使用色素免疫沉淀-外核酶（ChIP-Exo）对小鼠干细胞衍生神经元中的蛋白质-DNA相互作用进行高分辨率映射
2020年8月14日
精确确定整个基因组中的蛋白质结合位置对于理解基因调控非常重要。在这里，我们描述了一种基因组映射方法，它用外核酶消化（ChIP-exo）处理染色质免疫沉淀DNA，然后进行高通量测序。该方法可检测哺乳动物神经元中具有近碱基对映射分辨率和高信号噪声比的蛋白质-DNA相互作用。
与传统的染色质免疫沉淀方法相比，我们的 ChIP-exo 方法的主要优点是提高了细胞中蛋白质 DNA 相互作用的作图分辨率。要制备用于 ChIP 的蛋白 G 磁珠，请将磁珠混合直至均匀。然后将 25 μL 磁珠添加到 2 mL 蛋白质低结合管中。
向珠子中加入 1 毫升封闭溶液。通过移液充分混匀，然后将试管放在磁力架上 1 分钟。上清液澄清后，将其去除。
接下来，向磁珠中加入 1 毫升封闭溶液。将管子放在 4 摄氏度的摇床上，摇动 10 分钟，然后短暂旋转管子。将试管放在磁力架上并去除上清液。
向磁珠中加入 500 μL 封闭溶液。短暂旋转抗 Islet-1 的抗体，然后将 4 μg 抗体添加到含有磁珠的试管中。将含有磁珠和 Islet-1 抗体的试管放在 4 摄氏度的摇床上，摇动 6 至 24 小时。
要开始染色质免疫沉淀，请在 1 mL 封闭溶液中洗涤抗体包被的微珠。将含有抗体包被珠子的试管放在 4 摄氏度的摇床上 5 分钟。短暂旋转后，将试管放在磁架上并去除上清液。
将抗体包被的磁珠重悬于 50 μL 封闭溶液中。向抗体包被的微珠中加入 1 mL 超声裂解物，然后将样品在 4 摄氏度的摇床上孵育过夜。让样品孵育过夜后，通过短暂旋转试管从盖子中收集液体，然后将试管放在磁力架上。
一分钟后，用移液管小心去除上清液。接下来，按如下方式执行一系列洗涤。向样品中加入 1 毫升含有 CPI 的冷洗缓冲液。
在 4 摄氏度的摇床上混合样品 5 分钟。短暂旋转样品管，然后放在磁力架上。一分钟后，用移液管除去上清液。
对于第一次酶促反应和修复以及 DA 拖尾，向样品中加入 38 微升高压灭菌的双蒸水，然后加入 End Prep 反应混合物和 End Prep 酶混合物。通过移液混合试管中的内容物，然后将样品在 20 摄氏度下孵育 30 分钟。接下来，如前所述，用高盐洗涤缓冲液、氯化锂洗涤缓冲液和 10 毫摩尔 Tris 氯化氢缓冲液洗涤样品珠。
要进行索引接头连接，向样品中加入 27 μL 冷的 10 毫摩尔 Tris 氯化氢缓冲液。然后添加索引接头、连接增强子和连接酶预混液。将样品在 20 摄氏度下孵育 15 分钟。
同样，用高盐洗涤缓冲液、氯化锂洗涤缓冲液和 10 毫摩尔 Tris 氯化氢缓冲液洗涤样品珠。然后向样品中加入 47 微升冷的 10 毫摩尔 Tris 氯化氢缓冲液。为了修复 DNA 中因磷酸二酯键缺失而导致的缺口，向样品中加入 11.1 μL 填充混合物。
将样品在 30 摄氏度下孵育 20 分钟。经过一系列洗涤后，向样品中加入 50 μL 冷高压灭菌双蒸水。要在 5 个引物到 3 个引物方向消化 ChIP DNA，添加 lambda 核酸外切酶缓冲液和 lambda 核酸外切酶，并通过移液混合样品。
将样品在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。消化完成后，最后一次重复三次洗涤。要从磁珠中洗脱 ChIP 样品，将样品重悬于 75 μL ChIP 洗脱缓冲液中，并在 65 摄氏度下以 130 倍 G 培养 15 分钟，向样品中添加 2.5 μL 20 mg/mL 蛋白酶 K。
短暂涡旋样品，然后在 65 摄氏度下孵育过夜。短暂旋转样品并放在磁力架上。1 分钟后，将上清液转移至新的 1.5 mL 试管中。
纯化和洗脱 DNA。纯化洗脱的 DNA 后，将 16 μL 提取的 DNA 样品转移到 PCR 管中。向样品中加入 1.2 微升变性和引物退火混合物。
使用手稿表 6 中描述的程序，将引物变性并退火到模板 DNA 上。向样品中加入 3 微升引物延伸混合物，并运行手稿表 7 中描述的 PCR 程序。向样品中加入 4.1 微升 DA 尾随混合物，并使用手稿表 8 中的 PCR 程序运行样品。
然后向样品中加入 21.5 μL 通用接头连接混合物，并在 20 摄氏度下孵育 15 分钟。向样品中加入 29 微升 LM-PCR 混合物，然后使用手稿表 10 中的程序运行样品。在 18 个 LM-PCR 循环后，在 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳来自小鼠运动神经元的 ChIP-exo 样品。
ChIP-exo Islet-1 的结果显示扩增的 DNA 文库约为 200 至 400 个碱基对，表明 ChIP-exo 文库已成功通过 LM-PCR 扩增。大约 100 个碱基对的条带代表来自接头和 PCR 引物的伪影。无抗体对照表明，非特异性背景 DNA 被 lambda 核酸外切酶处理消化。
使用 ChIP-exo 和 ChIP-seq 确定了 Islet-1 结合位置。ChIP-exo 信号高度集中在 Islet-1 结合位点，检测多个成簇的 Islet-1 转录因子结合模式。ChIP-seq 信号显示更广泛的信号，表明 ChIP-exo 比 Islet-1 的 ChIP-seq 具有更高的定位分辨率。
多种转录因子通常以蛋白质-DNA 复合物的形式彼此相邻地结合 DNA。ChIP-exo 使我们能够研究多种转录因子如何识别和调节靶 DNA。
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概览
本研究提出了一种基因组映射方法，该方法提高了哺乳动物神经元中蛋白质-DNA相互作用的分辨率。通过利用染色质免疫沉淀DNA并经过外切核酸酶消化处理后的高通量测序，该方法实现了接近碱基对的映射分辨率。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 基因组学
- 基因调控
背景
- 了解蛋白质-DNA相互作用对基因调控至关重要。
- 传统方法在映射分辨率方面存在局限性。
- ChIP-exo提供了更好的检测能力。
- 该方法在研究哺乳动物神经元方面特别有用。
研究目的
- 提高蛋白质-DNA相互作用映射的分辨率。
- 提供一种可靠的基因组映射方法。
- 增强对基因调控机制的理解。
使用的方法
- 染色质免疫沉淀后的外切核酸酶消化。
- 用于数据获取的高通量测序。
- 为ChIP准备蛋白质G磁性磁珠。
- 混合和阻断溶液以实现最佳结合。
主要结果
- 在映射中实现了接近碱基对的分辨率。
- 结果展示了高信噪比。
- 在哺乳动物神经元背景下验证了该方法。
- 提供了对蛋白质-DNA相互作用的洞见。
结论
- ChIP-exo方法显著提高了映射分辨率。
- 该技术有助于研究基因调控。
