Name: 使用 卡诺哈布迪炎埃莱甘斯 筛选组织特异性查佩龙相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 了解如何使用合成相互作用筛选和RNA干扰技术，在秀丽隐杆线虫中识别组织特异性分子伴侣相互作用，从而揭示蛋白质功能异常在不同组织中的变化规律。

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我们感谢由美国国立卫生研究院（NIH）研究资源国家中心（NCRR）资助的秀丽隐杆线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center）提供部分线虫品系。由H.F. Epstein研发的单克隆抗体购自发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank），该库在国立儿童健康与人类发展研究所（NICHD）的指导下建立，并由爱荷华大学（University of Iowa）生物学系负责维护。本研究得到了以色列科学基金会（grant No. 278/18）以及以色列科学部资助项目的资助。 &amp;#38; 技术部以及意大利共和国外交与国际合作部国家推广总局（项目编号：3-14337）提供资助。感谢Ben-Zvi实验室成员在本手稿准备过程中提供的帮助。

1. RNAi 用线虫生长培养基平板的制备
<ol>
	<li>在1 L的瓶子中加入3 g NaCl、2.5 g Bacto-Peptone、17 g琼脂，并加入蒸馏水至1 L，然后进行高压灭菌。</li>
	<li>将瓶子冷却至55 °C。</li>
	<li>加入25 mL 1 M KH2PO4（pH 6.0）、1 mL 1 M CaCl2、1 mL 1 M MgSO4和1 mL胆固醇溶液（表1），配制成线虫生长培养基（NGM）。</li>
	<li>加入1 mL氨苄青霉素（100 mg/mL）和0.5 mL 1 M IPTG（表1），制成NGM-RNAi溶液。 
	注意：常用的HT115(DE3) E. coli细菌含有IPTG可诱导的T7 DNA聚合酶，用于表达编码双链RNA的质粒。这些质粒同时编码氨苄青霉素抗性。</li>
	<li>通过轻轻旋转瓶子使温热的溶液混合均匀。</li>
	<li>在生物安全柜中或无菌操作条件下，将NGM溶液倒入培养板中，或使用蠕动泵将溶液分配至培养板中。本实验可使用6孔、12孔、40 mm或60 mm的培养板。琼脂应填充约2/3的板深。</li>
	<li>将培养板在室温下置于实验台上过夜晾干，期间保持盖子盖好。用于RNAi的NGM平板可在4 °C保存长达一个月。</li>
</ol>
2. 培养RNAi细菌并接种平板
<ol>
	<li>在通风橱内或采用无菌操作，向预先高压灭菌的1 L LB溶液中加入1 mL氨苄青霉素（100 mg/mL）和2.5 mL四环素（5 mg/mL）（表1），混匀。 
	注意：常用的HT115(DE3) E. coli细菌具有四环素抗性。</li>
	<li>在通风橱内或采用无菌操作，使用多通道移液器将600 µL LB溶液加入2 mL深孔96孔无菌板的每个孔中。建议使用多通道移液器分配培养基。</li>
	<li>采用无菌操作，将含有靶向目的基因的dsRNA编码质粒或空质粒（作为对照）的HT115(DE3) E. coli细菌接种至各孔中。盖好板盖，在37 °C下过夜培养。已有研究构建了包含表达dsRNA的细菌克隆的文库，覆盖约94%预测的C. elegans基因22,23，目前可商业获取。本实验所用的分子伴侣文库由Richard Morimoto博士实验室构建26。</li>
	<li>采用无菌操作，分别将75 µL、150 µL或250 µL细菌接种至12孔（40 mm）和6孔（60 mm）NGM RNAi平板上。在平板上清晰标记目标基因名称。细菌应覆盖琼脂表面的30–50%，且不应接触平板边缘。</li>
	<li>将平板在室温下置于实验台上静置干燥至少2天，期间保持平板加盖。 
	注意：平板可在37 °C下过夜培养。使用或储存前需确保内侧孔已完全干燥。所有长期操作（如干燥或储存）均应将平板避光保存。接种后干燥的平板可在4 °C下保存长达一个月。</li>
</ol>
3. 胚胎的非应激同步化
<ol>
	<li>使用线虫挑针将约100个卵从非同步化的线虫培养板转移至新接种的NGM平板。</li>
	<li>在15 °C下培养5天，或在20 °C下培养3.5天，或在25 °C下培养2.5天。动物应达到产卵的第一天。 
	注意：线虫通常在20 °C下培养。然而，不同的分子伴侣突变株可能需要特定的培养温度。例如，许多温度敏感型菌株在15 °C下培养，但需转移到25 °C以显现其表型。</li>
