Name: 长期纳米材料暴露后体外基因毒性测试的高级 3D 肝脏模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 了解使用三维Hep G2球状体模型进行纳米材料基因毒性测试的方法。该体外系统可在14天内维持细胞活性，通过微核试验评估DNA损伤，有助于减少动物实验需求。

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作者谨此致谢，本研究获得了欧盟“地平线2020”科研与创新计划对PATROLS项目的支持，资助协议编号为760813

1. 培养冻存的 HepG2 细胞
注意：HepG2 细胞购自美国模式培养物集存库（ATCC），使用含 4.5 g/L D-葡萄糖和 L-谷氨酰胺的 1×杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），并添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素抗生素进行培养。
<ol>
	<li>将DMEM细胞培养基（含补充物）置于37 °C水浴中预热30分钟。</li>
	<li>从液氮中取出一支HepG2细胞冻存管，在37 °C水浴中解冻2-3分钟，期间轻轻摇动冻存管以使细胞悬液均匀解冻。注意不要将冻存管浸没至O形圈以上，以降低污染风险。</li>
	<li>解冻后，将冻存管从水浴中取出，并用70%乙醇充分喷洒其外表面以去污，然后置于无菌的II级生物安全柜中。</li>
	<li>小心地将HepG2细胞冻存管中的内容物用移液器转移至含有9 mL预热DMEM细胞培养基（含补充物）的离心管中。</li>
	<li>使用10 mL移液管将10 mL细胞悬液转移至一个25 cm2的一次性细胞培养瓶中，并在5% CO2、37 °C条件下培养3天（自接种起计），直至细胞融合度达到约80%，随后传代至更大的75 cm2一次性细胞培养瓶中。</li>
	<li>当细胞融合度达到80%时，在无菌条件下使用经37 °C水浴预热30分钟的0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液进行消化传代。切勿让细胞干燥。</li>
	<li>由于细胞形成贴壁单层，将培养基倾倒至消毒废液容器中。随后立即用3 mL室温保存的无菌1×PBS溶液冲洗培养瓶两次，以彻底去除残留培养基，并将PBS也弃入消毒废液容器中。</li>
	<li>去除PBS洗涤液后，加入5 mL预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，确保完全覆盖细胞表面，并在37 °C、5% CO2条件下孵育6-8分钟。</li>
	<li>轻轻敲击培养瓶使细胞从瓶底脱落，然后加入5 mL DMEM细胞培养基（含补充物）以中和胰蛋白酶活性。</li>
	<li>将细胞悬液转移至50 mL离心管中，并反复吹打混匀，确保细胞完全解离。</li>
	<li>将稀释后的细胞悬液在230 × g 条件下离心5分钟。将上清液弃入消毒液中，将细胞沉淀重悬于25 mL DMEM细胞培养基（含补充物）中。</li>
	<li>将细胞悬液转移至75 cm2的一次性细胞培养瓶中，在37 °C、5% CO2条件下继续培养3天，之后进行类球体准备。待HepG2细胞充分适应环境并再次达到约80%融合度后，测定细胞浓度，为类球体接种做准备。</li>
</ol>
2. HepG2 类球体的制备
<ol>
	<li>重复上述传代培养步骤，但离心后，将细胞沉淀重悬于1 mL已在37 °C水浴中预热的DMEM培养基中。用移液器将细胞悬液充分吹打混匀。</li>
	<li>采用台盼蓝排斥法检测细胞活力（参见OSHA SOP 3.21 生殖毒素、诱变剂、致畸剂和胚胎毒素——安全操作与储存程序（2019）以获取健康与安全指导）14，按1:1比例将细胞悬液与预先过滤的0.4%台盼蓝溶液混合。</li>
	<li>在细胞计数前，使用1 mL注射器取1 mL台盼蓝溶液，并通过0.45 µm滤器过滤至无菌的1 mL离心管中。</li>
