蠕虫对齐和Worm_CP，两个开源管道，用于从卡诺哈布迪蒂斯精英获得的荧光图像数据的直化 和定量

我们在这里描述一个简单的开源基于斐济的工作流，名为 Worm-align，它可用于从原始显微镜图像生成单通道或多通道的拉直蠕虫。由于此工作流依赖于感兴趣的用户选择的动物，因此在分析来自 C.elegans 的图像时，它特别有用，因为蠕虫并非全部处于正确的阶段或条件。应当指出，Worm-align 的输出可用于随后使用斐济或其他图像分析软件对荧光进行定量。

在这里，我们演示使用 CellProfiler 管道 Worm_CP 的荧光定量。 首先，在 Bunsen 燃烧器的火焰中伸出一个薄玻璃毛细管，创建口腔微管。在火焰中延伸后，如果毛细管在延伸后没有分解成两块，则将毛细管分成两块。

如果它分成两块，切出最长的一个。选择较长的片断，通过尝试吸水来测试毛细管是否打开。将适配器从三毫米硅胶管上拆下。

将玻璃毛细管插入连接到六毫米硅胶管的毛细管适配器中。然后将六毫米管的另一端插入 0.2 微米过滤器，将另一端插入 3 毫米硅胶管。将一毫米滤波尖插入三毫米硅胶管的自由端以吸液体。

在解剖显微镜下，用口腔微管去除固定蠕虫颗粒周围的液体。快速向管底部添加 10 微升安装介质。用洗涤剂的痕迹冲洗 PBS 中的 10 微升尖端，以防止蠕虫粘在塑料移液器尖端的两侧。

然后用一把剪刀切开尖端的一端。将八个微升安装介质与蠕虫转移到先前准备的 agarose 垫上。在显微镜下观察幻灯片时，轻轻搅拌它，以避免蠕虫重叠。

然后用 18 由 18 毫米的盖玻片盖住 agarose 垫上的安装介质。为了安装活蠕虫，移液器三到四微升三毫摩尔莱瓦米索溶解在M9的阿加罗斯垫上。每个情况选择 30 到 50 个蠕虫到莱瓦米索的掉落中。

然后用18由18毫米的盖玻片盖住掉落，并在一小时内对蠕虫进行成像。从 ImageJ 安装开源图像分析软件包斐济，或者如果已在计算机上安装，请验证它是 1.52A 或更晚版本，然后从 GitHub 下载 Worm 对齐存储库并保存在计算机上。下载并安装所有管道组件后，打开斐济，通过单击插件、宏并在主菜单栏中运行来执行 Worm 对齐宏。

找到蠕虫对齐。ijm 脚本并单击打开。导航到要分析的图像的输入文件夹，然后单击"选择"，确保所选文件夹仅包含图像文件。

宏将自动生成一个输出文件夹，其中将保存所有结果。文件夹的名称将与输出为修复后输出的输入文件夹相同。允许宏打开输入文件夹中的第一个图像，并使用它作为代表性图像来提取生成蒙太奇所需的设置，包括蠕虫的宽度、亮度和对比度。

使用直线绘图工具，在蠕虫的宽度上绘制一条线，然后单击"确定"。使用此线的长度确定单个蠕虫的裁剪区域的高度。对于每个通道，指定名称、查找表以及是否应包含在蒙太奇中，然后单击"确定"。接下来，使用滑块调整通道的亮度和对比度设置。对其余通道重复此过程。

配置所有设置后，这些设置将被记录在设置表中并保存到输出文件夹的 CellProfiler 子文件夹。将生成一个图像，以显示应用设置后所有图像的外观。如果图像令人满意，勾选顶部框。