	<li>缓慢加入1 mL M9缓冲液（表1），注意远离细菌菌苔。旋转平板使缓冲液完全覆盖整个表面，然后将平板倾斜至一侧，吸出液体并将线虫从平板上冲洗下来。 
	注意：当使用温度敏感型线虫或分子伴侣突变体时，最好将本方案中使用的缓冲液保持在线虫培养温度下。</li>
	<li>重复步骤3.3三次，或直至所有线虫均被冲洗离平板。</li>
	<li>使用标准塑料枪头，从冲洗后的平板上切取一块含有集中卵的琼脂块，并将该琼脂块放置于新接种的NGM平板上。 
	注意：约需200个卵才能获得足够的产卵期动物；动物过多会过快消耗细菌。食物水平过低可能影响蛋白质稳态27。</li>
	<li>在15 °C下培养5天，或在20 °C下培养3.5天，或在25 °C下培养2.5天。此时，平板上应布满同步化的卵。 
	注意：为实现更严格的同步化，可将动物短暂转移至新平板。但必须仅使用处于产卵早期的成虫，因为动物可能在子宫中滞留卵，从而影响同步化效果。</li>
	<li>缓慢加入1 mL M9缓冲液，注意远离细菌菌苔。</li>
	<li>旋转平板使缓冲液完全覆盖整个表面，然后将平板倾斜至一侧，吸出液体并将线虫从平板上冲洗下来。</li>
	<li>重复步骤3.7三次，或直至所有线虫均被冲洗离平板。</li>
	<li>加入1 mL M9缓冲液，并使用细胞刮棒将卵从平板上刮下。</li>
	<li>收集含有卵的M9缓冲液。</li>
	<li>将含有卵的M9缓冲液在3,000 x g下离心2分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入M9缓冲液至总体积为1 mL。</li>
	<li>重悬卵液，以打散任何成团的卵和细菌。</li>
	<li>重复步骤3.11–3.13所述的洗涤程序五次。卵沉淀应呈白色。若仍为黄色或棕色，则继续洗涤直至沉淀变为白色。 
	注意：残留在卵上的细菌可能会污染表达dsRNA的细菌。</li>
	<li>弃去大部分上清液，保留约200 µL。同步化的卵可用于RNAi筛选。</li>
</ol>
4. 常见的表型检测方法
<ol>
	<li>实验期间的动物培养
	<ol>
		<li>在每个接种了RNAi细菌的平板上，靠近细菌菌苔处放置约30个卵。作为对照，也在接种了含空载体（L4440）细菌的平板上放置约30个卵。</li>
		<li>将年龄同步化的动物培养在接种了RNAi的NGM平板上。实验持续时间取决于需要观察的发育阶段以及培养温度。使用温度敏感型突变体动物时，应调整培养温度；使用发育延迟突变体动物时，应调整培养时长。 
		注：尽管时间可能有所变化，但一旦动物进入成虫期，产卵行为（及其导致的食物快速消耗）以及与年龄相关的蛋白质稳态崩溃28可能会影响实验结果。因此建议在产卵开始前（成虫第1天）进行表型评分。野生型动物在15 °C下培养4.5天、20 °C下3天或25 °C下2天即可达到此阶段。</li>
		<li>重复实验的次数取决于所检测基因集合的大小。对于分子伴侣文库（97个基因），至少重复四次实验。种群数量取决于所用检测方法。在本文讨论的行为学实验中，每次重复中每种实验条件下应评分&#62;15只动物。数据及统计分析也强烈依赖于所用检测类型。本文所述实验中的数据可表示为均值 ± 标准误（SEM）。</li>
		<li>将RNAi处理组与空载体对照组动物作为独立群体进行比较。根据所考察的变化类型（仅加重、仅缓解或两者兼有），可采用单因素或双因素方差分析（ANOVA）计算P值。当仅比较单一RNAi处理组与对照组时，可采用单因素或双因素Mann-Whitney秩和检验计算P值。除统计学显著性外，还应根据对表型影响的程度设定筛选阳性结果的阈值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>发育停滞/延迟
	<ol>
		<li>按照步骤4.1的方法培养年龄同步化的动物，直至在含空载体对照细菌上生长的动物达到成虫期但尚未开始产卵。</li>
		<li>使用体视显微镜观察动物，并统计幼虫和成虫的数量，以计算发育延迟动物的百分比。作为参照，可与在含空载体对照细菌上培养的突变体动物进行比较。hsp-1 或 hsp-90 RNAi处理会导致野生型动物发育停滞，可用作阳性对照。</li>
		<li>为随时间评估发育延迟动物的比例，重复步骤4.2.2。 
		注：若平板上出现正在产卵的成虫，应将发育延迟的动物转移至新标记的NGM-RNAi平板（对应相同靶基因），以避免与后代混淆。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>不育或产卵缺陷
	<ol>
		<li>按照步骤4.1的方法培养年龄同步化的动物，直至在含空载体对照细菌上生长的动物开始产卵。</li>
