利用实时细胞分析监测流感病毒在宿主外的存活情况

多种颗粒定量方法是大多数生物学研究中的关键环节。本方案可实现对病毒数据的实时精确定量，该技术取代了传统的病毒数据测量方法。

根据客观的实时数据，我们的结果低于置信区间，从而避免了对劳动密集型终点指标的评估。该方法可用于所有能引起细胞病变效应的病毒。本次实验操作将由本实验室的技术员 Quentin Grassin 进行演示。

为了扩增H1N1病毒，根据标准操作规程，将7.5 × 10⁶个MDCK细胞接种至两个75平方厘米的组织培养瓶中，并在37°C下培养24小时，使细胞达到90%至100%汇合度。次日，每瓶用5毫升无菌PBS洗涤两次，每次洗涤使用5毫升PBS，并将其中一瓶标记为对照组。随后，在含有新鲜病毒扩增培养基的1.5毫升离心管中，将一管解冻的甲型流感病毒原液稀释至适当的实验浓度。

取1毫升稀释后的病毒原液，以感染复数为每细胞1×10⁻³或1×10⁻⁴斑形成单位（plaque-forming units）的剂量接种MDCK细胞，并向对照组培养瓶中加入1毫升病毒增殖培养基。在室温下吸附病毒45分钟，期间每15分钟轻轻搅拌一次。孵育结束后，吸除接种液，更换为15毫升含有1 µg/mL TPCK胰蛋白酶的病毒增殖培养基，以促进病毒血凝素HA0裂解为HA1和HA2亚基。

然后将烧瓶置于35°C培养箱中培养三天。培养结束后，在光学显微镜下使用40倍物镜比较各培养物中的细胞，以评估细胞的病变效应。当细胞病变效应完全时，将细胞培养上清液加入15毫米离心管中，并通过离心收集各培养物的细胞碎片。

然后，将澄清的病毒培养上清液转移至15毫升离心管中，并将子代病毒分装至一次性无菌冻存管中，于-80摄氏度保存。为确定细胞感染所需的合适细胞数量，制备培养24小时、约80%汇合度的MDCK细胞培养物，用PBS洗涤细胞后，每瓶加入3毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA，在37摄氏度孵育45分钟以收获细胞。待细胞脱落时，每瓶加入7毫升新鲜培养基终止反应，并对每份培养物的细胞进行计数。

将细胞稀释至每毫升细胞培养基含4 × 10⁵个细胞，并按所示进行细胞的两倍系列稀释。在向E-板的每个孔中加入100 µL细胞培养基之前，先将E-板置于室温下数分钟，注意勿触碰E-板的电极。解锁支架，将板的前端插入阻抗测量仪的支架槽中。

关闭培养箱门并打开软件。在默认实验模式设置中，选中所需的摇篮位，然后双击顶部页面以输入实验名称。单击布局，并为所选培养板的每个孔输入必要的样品信息。

单击“计划”、“步骤”和“添加步骤”。软件将自动添加一个持续一秒的步骤，用于测量背景阻抗。单击“执行”和“开始”，然后“继续”。单击“绘图”并选择“添加”，以选择适当的孔，确认背景阻抗在 -0.1 至 0.1 之间后，再进入下一步。

接下来，从底座中取出培养板，以每孔100 µL将各细胞悬液分别加入相应孔中，每个样本设两个复孔。将E-板置于超净台中，室温下静置30分钟，使细胞均匀沉降到孔底，然后将E-板装入底座的插槽中。单击“计划”和“添加步骤”，设置每30分钟检测一次细胞，共重复200次，然后选择“开始”和“继续”。

为了检查并绘制细胞阻抗数据，点击“绘图”并选择接种后24小时、即将进入平台期之前的细胞浓度，以确保在病毒感染时细胞仍处于生长期。为了确定CIT50值与感染复数之间的相关性，在将3 × 10⁴个新分裂的MDCK细胞接种至电子微孔板的每个孔中并培养24小时后，每孔每次用100 µL新鲜病毒扩增培养基洗涤细胞两次，然后使用单通道移液器向每孔加入100 µL病毒悬液。当所有病毒稀释液均添加完毕后，轻柔地将微孔板放入仪器35 °C的孵育槽中，并按照演示方法，每15分钟监测一次细胞阻抗，持续至少100小时。

完成两轮测量后，单击暂停仪器，从支架中取出E-plate。向每个孔中加入100 µL含有TPCK胰蛋白酶的病毒增殖培养基，然后将E-plate放回支架插槽中。随后，开始分析。

为评估甲型流感病毒的存活动力学，将氯化钠加入蒸馏水中，使其终浓度为每升35克，然后向2毫升冻存管中加入900微升上述盐溶液。每管中加入100微升病毒原液，并将冻存管置于35°C培养箱中，孵育适当的实验时间。在孵育结束前一天，以每孔100微升病毒增殖培养基和3 × 10⁴个 freshly split MDCK细胞的条件，在16孔微孔板中重复接种，以便测量背景阻抗并使细胞均匀分布于各孔底部。

然后在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养细胞24小时。次日，用新鲜培养基将生理盐水稀释10倍的病毒液按100微升接种至细胞中，洗涤细胞两次后进行感染，并至少连续监测100小时，每15分钟记录一次细胞阻抗。此处显示的是使用不同浓度MDCK细胞在120小时后获得的原始数据。

24小时后，细胞指数测量结果显示，接种了3×10⁴个细胞的孔中细胞仍处于对数生长期，因此后续实验采用该细胞浓度。MDCK细胞培养物中，CIT50与流感病毒的初始感染复数之间表现出明显的线性关系。典型的存活动力学实验结果表明，由于病毒引起的细胞病变效应，细胞指数下降。

可通过 CIT50 计算每种病毒在每种条件下的灭活斜率，以确定哪种病毒在所研究的环境中具有最高的稳定性。病毒的稳定性与灭活斜率呈间接相关，从而能够识别出例如流感病毒A血凝素糖蛋白中参与病毒在宿主外存活的氨基酸残基。该技术对微小变化极为敏感。

因此，建议使用自动细胞计数器，以确保不同实验之间获得可重复的结果。该方法还可用于比较不同病毒的复制能力，同时研究病毒对多种细胞系的嗜性，或分析病毒生命周期中的特定步骤。