	<li>将10 µL过滤后的台盼蓝溶液转移至0.2 mL离心管中，再加入10 µL细胞悬液。剩余的过滤台盼蓝溶液可在室温下保存最多3个月，供后续使用。</li>
	<li>在将盖玻片通过呼气湿润的方式固定于血细胞计数板表面之前，先用70%乙醇充分喷洒血细胞计数板，并用无菌纸巾擦干。通过在呼气湿润的表面滑动盖玻片，可因产生牛顿环而形成内聚力。</li>
	<li>加入10 µL样品至血细胞计数板前，先用1000 µL移液器轻柔地上下吹打台盼蓝细胞悬液（以减少剪切应力）。确保液体扩散至盖玻片下方，完全覆盖计数网格且无气泡。</li>
</ol>
<img alt="细胞计数网格示意图；用于生物学研究中的显微细胞计数分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：使用血细胞计数板进行细胞计数。 血细胞计数板的示意图，标示出应计数的象限。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="7">
	<li>在显微镜下，计数四个大角方格中的活细胞（未染色）和死细胞（染成蓝色）（图1）。计数时，排除位于大角方格内侧两条边线上或重叠在线上的细胞。</li>
	<li>使用以下计算公式，计算样品中平均活细胞（未染色）数量： 
	细胞总数/mL = 活细胞计数 × <img alt="稀释倍数除以计数方格数；微生物学中细胞浓度分析方法。" src="/files/ftp_upload/61141/61141eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式1"> × 10,000 
	其中，稀释倍数指原液在台盼蓝中稀释的倍数（本例为2倍），计数方格数指血球计数板上四个大角方格</li>
	<li>根据可存活的HepG2细胞计数，使用以下公式： 
	C1V1=C2V2 
	其中 C1 = 当前活细胞浓度， 
	V1 = 当前细胞悬液体积， 
	C2 = 所需细胞悬液浓度， 
	V2 = 所需细胞悬液体积</li>
	<li>用DMEM细胞培养基制备10 mL HepG2细胞悬液原液，浓度为2.0 × 105 个细胞/mL，以达到每20 µL悬滴中含有4000个HepG2细胞。使用1000 µL移液器轻轻吹打混匀细胞悬液，确保所有细胞在培养基中充分悬浮。</li>
	<li>向96孔细胞培养板的各孔中加入100 µL无菌、室温的PBS，以防止悬滴在孵育过程中干燥。</li>
	<li>取一个标准平底96孔细胞培养板的盖子，倒置，在盖子每个孔的凹槽中央小心地加入20 µL细胞悬液液滴，如图2所示。使用多通道移液器时，每次仅加入2–4个液滴，因为同时接种过多会影响液滴位置的准确性和分布。
	<ol>
		<li>将液滴置于盖子孔凹槽的中央；否则当盖子翻转后，液滴无法悬挂在孔的正中央，存在滑落至板内的风险。轻柔翻转96孔板盖子，使液滴悬垂，然后小心地将其放置在96孔板上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将带盖的整个96孔板轻柔放入37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育3天，之后再将类球体转移至琼脂糖上。 
	注意：不仅在将培养板移入或移出培养箱时需格外小心，在打开和关闭培养箱时也应避免剧烈动作，因为过度震动可能导致培养板移位，造成类球体脱落或形成异常。</li>
</ol>
<img alt="用于HepG2细胞悬液的96孔板设置示意图，展示悬滴法培养细胞形成类球体的过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：3D HepG2体外类球体模型的制备。（A）将HepG2细胞以20 µL液滴形式接种至96孔板盖上。（B）接种后采用悬滴法培养HepG2细胞，以促进类球体形成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 将HepG2球状体从悬滴转移至琼脂糖悬浮液