		<li>使用体视显微镜观察动物，并评分子宫内无可见卵的动物所占百分比。作为参照，可与在含空载体对照细菌上培养的突变体动物进行比较。</li>
		<li>或者，使用体视显微镜观察动物，并评分子宫内充满卵的动物所占百分比，此类表型定义为产卵缺陷（Egl-d）表型29。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎致死
	<ol>
		<li>按照步骤4.1的方法培养年龄同步化的动物，直至动物开始产卵。</li>
		<li>将约100个卵转移至一个无菌平板上。将卵排成行以便计数。</li>
		<li>在24–48小时后统计平板上未孵化卵的百分比。作为参照，可与经空载体对照细菌处理的动物所产卵进行比较。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>麻痹检测
	<ol>
		<li>对于第1天成虫，按照步骤4.1的方法培养年龄同步化的动物，直至在含空载体对照细菌上生长的动物达到成虫期但尚未开始产卵。</li>
		<li>使用细头记号笔在普通NGM琼脂平板背面画一条直线。</li>
		<li>将5–10只动物放置在标记线上。</li>
		<li>设置计时器，等待10分钟。</li>
		<li>统计仍停留在直线上的动物百分比，记为麻痹线虫。作为参照，可与在含空载体对照细菌上培养的突变体动物进行比较。经unc-45 RNAi处理的野生型动物表现出严重麻痹表型，可用作阳性对照。 
		注：该检测主要识别表现出中度至重度麻痹的动物。这类动物通常平直地躺在平板上，而非呈现常见的弯曲形态。此外，麻痹线虫头部周围可见明显的无菌区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>摆动检测
	<ol>
		<li>按照步骤4.1的方法培养年龄同步化的动物，直至在含空载体对照细菌上生长的动物达到成虫期但尚未开始产卵。</li>
		<li>将100 µL M9缓冲液（预温至动物培养温度）加入96孔板中。</li>
		<li>将约15条线虫分别放入含有M9缓冲液的各个孔中，每孔一条。</li>
		<li>让动物适应5分钟。</li>
		<li>在体视显微镜下观察每条动物，启动15秒倒计时，记录该时间段内每条动物的身体弯曲次数。可将计数值标准化为每分钟身体弯曲次数。作为参照，可与在含空载体对照细菌上培养的突变体动物进行比较。 
		注：该运动能力检测非常敏感，能够检测出不同处理间的轻微差异。然而，液体中的运动能力与琼脂表面的运动能力可能存在差异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 蛋白质敲低的验证
<ol>
	<li>将250–300个同步化的卵放置于接种了表达相应dsRNA或空载体（L4440）细菌的60 mm NGM-RNAi平板上。 
	注意：RNAi敲低可能导致胚胎异常积聚、胚胎缺失或发育停滞，从而影响基因表达。在确定待检测动物的年龄时应考虑这些因素。</li>
	<li>对于第1天成虫，在15 °C下培养4.5天，或在20 °C下培养3天，或在25 °C下培养2天。</li>
	<li>挑取并转移总共200只年轻成虫至装有200 µL PBS-T的1.5 mL离心管盖中。 
	注意：当使用温度敏感型动物或分子伴侣突变体时，最好将本方案中使用的缓冲液保持在动物培养温度下。</li>
	<li>小心盖上管盖，并在1,000 x g条件下离心1分钟。</li>
	<li>加入800 µL PBS-T（表1），并在1,000 x g条件下离心1分钟。</li>
	<li>小心移除上层900 µL液体。</li>
	<li>重复步骤5.4–5.6共三次。</li>
	<li>移除900 µL液体，保留含有200条线虫的100 µL溶液。</li>
	<li>加入25 µL 5x上样缓冲液（表1）。</li>
	<li>在92°C下振荡（1000 rpm）加热样品10分钟。样品随后可冷冻并保存于-20 °C。</li>
	<li>每份样品上样20 µL，在SDS-PAGE凝胶上电泳分离。</li>
	<li>使用适当的抗体进行Western印迹分析，以确定目标蛋白的相对稳定性。</li>
	<li>使用密度分析软件（如免费的ImageJ凝胶分析模块）测定条带强度，并将所有数值归一化至对照样品的测量值。 
	注意：在我们的筛选实验中，RNAi敲低的目的是降低特定分子伴侣或共伴侣蛋白的蛋白水平。因此，评估RNAi敲低效率的最佳方法是Western印迹分析，这需要特异性抗体。或者，也可使用qPCR定量mRNA水平。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

