Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

以下遗传可追踪设计秀丽隐杆线虫实验的总体目标是确定组织特异性伴侣相互作用。该技术的主要优点是它结合了易于使用的分析方法，例如拟合 Golan AI 和行为读数，以揭示新的组织特异性相互作用。对于非应激胚胎同步，使用蠕虫镐将大约 100 个鸡蛋从未同步的蠕虫板移动到新就位的 NGM 板，并根据适当的实验计划培养动物。

当动物到达产蛋的第一天时，在远离细菌草坪的地方慢慢加入 1 毫升 M9 缓冲液到板中，然后旋转板，使缓冲液完全覆盖板。将板向一侧倾斜以去除液体并从板中清洗动物。当所有蠕虫都从板中洗掉后，使用标准塑料移液器吸头在鸡蛋集中的地方周围切下一方块琼脂，然后将琼脂块放在新就位的 NGM 板上。

在相同的培养条件下培养鸡蛋。孵化结束时，盘子上应覆盖同步种蛋。如刚才所示，从板中清洗所有动物后，加入 1 毫升新鲜的 M9 缓冲液，并使用细胞刮刀将鸡蛋从板中释放出来。

当所有鸡蛋都分离后，将整个体积的缓冲液从板转移到锥形管中进行离心。离心管并弃去上清液。去除上清液后，向板中加入最多 1 毫升新鲜的 M9 缓冲液，然后移液以重悬鸡蛋。

如前所述，将鸡蛋再洗五次。最后一次洗涤后，鸡蛋沉淀应呈白色，除最后 200 μL 上清液外，其他所有上清液均可去除。为了培养用于实验的同步线虫，将大约 30 个卵滴在靠近细菌草坪和每个干扰 RNA 的固定板上，将大约 30 个卵放在装有含有细菌的空载体的板上。

然后根据实验方案在适当的培养条件下培养动物。为了评估同步动物的胚胎致死率，当动物开始产蛋时，将大约 100 个鸡蛋转移到一个空盘子中，并将鸡蛋分成几行以简化计数。24 到 48 小时后，对未孵化种蛋的百分比进行评分。

作为参考，将实验动物卵与用空病媒对照细菌处理的动物卵进行比较。为了设置麻痹测定，在空的媒介对照细菌上培养年龄同步的动物，直到动物成年，但在开始产卵之前。使用细记号笔在常规 NGM 琼脂板的背面画一条线，并将 5 到 10 只动物放在标记线上。

设置一个 10 分钟的计时器，并对在线上剩余的瘫痪蠕虫动物的百分比进行评分。作为参考，请将此数据与在空病媒对照细菌上生长的突变动物的百分比进行比较。对于蛋白质敲低验证，将 250 至 300 个同步鸡蛋放在 60 毫米 NGM 干扰 RNA 板上，该板与相关的双链 RNA 表达或含有细菌的空载体固定，并在适当的实验期间培养鸡蛋。

在孵化结束时，将总共 200 只年轻的成年动物转移到含有 200 微升 PBST 的 1.5 毫升试管的盖子中，PBST 保持在动物培养温度下。小心盖上盖子，将动物以 1000 倍 G 离心 1 分钟。离心结束时，向试管中加入 800 微升新鲜 PBST，然后再次离心蠕虫。

小心去除前 900 微升的上清液，并在新鲜的 PBST 中再洗涤线虫 3 次，如刚才所示。最后一次洗涤后，除最后 100 μL 上清液外，除去所有上清液，并向动物中加入 25 μL 5X 样品缓冲液。在 92 摄氏度下以每分钟 1000 转的速度将样品加热 10 分钟，然后将每个样品的 20 微升上样到 SDS 页面凝胶上。

然后使用适当的抗体进行 Western blot 分析，以确定目标蛋白质的相对稳定性，并使用光密度测定软件确定禁令的强度。HSP6 在发育过程中被敲低导致野生型动物的强烈发育停滞。同时，在肌肉组织中表达野生型 RDE1 的肌肉特异性干扰 RNA 菌株中敲低的 HSP6 不会导致发育停滞。

而 HSP6 敲低了在肠道细胞中表达野生型 RDE1 的肠道特异性 RNAI 菌株，导致强烈的发育停滞和表型。因此，HSP6 MG585 中导致轻度生长延迟的突变可用于筛选加重或减轻伴侣相互作用，方法是将携带该突变基因的菌株杂交到肠道特异性干扰 RNA 菌株中，并筛选伴侣干扰 RNA 文库。肌球蛋白组织和用 STI1 AHSA1 或 DAF41 干扰 RNA 处理的 UNC45 突变动物与第四幼虫阶段的野生型蠕虫相似。

尽管突变体在成年后表现出肌节中断。相比之下，用空载体对照处理的 UNC45 突变动物和野生型动物均不受影响。遗传相互作用并不表示物理相互作用。

因此，必须使用遗传相互作用筛选进行后续实验，以验证和直接检查已识别的相互作用的性质。