从大鼠心脏心室游离壁分离心内膜和冠状动脉内皮细胞

本文介绍了一种从心脏中分别分离心内膜细胞和冠状动脉内皮细胞的详细方案，以帮助人们理解不同类型细胞的特异性基因表达与功能。该方法的主要优势在于所分离的 EEC 和 CECs 具有高纯度和高活性，且细胞在分离后仍能保持其生理特性。CECs 与 EECs 在多个方面存在差异，因此能够独立研究这些细胞群体，有助于探索不同类型细胞在各种心脏疾病中的特异性机制。

该方法可促进以细胞类型特异性的方式研究多种心脏疾病的转录组学和表观遗传学因素。该方法中最关键的步骤是确定不同的心脏部位，并准确把握消化时间，以避免细胞类型污染。本实验操作将由我实验室的研究科学家Yifei Miao进行演示。

从六只体重50至100克的Sprague Dawley大鼠中取出心脏后，用50毫升冷的HBSS溶液清洗器官三次，以去除多余血液，并将其中一颗心脏置于解剖显微镜下。将心脏平放在较平坦的后侧面上，以辨认组织的左侧和右侧，并定位肺动脉。使用剪刀沿肺动脉剪开，直至右心室腔，然后沿室间隔剪开，直至心尖。

从心尖开始，沿室间隔沿心脏后侧向上继续剪切，直至到达肺动脉与右心室腔的连接处。从该点开始，分别垂直于之前的解剖切口，向远离室间隔的方向剪开心脏的前侧和后侧，直至将右心室游离壁从心脏其余部分完全分离。随后，将右心室游离壁放入含有5毫升DMEM的离心管中，并重新定位主动脉，以同样方式便于采集左心室游离壁。

当所有心室游离壁采集完毕后，将组织样本转移至60厘米的培养皿中，使其内表面朝下贴附于皿底。使用1毫升移液枪头，向组织块正下方直接加入0.5至1毫升消化缓冲液，直至仅组织的内表面被浸没。为避免不必要的细胞污染，必须确保仅有心室的内表面接触消化缓冲液，并且消化时间严格控制为5分钟。

在细胞培养孵育箱中孵育5分钟后，加入五倍体积的内皮细胞培养基以终止消化。然后使用1毫升移液器用新鲜培养基冲洗每个心室的内表面，并将流出液经40 µm细胞过滤器收集至冰上预冷的50 mL收集管中。进行冠状动脉内皮细胞消化时，沿左心室外表面进行切割，避免内层组织污染，并将每段组织碎片放入分别含有1 mL消化缓冲液的5 mL离心管中。

为避免来自 EECs 的污染，应仅从心室的外表面进行切割。使用解剖剪将心室壁切成约一立方毫米的小块，并将试管置于 37°C 水浴中消化 15 至 20 分钟，每 2 至 3 分钟涡旋振荡一次。当组织块已切碎但仍可见时，向试管中加入 4 毫升内皮细胞培养基，用 5 毫升移液管将全部液体通过 40 微米滤网转移至置于冰上的 50 毫升收集管中。

消化后，通过离心沉淀细胞并吸除上清液，以分离CD31阳性细胞群体。若沉淀呈红色，则每管加入一至二毫升红细胞裂解缓冲液，于37摄氏度水浴中孵育五分钟。孵育结束后，加入10毫升PBS终止裂解，并通过第二次离心收集细胞。

接下来，向每管细胞中加入 90 微升分选缓冲液和 10 微升抗 CD31 PE 抗体。涡旋混匀后，在 4 摄氏度孵育细胞 10 分钟。孵育结束后，向各管中加入 10 毫升分选缓冲液，充分混匀后通过离心收集细胞。

每管中加入 80 微升分选缓冲液重悬沉淀，随后加入 20 微升抗 PE 微珠。涡旋混匀后，将试管置于 4 摄氏度环境中孵育 15 分钟，然后如前所述通过离心用 10 毫升分选缓冲液洗涤。将沉淀在冰上用 500 微升分选缓冲液重悬，并将含有超顺磁性微球的分选柱放入磁力分选器中。

用三毫升分选缓冲液冲洗层析柱。当液体流尽后，向层析柱中加入500微升心内膜内皮细胞悬液，随后每次用三毫升分选缓冲液洗涤，共洗涤四次。最后一次洗涤后，将层析柱转移至一个新的15毫升收集管中，使用柱塞和五毫升新鲜内皮细胞培养基将CD31阳性细胞从层析柱中冲洗出来，收集至收集管中。

然后通过离心收集珠子分离的内皮细胞。正如预期，定量PCR结果显示，与β-actin相比，心内膜内皮细胞表达的Npr3、Hapln1和Cdn11等心内膜标志物水平高于冠状血管内皮细胞。同样，冠状血管内皮细胞表达的Fabp4、Mgll和Cd36等冠状血管标志物水平也高于心内膜内皮细胞。

此外，这两类细胞均表达泛内皮细胞标志基因 Cdh5，其中冠状动脉内皮细胞中的表达水平略高。我们可进一步利用流式细胞分选（FACS）及针对特定细胞群的抗体对细胞进行纯化。例如，可使用抗 Npr3 抗体分选 EECs，抗 Cd36 抗体分选 CECs。

该技术为研究人员以细胞类型特异性的方式探索肠内分泌细胞（EEC）和心内皮细胞（CECs）在心脏发育与疾病中的作用奠定了基础。