目前仍缺乏对蛋白质稳态网络的整体性认识，特别是其在不同多细胞动物细胞和组织中的组织方式与功能运作机制。为弥补这一不足，亟需获得有关该网络中各种组分（如分子伴侣）在发育和衰老过程中特定组织内相互作用的具体信息。本文展示了如何利用组织特异性扰动来研究特定组织中的伴侣蛋白网络。为探究组织特异性的伴侣蛋白遗传相互作用，我们考虑了三种不同的方法。第一种方法利用UNC-45（一种在肌肉细胞中高表达的伴侣蛋白），通过饲喂法RNAi筛选伴侣蛋白间的相互作用25。尽管使用特化的伴侣蛋白有助于揭示组织特异性，但它仅能反映其自身所参与的特定子网络的情况。需要注意的是，大多数 C. elegans 神经元对基于饲喂的RNAi递送具有抗性50，因此若采用此方法鉴定神经元细胞中的遗传相互作用，需将所研究的伴侣蛋白突变体与一种增强RNAi效应的品系进行杂交51。第二种方法是利用组织特异性启动子驱动伴侣蛋白在肌肉组织中的过表达，从而特异性地影响肌肉细胞的蛋白质折叠环境40<...

细胞通过质量控制机制来应对蛋白质损伤，这些机制能够修复、隔离或清除受损蛋白质1,2。蛋白质复合物的折叠和组装由分子伴侣支持，分子伴侣是一类高度保守且种类多样的蛋白质，能够修复或隔离受损蛋白质3,4,5,6,7。受损蛋白质的清除主要由泛素-蛋白酶体系统（UPS）8或自噬机制9介导，并在伴侣蛋白的协同作用下完成10,11,12。因此，蛋白质稳态（proteostasis）由包括折叠和降解机制在内的质量控制网络共同维持3,13。然而，理解体内蛋白质稳态网络中各组分之间相互作用仍是一个重大挑战。尽管蛋白质-蛋白质相互作用筛选提供了有关物理相互作用和伴侣蛋白复合物的重要信息14,15，但对体内组织特异性伴侣蛋白网络的结构及其补偿机制的理解仍然不足。
基因互作常被用作一种强有力的工具，用于研究参与相同或补偿性生物通路的一对基因之间的关系16,17,18。这类关系可通过组合成对的突变并量化一个基因中的突变对第二个基因突变所导致的表型严重程度的影响来测定16。尽管大多数此类组合在表型上并不表现出任何效应，但某些基因互作可使所测表型的严重程度加剧或缓解。当双基因缺失突变体的表型比单独缺失突变体组合预期的表型更为严重时，即观察到加剧性突变，这表明这两个基因在平行通路中发挥作用，共同影响某一特定功能。相反，当双基因缺失突变体的表型比单个缺失突变体的表型更轻微时，即观察到缓解性突变，提示这两个基因可能作为复合物共同作用或参与同一条通路16,18。因此，多种可量化的表型，包括广泛性表型（如致死性、生长速率和子代数量）以及特异性表型（如转录报告系统），已被用于鉴定基因互作。例如，Jonikas 等人利用内质网应激报告系统，通过成对基因缺失分析研究了Saccharomyces cerevisiae内质网未折叠蛋白反应蛋白稳态网络中的基因互作19。
基因互作筛选涉及系统性地将成对的基因缺失突变体进行杂交，以产生一套完整的双突变体20。然而，在动物模型中，特别是在 C. elegans 中，这种大规模的方法并不可行。取而代之的是，可通过RNA干扰（RNAi）技术下调基因表达，来检测突变品系的基因互作模式21。C. elegans 是开展基于RNAi筛选的强有力体系22,23。在 C. elegans 中，双链RNA（dsRNA）可通过细菌饲喂的方式递送，从而使dsRNA分子扩散至多种组织。通过这种方法，引入的dsRNA分子能够以一种快速且简便的流程影响整个生物体21。因此，利用RNAi文库进行基因互作筛选，可揭示下调一组基因或几乎全部 C. elegans 编码基因表达所产生的效应24。在此类筛选中，那些影响目标突变体行为但不影响野生型品系的阳性结果，可能是所监测表型的潜在修饰因子25。本文中，我们结合突变体与RNAi筛选方法，系统性地绘制 C. elegans 中分子伴侣在组织特异性上的相互作用图谱。

