来自小鼠运动神经元的 ChIP-exo 样品进行 1.5% 琼脂糖凝胶电泳。
Islet-1 的 ChIP-exo 实验结果显示，在 200 至 400 个碱基对附近出现了扩增的 DNA 文库，表明 ChIP-exo 文库已通过 LM-PCR 成功扩增。约 100 个碱基对处的条带代表来自接头和 PCR 引物的副产物。无抗体对照表明，非特异性背景 DNA 已被λ外切酶处理所降解。
通过 ChIP-exo 和 ChIP-seq 技术，鉴定了 Islet-1 的结合位点。ChIP-exo 信号在 Islet-1 结合位点处高度集中，检测到多个成簇的 Islet-1 转录因子结合模式。而 ChIP-seq 信号则呈现较宽泛的峰，表明在 Islet-1 的检测中，ChIP-exo 比 ChIP-seq 具有更高的定位分辨率。
多个转录因子通常作为蛋白质-DNA复合物结合在DNA上相邻的位置。ChIP-exo技术使我们能够研究多个转录因子如何识别并调控靶DNA。
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概述
本研究介绍了一种基因组定位方法，可提高哺乳动物神经元中蛋白质-DNA相互作用的分辨率。该方法利用经外切酶消化处理的染色质免疫沉淀DNA，再结合高通量测序，实现了接近单碱基对的定位分辨率。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 基因组学
- 基因调控
背景
- 理解蛋白质-DNA 相互作用对基因调控至关重要。
- 传统方法在图谱分辨率方面存在局限性。
- ChIP-exo 提供了更优的检测能力。
- 该方法在研究哺乳动物神经元时尤为有用。
研究目的
- 提高蛋白质-DNA 相互作用定位的分辨率。
- 提供一种可靠的基因组定位方法。
- 增强对基因调控机制的理解。
使用的方法
- 染色质免疫沉淀后接核酸外切酶消化。
- 高通量测序用于数据获取。
- 为染色质免疫沉淀制备蛋白G磁珠。
- 配制混合与封闭溶液以实现最佳结合。
主要结果
- 在图谱绘制中实现了接近碱基对分辨率的精度。
- 结果显示了高信噪比。
- 在哺乳动物神经元环境中验证了该方法。
- 为蛋白质-DNA 相互作用提供了深入见解。
结论
- ChIP-exo 方法显著提高了定位分辨率。
- 该技术有助于研究基因调控。
- 未来的应用可能增进我们对神经元功能的理解。
常见问题
行业高管相关性
高分辨率的蛋白质-DNA相互作用图谱能够在早期发现阶段实现精确的靶点验证，通过以接近单碱基对精度解析转录因子结合位点，减少基因调控研究中的机制模糊性，并提高在神经系统疾病模型中先导靶点识别的可预测性。该方法通过区分基因组中的特异性信号与非特异性信号，增强了治疗假设的去风险化能力。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够在与疾病相关的神经元系统中研究转录调控机制。
- 操作价值：提供高灵敏度的蛋白质-DNA结合检测，同时降低背景噪声。
- 预测价值：通过绘制成簇的转录因子结合模式，支持功能靶点的验证。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成定量、高分辨率的结合谱图，用于实验标准化。
- 操作价值：产生适用于下游测序流程的可重复DNA文库。
- 可扩展性价值：可在神经元模型中针对多种转录因子重复使用该平台。
转化与临床前研究
- 科学价值：将发现阶段的结合数据与干细胞来源神经元中与疾病相关的基因调控联系起来。
- 操作价值：通过一致的基因组读数，确保从靶点识别到临床前验证的连续性。
- 风险缓解：通过消除假阳性结合信号，支持降低机制模型的风险。
流程与工作流整合
该方法通过提供精确的基因组结合数据以指导靶点的选择与优先排序，适用于从靶点假设验证到先导物发现的整个研究连续过程。
- 发现生物学：通过高分辨率绘制转录因子占据图谱，支持假设检验和通路阐明。
- 筛选：利用标准化的、经核酸外切酶消化的DNA文库，实现片段大小均一，从而支持检测就绪。
- 分析：提供定量结合信号，允许在不同实验条件下比较蛋白质-DNA相互作用。
- 转化研究：通过在与疾病相关的神经元系统中验证结合位点，连接临床前研究的连续性。
- 企业级复用：作为可重复使用的基因组定位技术，支持神经科学发现项目中多个靶点的研究。
运营与企业影响
- 科学价值：通过接近碱基对水平的定位分辨率，实现对靶点验证的可预测性置信度。
- 操作价值：通过受控的外切核酸酶消化和文库制备，实现标准化与可重复性。
- 战略价值：通过减少结合位点鉴定中的假阳性，提高“推进/终止”决策的准确性。
- 项目组合影响：基于高置信度的基因组结合数据，对靶点进行风险校正后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备染色质免疫沉淀和酶法DNA处理方面的专业知识。
- 依赖于磁珠操作设备、外切核酸酶以及高通量测序技术的可及性。
- 需要跨团队在抗体验证和洗涤严格性方面进行标准化。
- 适应性考虑因素包括针对不同转录因子和神经元亚型的优化。
- 实际限制因素包括输入DNA的质量和抗体特异性对信号清晰度的影响。
