利用 Caenorhabditis elegans 筛选组织特异性分子伴侣相互作用

以下实验的总体目标是在基因可追踪设计的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中识别组织特异性的分子伴侣相互作用。该技术的主要优势在于，它结合了易于使用的检测方法，例如拟合高兰AI（Golan AI）和行为读出，以揭示新的组织特异性相互作用。对于非应激性的胚胎同步化，使用线虫挑取工具将约100个卵从非同步化的线虫培养板转移至新制备的NGM平板上，并根据相应的实验时间表培养动物。

当线虫发育至产卵的第一天时，缓慢向培养皿中加入一毫升 M9 缓冲液，注意将缓冲液加在远离细菌菌苔的位置，然后旋转培养皿，使缓冲液完全覆盖整个培养皿表面。将培养皿倾斜，倒出液体，从而将线虫从培养皿上冲洗下来。当所有线虫均被冲洗离培养皿后，使用标准的塑料移液枪头，在卵聚集的位置周围切割一块含琼脂的方形区域，并将该琼脂块转移至新制备的 NGM 培养皿上。

在相同的培养条件下培养卵。孵育结束时，培养板上应布满同步化的卵。按照上述方法将所有动物从培养板上冲洗下来后，加入1毫升新鲜M9缓冲液，并使用细胞刮棒将卵从培养板上刮下。

当所有卵均已脱离后，将培养板中的全部缓冲液体积转移至锥形管中，进行离心。离心后弃去上清液。去除上清液后，向培养板中加入最多一毫升新鲜M9缓冲液，并用移液器吹打以重悬卵。

按照上述方法再清洗卵五次。最后一次清洗后，卵沉淀应呈白色，除最后200微升上清液外，其余上清液均可移除。为了培养用于实验的同步化线虫，取约30个卵的液滴，将其置于各干扰RNA平板上的细菌菌苔附近，另取约30个卵接种到含有空载体细菌的平板上。

然后根据实验方案，在适当的培养条件下培养动物。为了评估同步化动物的胚胎致死率，当动物开始产卵时，将约100个卵转移到一个空培养皿中，并将卵排列成行，以便于计数。24至48小时后，统计未孵化卵的百分比。

作为对照，将实验动物的卵与经空载体对照细菌处理的动物卵进行比较。为建立瘫痪实验，将年龄同步化的动物培养在空载体对照细菌上，直至动物达到成年期，但在开始产卵之前。使用细标记笔在标准NGM琼脂平板背面画一条线，并将5至10只动物放置在标记线上。

设置计时器为10分钟，记录仍停留在线上的动物所占百分比，作为瘫痪线虫的评分依据。作为参考，将此数据与在空载体对照细菌上培养的突变体动物的百分比进行比较。进行蛋白质敲降验证时，将250至300个同步化的卵放置于60毫米NGM干扰RNA平板上，该平板已接种表达相应双链RNA或含空载体的细菌，并将卵在适当的实验周期内进行培养。

孵育结束后，将总共200只年轻成年动物转移至一个含有200微升PBST的1.5毫升离心管管盖中，PBST需维持在动物培养温度。小心盖紧管盖，于1000 × g离心1分钟。离心结束后，向管中加入800微升新鲜PBST，再次离心线虫。

小心吸除上清液的顶部900微升，并像刚才演示的那样，用新鲜的PBST再清洗线虫3次。最后一次清洗后，除去上清液，仅保留最后的100微升，然后向其中加入25微升5X上样缓冲液。将样品在92摄氏度、1000转/分钟的条件下加热10分钟，然后将每份样品中的20微升上样到SDS-PAGE凝胶中。

然后使用适当的抗体进行蛋白质印迹分析，以确定目标蛋白的相对稳定性，并利用密度测定软件分析条带的强度。在野生型动物中，发育过程中敲低 HSP6 会导致强烈的发育停滞。与此同时，在肌肉特异性干扰 RNA 菌株中（该菌株在肌肉组织中表达野生型 RDE1），敲低 HSP6 不会引起发育停滞。

而HSP6在肠道特异性表达野生型RDE1的RNAi菌株中敲低时，会导致显著的发育阻滞和表型。因此，HSP6突变株MG585所引起的轻度生长延迟可用于筛选加重或缓解的分子伴侣相互作用：将携带该突变基因的菌株与肠道特异性干扰RNA菌株杂交，并筛选分子伴侣干扰RNA文库。在第四幼虫期，经STI1、AHSA1或DAF41干扰RNA处理的UNC45突变动物中，肌球蛋白的排列组织与野生型线虫相似。

尽管突变体在达到成年期后表现出肌节结构紊乱。相比之下，经空载体对照处理的UNC45突变型动物和野生型动物均未受到影响。遗传相互作用并不表明存在物理相互作用。

因此，必须通过遗传相互作用筛选的后续实验来验证并直接探究所鉴定出的相互作用的性质。