<table><tbody><tr><td>12孔板</td><td>SPL</td><td>BA3D16B</td><td></td></tr><tr><td>40 mm 培养皿</td><td>Greiner Bio-one</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>Greiner Bio-one</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>96孔 2 mL 128.0/85mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>780278</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Formedium</td><td>AGA03</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Formedium</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma</td><td>BO126-25G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>Qimaging</td><td>q30548</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Amresco</td><td>0433-250G</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>DM5500</td><td></td></tr><tr><td>滤器（0.22 &amp;micro;m）</td><td>Sigma</td><td>SCGPUO2RE</td><td></td></tr><tr><td>荧光体视显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ165FC</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Frutarom</td><td>2355519000024</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Formedium</td><td>367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Bio-Lab</td><td>001649029100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>22189-08-8</td><td>由Morimoto实验室馈赠</td></tr><tr><td>肌球蛋白MHC A（MYO-3）抗体</td><td>Hybridoma Bank</td><td>5-6</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>s-0751</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-Lab</td><td>001903029100</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Merck</td><td>61930705001730</td><td></td></tr><tr><td>平板倾注泵</td><td>Integra</td><td>does it p920</td><td></td></tr><tr><td>RNAi分子伴侣文库</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>VWR Life Science</td><td>0837-500</td><td></td></tr><tr><td>&amp;szlig;-巯基乙醇</td><td>Bio world</td><td>41300000-1</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>64-75-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Bio-Lab</td><td>002009239100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