- 未来的应用可能增强我们对神经元功能的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-resolution mapping of protein-DNA interactions enables precise target validation in early discovery by clarifying transcription factor binding sites with near base-pair accuracy. This reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies and supports predictive confidence in lead identification for neurological disease models. The method enhances de-risking of therapeutic hypotheses by distinguishing specific from non-specific genomic signals.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulatory mechanisms in disease-relevant neuronal systems.
- Operational Value: Provides high-sensitivity detection of protein-DNA binding with reduced background noise.
- Predictive Value: Supports functional target validation by mapping clustered transcription factor binding patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, high-resolution binding profiles for assay standardization.
- Operational Value: Produces reproducible DNA libraries suitable for downstream sequencing workflows.
- Scalability Value: Enables platform reuse across multiple transcription factors in neuronal models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links discovery-stage binding data to disease-relevant gene regulation in stem cell-derived neurons.
- Operational Value: Ensures continuity from target identification to preclinical validation via consistent genomic readouts.
- Risk Mitigation: Supports de-risking of mechanistic models by eliminating false-positive binding signals.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by delivering precise genomic binding data that informs target selection and prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through high-resolution mapping of transcription factor occupancy.
- Screening: Enables assay readiness via standardized, exonuclease-digested DNA libraries with uniform fragment sizes.
- Analytics: Delivers quantitative binding signals that allow comparison of protein-DNA interactions across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating binding sites in disease-relevant neuronal systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable genomic mapping capability for multiple targets in neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through near base-pair mapping resolution.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled exonuclease digestion and library preparation.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing false positives in binding site identification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on high-confidence genomic binding data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin immunoprecipitation and enzymatic DNA processing.
- Dependent on access to magnetic bead handling, exonuclease enzymes, and high-throughput sequencing.
- Needs cross-team standardization for antibody validation and wash stringency.
- Adaptation considerations include optimization for different transcription factors and neuronal subtypes.
- Practical limitations include input DNA quality and antibody specificity affecting signal clarity.