注意：接种到悬滴中第3天后，将类球体转移至同一块96孔板的孔中，所有孔均预先包被有一层精细的1.5%琼脂糖凝胶。
<ol>
	<li>制备琼脂糖凝胶并在包板前一天（即接种后第2天）进行高压灭菌（即接种后第3天包板）。
	<ol>
		<li>制备1.5%琼脂糖凝胶时，称取0.30 g琼脂糖加入洁净的玻璃瓶中，随后加入20 mL酚红-free DMEM培养基。将琼脂糖在高压灭菌锅中121°C灭菌1 h 230 °C 用于灭菌。琼脂糖涂层可防止HepG2类球体黏附于孔板底部，从而避免形成单层细胞，有助于维持其三维类球体结构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种后第3天，将含有HepG2悬滴球体的96孔板从培养箱中取出，小心翻转盖子，使球体不再呈悬挂状态。</li>
	<li>使用多通道移液器，移除并弃去 100 µL 将之前加入到96孔板底部的PBS除去。在加热琼脂糖准备包被的同时，让板子在空气中干燥2-3分钟。 
	警告：该步骤会产生非常烫的液态琼脂糖，若洒到皮肤上可能造成烫伤和其他伤害。此外，操作装有液态琼脂糖的玻璃瓶时也必须小心，因为玻璃瓶本身可能非常烫。</li>
	<li>使用先前制备的1.5%琼脂糖凝胶，将含有20 mL琼脂糖凝胶的玻璃瓶在微波炉中以最大功率（即900 W）加热30秒。涂布两块96孔板时，一瓶20 mL的预配1.5%琼脂糖凝胶即可满足需要。</li>
	<li>待琼脂糖完全融化后，轻轻旋转玻璃瓶使其混匀，以去除气泡，然后加入 50 µL 将琼脂糖加入每个孔的底部。 
	注意：加入琼脂糖时，切勿倾斜培养板 &gt;45° 因为琼脂糖凝固迅速，若操作不当将无法形成平整均匀的层，从而干扰球体的生长。此阶段需高效操作，以防止琼脂糖在完全包被培养板之前即发生凝固。</li>
	<li>室温下静置平板2分钟后再加入 100 µL 在每个孔中固体琼脂糖层上方加入预热的DMEM细胞培养基（含添加剂）。</li>
	<li>将96孔板的盖子翻转后重新盖回96孔板上，使类球体再次悬挂在孔底。</li>
	<li>离心板，200 × g，离心3分钟 g 为了将球状体从悬滴转移至96孔板的各个孔中。转移后，HepG2球状体应悬浮于细胞培养基中。将其置于培养箱中静置24 h，温度为 37 °C 和 5% CO2.</li>
	<li>在接种后第4天（即转移到琼脂糖包被板后24小时），对具有此尺寸的HepG2球状体进行化学物质或ENM处理。</li>
	<li>为了在长期培养过程中维持细胞活力，每3天更换一次细胞培养基。操作时，轻柔地吸出 50 µL 吸去培养孔表面的细胞培养基，并更换为新鲜培养基 50 µL DMEM细胞培养基。换液时注意不要移除或扰动类球体。</li>
</ol>
4. 纳米材料/化学物质暴露
注意：HepG2 肝脏类球体模型可支持纳米材料（ENM）和化学物质暴露实验，但本方案主要侧重于 ENM 暴露。暴露前，测试用 ENM 必须进行适当的分散处理；该步骤可按照 NanoGenoTox 分散方案（资助协议编号 No. 20092101，2018）15 进行。
<ol>
	<li>根据 NanoGenoTox 分散方案进行分散后，将 ENM 悬液从初始浓度 2.56 mg/mL 用预热的 DMEM 细胞培养基（含补充物）稀释至最终所需浓度。每块 96 孔板需 5 mL 体积用于给药。</li>
	<li>为对 HepG2 类球体施加化学物或 ENM 处理，使用 200 µL 移液器从每孔表面吸取 50 µL 培养基（保留 50 µL 在孔内，以免扰动类球体），并替换为含所需剂量测试毒物的 50 µL 培养基。</li>
	<li>施加测试物质后，将培养板在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育至所需暴露时间。</li>
	<li>若进行长期（≥24 h）暴露处理，则在所需暴露时间结束后立即按照下文步骤 6.1–6.4 所述收集类球体，用于微核终点分析。</li>