利用 caenorhabditis elegans 筛选组织特异性分子伴侣相互作用

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

蛋白质及蛋白质复合物的正确折叠与组装对细胞功能至关重要。细胞通过质量控制通路来修复、隔离或清除受损蛋白质，以维持健康的蛋白质组，从而确保细胞内的蛋白质稳态，并防止进一步的蛋白质损伤。由于蛋白质稳态网络中存在功能冗余，在多细胞生物Caenorhabditis elegans中，通过基因敲低或突变编码分子伴侣的基因进行表型筛选时，大多数情况下仅能观察到微弱或无明显表型。我们开发了一种靶向筛选策略，用于鉴定特定功能所必需的分子伴侣，从而弥合表型与功能之间的鸿沟。具体而言，我们利用RNAi合成相互作用筛选来监测新的分子伴侣相互作用，即在携带编码分子伴侣基因突变或过表达特定分子伴侣的动物中，逐一敲低各个分子伴侣的表达。通过同时干扰两个单独情况下无显著表型的分子伴侣，我们能够发现当两者同时被扰动时会加剧或揭示特定表型的分子伴侣。我们证明，该方法可鉴定出共同作用的一组特定分子伴侣，它们协同调控与特定表型相关的蛋白质或蛋白质复合物的折叠过程。

利用 UNC-45 的温度敏感型突变，在许可或限制条件下分别筛选加重或缓解的遗传相互作用 
肌肉的组装与维持为研究组织特异性分子伴侣相互作用提供了一个有效的体系。收缩肌的功能单位——肌节，其结构蛋白和调控蛋白呈类晶体状排列。运动蛋白肌球蛋白的稳定性及其整合到收缩肌肌节的粗肌丝中，依赖于分子伴侣与泛素-蛋白酶体系统（UPS）组分的协同作用30。其中一个典型的分子伴侣是进化上保守且特化的肌球蛋白分子伴侣 UNC-45，其主要在体壁肌中表达31,32,33,34,35。研究表明，UNC-45 的突变可导致秀丽隐杆线虫（C. elegans）中肌球蛋白排列紊乱以及严重的运动缺陷<sup class="...

为了研究分子伴侣与分子伴侣之间以及分子伴侣与底物之间的相互作用，我们在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中进行合成相互作用筛选，利用RNA干扰结合分子伴侣的轻度突变或过表达，并在整体生物水平上监测组织特异性的蛋白质功能障碍。

