用于长期纳米材料暴露后体外遗传毒性检测的先进三维肝脏模型

该 Hep G2 模型为体外测试系统提供了一种相关替代方法，可更可靠地评估长期暴露于纳米材料后固定 DNA 损伤的潜在诱导作用，旨在尽量减少动物实验的需求。Hep G2 球状体模型能够在14天内保持活性和功能，并维持适当的增殖水平。这有助于对一系列生化和遗传毒性终点指标进行测试，包括微核试验。

在尝试本方案之前，建议先进行几次练习操作。在细胞接种或更换培养基时需格外小心，因为这些步骤需要精细的操作。首先，向96孔培养板的各孔中加入100 µL无菌的室温PBS。

将培养板的盖子倒置，在盖子每个凹槽的中心小心地加入20微升细胞悬液。使用多通道移液器，每次加入2至4滴，以确保加样位置准确。每次仅接种四个凹槽，并在开始前确保所有移液器吸头均对齐。

持握多通道移液器的角度会影响类球体的形成方式。确保液滴位于盖板孔槽的中央，然后轻轻将盖板翻转至培养板上，使液滴悬于含有PBS的孔上方。在将类球体转移至琼脂糖前，于37摄氏度及5%二氧化碳条件下孵育三天。

孵育结束后，将培养板从培养箱中取出，小心打开盖子，弃去 PBS，轻拍培养板以去除残留液体，并让培养板在空气中干燥 2 至 3 分钟。琼脂糖融化后，轻轻混匀以去除气泡，并向每个孔的底部加入 50 µL。室温静置 2 分钟后，向每孔中的凝固琼脂糖层上方加入 100 µL 预热的 DMEM 培养基。

将带有这些球状体液滴的盖子重新放回培养板上方，使球状体再次倒挂，然后以200 ×g离心3分钟，以将球状体转移至培养板的各个孔中。继续孵育培养板24小时，使球状体沉降。在分散工程纳米材料（ENMs）后，用预热的DMEM将其稀释至最终所需浓度。

用移液器从含有球状体的每个孔中吸出50微升培养基，并加入50微升含有ENM的培养基。收集球状体时，使用200微升移液器从每个孔中吸取含有球状体组织的100微升细胞培养基，注意避免接触琼脂糖。将球状体收集至无菌的15毫升离心管中。

将球状体悬液在230 × g条件下离心5分钟，然后移除上清液，并将上清液于-80°C保存，以待进一步分析。用1 mL无菌的室温磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤球状体沉淀，随后在230 × g条件下离心3分钟，并弃去上清液。将球状体重悬于500 µL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液中，在37°C、5% CO₂条件下孵育6至8分钟。

孵育后，轻轻吹打胰蛋白酶消化的 Hep G2 细胞，使其充分解离并重悬，随后加入一毫升 DMEM 进行中和。将细胞悬液在 230 × g 离心五分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于两毫升 PBS 中。为构建比色皿漏斗装置，先将制备好的显微镜载玻片放入金属支架中，将滤纸卡片置于载玻片上方，然后将比色皿漏斗固定在顶部。

将离心管离心管漏斗放入细胞离心机中，漏斗口朝上，以便直接向每个漏斗中加入100 µL细胞悬液。随后按照文稿说明进行玻片固定。用磷酸盐缓冲液配制20%吉姆萨染色液。

轻轻吹打溶液使其混匀，然后用折叠滤纸通过漏斗过滤。使用巴斯德移液管向每张载玻片上的细胞点加3至5滴过滤后的吉姆萨染液，在室温下染色8至10分钟。用磷酸酶缓冲液连续洗涤载玻片两次。

然后用冷水短暂冲洗，以去除多余的染料，并让其自然晾干。在进行任何体外毒理学评估之前，必须确认3D HepG2球状体已正确形成。接种后第四天，应形成结构紧密、呈球形、表面光滑且无可见突起的球状体。

此处展示了接种后第四天高质量和低质量类球体的示例。通常情况下，每块培养板中形成的类球体有90%至95%能够正常形成并具有活性，可用于后续实验。通过14天的培养周期评估了类球体的活性及类似肝脏的功能，以确定肝脏类球体模型的持续活性，并验证其是否适用于长期的ENM或化学物质危害评估。

在培养期间，白蛋白浓度保持稳定，而每个球状体的尿素生成量在第14天前增加，随后开始下降。在遗传毒性评估中，采用微核试验检测急性及长期暴露于工程纳米材料（ENM）后微核的形成情况。球状体暴露于两种ENM，即二氧化钛和银。

在急性暴露于两种工程纳米材料（ENMs）后，也观察到类似的遗传毒性趋势，但在为期五天的长期暴露后，遗传毒性反应的升高并不明显。采用该方法后，可同时收集上清液和球状体，用于多种生物化学终点的检测，包括细胞活力、肝功能检测、SID 450 分析、炎症相关标志物以及基因表达分析。

目前，多家合同研究实验室正在测试该技术，希望将其应用于化学品和纳米材料的常规遗传毒性检测。这有望减少对体内检测方法的依赖。