选中"所有设置"面板的第二个和第三个框指定蒙太奇生成选项。保持两个框勾选，然后单击"确定"以执行宏的其余部分。如果勾选顶部框，将导致宏重新运行设置。

然后，宏继续打开输入文件夹中的所有图像。对于每个图像，使用分段或徒手线工具，在蒙太奇中包含的所有蠕虫的纵向轴上绘制线条。沿着蠕虫的全长绘制一致从头到尾的线条，然后单击 Control T 将每一行添加到 ROI 管理器中。然后，蠕虫对齐将生成单个选定蠕虫的裁剪图像，这些图像将保存在输出文件夹的单个蠕虫子文件夹中。

所选所有蠕虫的蒙太奇将保存在对齐的文件夹中。通过单击下载页面上以前 CellProfiler 版本的链接并选择所需的操作系统，下载并安装 CellProfiler 2.2.0。在启动Worm_CP之前，请确保所有预期的输出图像都存在于 Worm 对齐输出文件夹的 CellProfiler 子文件夹中。

原始图像的已处理副本、蠕虫总体的二进制图像掩码、对齐蒙版（如果线在选定的蠕虫上绘制）和一个表示原始图像中每个通道的图像应存在。打开 CellProfiler，然后单击图像输入模块，然后将 CellProfiler 模块文件夹拖到显示在此放置文件和文件夹的窗口中。如果上一分析中存在图像列表，请首先通过在窗口中右键单击并选择清除文件列表来删除这些图像。

单击元数据输入模块和第二个提取方法，单击黄色文件夹并导航到 Worm 对齐输出文件夹的 CellProfiler 子文件夹。选择设置文件，然后单击更新。接下来，单击输入模块的名称和类型，并确保管道所需的所有图像都存在。

在运行管道之前，在输出模块中选择输出结果的目标。使用测试模式通过单击启动测试模式查看管道的性能，并允许它通过文件夹中的第一个图像运行。当对管道的性能感到满意时，单击退出测试模式并分析图像。

在开始分析之前，请确保分析模块前面的所有眼睛都闭着。分析完成后，打开由两 Worm_CP个 CSV 文件、蠕虫 CSV 和行 CSV 组成的输出文件夹。根据本协议中描述的方法进行培养和成像 C.elegans 可生成蠕虫群的大型概览图像。

管道的输出在很大程度上取决于在图像顶部绘制的线条的质量。此处显示了几个行示例及其来自 Worm 对齐的输出。使用 Worm 对齐脚本时，可从数据子文件夹中的叠加图像以及蒙太奇中单个蠕虫的面板中直观地识别相交蠕虫。

QC 表还可用于识别重叠的蠕虫。但是，相交线对于管道Worm_CP问题。这是因为用户Worm_CP线掩码，而不是感兴趣的区域，以帮助识别单个蠕虫。

因此，CellProfiler 将其中一个蠕虫分段为两个对象。这种Worm_CP用于量化固定动物的荧光强度，这些动物标有荧光染料，并附在脂滴中。使用手动定量的野生类型和突变DBL1动物之间的脂质液滴含量降低17%，使用管道的Worm_CP 12%。

Worm_CP还用于量化活蠕虫的热休克反应，在热冲击可吸收基因的控制之下表达GP。在没有热应力的情况下，蠕虫没有诱导GP表达。当蠕虫暴露为短热冲击时，GFP表达被诱导。

其Worm_CP在很大程度上取决于使用 Worm 对齐绘制的线条的质量。确保线条没有接触或重叠，并在同一方向绘制所有线条。检查 QC 表可以帮助您识别接触或重叠的线，以便从分析中排除这些情况。

Worm 对齐的输出可用于斐济或其他图像分析软件包的后续定量。我们在这里展示了一个非常基本的 CellProfiler 管道，其中可以非常轻松地将其他分析模块合并到其中，例如，计算脂质液滴的数量或量化蠕虫中单个液滴的强度。这种技术的优点之一是有可能快速量化单个蠕虫的荧光。

在我们的实验室中，我们有兴趣使用荧光报告来保持个体生存能力，并且我们经常使用蠕虫Worm_CP和蠕虫分析。