利用 Caenorhabditis elegans 筛选组织特异性分子伴侣相互作用

蛋白质及蛋白质复合物的正确折叠与组装对细胞功能至关重要。细胞采用质量控制通路来纠正、……

以下实验的总体目标是在基因可追踪设计的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中识别组织特异性的分子伴侣相互作用。该技术的主要优势在于，它结合了易于使用的检测方法，例如拟合高兰AI（Golan AI）和行为读出，以揭示新的组织特异性相互作用。对于非应激性的胚胎同步化，使用线虫挑取工具将约100个卵从非同步化的线虫培养板转移至新制备的NGM平板上，并根据相应的实验时间表培养动物。当线虫发育至产卵的第一天时，缓慢向培养皿中加入一毫升 M9 缓冲液，注意将缓冲液加在远离细菌菌苔的位置，然后旋转培养皿，使缓冲液完全覆盖整个培养皿表面。将培养皿倾斜，倒出液体，从而将线虫从培养皿上冲洗下来。当所有线虫均被冲洗离培养皿后，使用标准的塑料移液枪头，在卵聚集的位置周围切割一块含琼脂的方形区域，并将该琼脂块转移至新制备的 NGM 培养皿上。在相同的培养条件下培养卵。孵育结束时，培养板上应布满同步化的卵。按照上述方法将所有动物从培养板上冲洗下来后，加入1毫升新鲜M9缓冲液，并使用细胞刮棒将卵从培养板上刮下。当所有卵均已脱离后，将培养板中的全部缓冲液体积转移至锥形管中，进行离心。离心后弃去上清液。去除上清液后，向培养板中加入最多一毫升新鲜M9缓冲液，并用移液器吹打以重悬卵。按照上述方法再清洗卵五次。最后一次清洗后，卵沉淀应呈白色，除最后200微升上清液外，其余上清液均可移除。为了培养用于实验的同步化线虫，取约30个卵的液滴，将其置于各干扰RNA平板上的细菌菌苔附近，另取约30个卵接种到含有空载体细菌的平板上。然后根据实验方案，在适当的培养条件下培养动物。为了评估同步化动物的胚胎致死率，当动物开始产卵时，将约100个卵转移到一个空培养皿中，并将卵排列成行，以便于计数。24至48小时后，统计未孵化卵的百分比。作为对照，将实验动物的卵与经空载体对照细菌处理的动物卵进行比较。为建立瘫痪实验，将年龄同步化的动物培养在空载体对照细菌上，直至动物达到成年期，但在开始产卵之前。使用细标记笔在标准NGM琼脂平板背面画一条线，并将5至10只动物放置在标记线上。设置计时器为10分钟，记录仍停留在线上的动物所占百分比，作为瘫痪线虫的评分依据。作为参考，将此数据与在空载体对照细菌上培养的突变体动物的百分比进行比较。进行蛋白质敲降验证时，将250至300个同步化的卵放置于60毫米NGM干扰RNA平板上，该平板已接种表达相应双链RNA或含空载体的细菌，并将卵在适当的实验周期内进行培养。孵育结束后，将总共200只年轻成年动物转移至一个含有200微升PBST的1.5毫升离心管管盖中，PBST需维持在动物培养温度。小心盖紧管盖，于1000 × g离心1分钟。离心结束后，向管中加入800微升新鲜PBST，再次离心线虫。小心吸除上清液的顶部900微升，并像刚才演示的那样，用新鲜的PBST再清洗线虫3次。最后一次清洗后，除去上清液，仅保留最后的100微升，然后向其中加入25微升5X上样缓冲液。将样品在92摄氏度、1000转/分钟的条件下加热10分钟，然后将每份样品中的20微升上样到SDS-PAGE凝胶中。 然后使用适当的抗体进行蛋白质印迹分析，以确定目标蛋白的相对稳定性，并利用密度测定软件分析条带的强度。在野生型动物中，发育过程中敲低 HSP6 会导致强烈的发育停滞。与此同时，在肌肉特异性干扰 RNA 菌株中（该菌株在肌肉组织中表达野生型 RDE1），敲低 HSP6 不会引起发育停滞。而HSP6在肠道特异性表达野生型RDE1的RNAi菌株中敲低时，会导致显著的发育阻滞和表型。因此，HSP6突变株MG585所引起的轻度生长延迟可用于筛选加重或缓解的分子伴侣相互作用：将携带该突变基因的菌株与肠道特异性干扰RNA菌株杂交，并筛选分子伴侣干扰RNA文库。在第四幼虫期，经STI1、AHSA1或DAF41干扰RNA处理的UNC45突变动物中，肌球蛋白的排列组织与野生型线虫相似。尽管突变体在达到成年期后表现出肌节结构紊乱。相比之下，经空载体对照处理的UNC45突变型动物和野生型动物均未受到影响。遗传相互作用并不表明存在物理相互作用。因此，必须通过遗传相互作用筛选的后续实验来验证并直接探究所鉴定出的相互作用的性质。

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生物学

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