	<li>然而，对于急性暴露处理（例如，≤24 h），暴露期结束后，收集、合并并储存每孔 50 µL 上清液于 -80 °C，以备后续生化分析。随后将细胞培养基替换为含 6 µg/mL 细胞松弛素 B 的 50 µL 新鲜培养基，并继续孵育 1–1.5 个细胞周期（即 HepG2 细胞为 24–26 h），为细胞松弛素 B 阻断微核试验的收获做准备。 
	注意：对于急性（≤24 h）暴露处理，可采用细胞松弛素 B 阻断微核试验；但对于长期（≥24 h）暴露处理，必须采用无细胞松弛素 B 的单核版本试验，如下文 图 4 所述。</li>
</ol>
5. HepG2 球状体收获
注意：在化学物质或工程纳米材料暴露处理后，可收集细胞培养基或类球体组织用于多种终点分析。根据不同的终点分析要求，类球体可单独收集（例如用于图像分析），也可合并收集（例如用于细胞质分裂阻断微核试验）。
<ol>
	<li>从培养箱中取出96孔板。</li>
	<li>使用200 µL移液器，吸取每个孔中的100 µL细胞培养基，包括类球体组织，并收集至无菌的15 mL离心管中。注意避免接触琼脂糖。</li>
	<li>收集完成后，将类球体悬液在230 × g 条件下离心5分钟。移除上清液并储存在-80 °C，用于后续终点分析（例如肝功能检测）。</li>
	<li>将类球体沉淀重悬于1 mL无菌、室温的PBS（1×）中。</li>
	<li>洗涤后，再次将类球体悬液在230 × g 条件下离心3分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于500 µL的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液中，并在37 °C和5% CO2条件下孵育6-8分钟。</li>
	<li>孵育结束后，轻轻吹打胰蛋白酶消化的细胞，使其充分解离，并在加入1 mL DMEM细胞培养基中和之前重新悬浮HepG2细胞。</li>
	<li>将稀释后的细胞悬液在230 × g 条件下离心5分钟。将上清液弃入消毒液中，将细胞沉淀重悬于2 mL室温PBS（1×）中。</li>
	<li>将细胞悬液在230 × g 条件下离心5分钟。将上清液弃入消毒液中，然后将细胞沉淀再次重悬于2 mL冷PBS（1×）中。确保细胞充分分散，以防止在载玻片上制片时细胞团块遮挡视野。</li>
</ol>
6. 微核实验与计数
对于微核试验的手动方法，需要使用细胞离心机在显微镜载玻片中央形成细胞点（即定义明确且细胞集中的区域）。该过程有助于更高效地计数载玻片上的细胞，使分析者能够轻松定位目标细胞，而无需在细胞分布广泛的整个载玻片上进行观察。
<ol>
	<li>将冷冻的显微镜载玻片（每剂量三片）浸入70%乙醇，随后浸入ddH2O中，然后静置晾干5分钟。</li>
	<li>将准备好的显微镜载玻片放入离心管漏斗中，如图3A所示，其中玻璃载玻片（iii）置于金属支架（iv）内，上方固定有滤纸卡（ii）和离心管漏斗（i）。</li>
	<li>将离心管漏斗放入细胞离心机中，漏斗口朝上，以便直接向每个漏斗中加入100 µL细胞悬液。</li>
	<li>在500 x g条件下离心5分钟，以确保细胞均匀分布在载玻片表面。</li>
</ol>
<img alt="电泳凝胶盒和离心机转子设置；蛋白质分离分析方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：使用细胞离心涂片仪将处理后的细胞制备于显微镜载玻片上的装置示意图。（A）显示各个组件：(i) 样品槽漏斗，(ii) 滤纸片，(iii) 玻璃显微镜载玻片，以及将HepG2细胞离心涂片至载玻片上所需的(iv) 金属支架。（B）组装完成的样品槽漏斗。（C）样品槽漏斗在细胞离心机中的正确放置位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="5">
	<li>将载玻片在室温下自然晾干，然后在冰浴的90%甲醇中固定10分钟。</li>
	<li>固定后，将载玻片在室温下静置过夜自然晾干，随后于-20 °C保存，可保存长达6个月。</li>
	<li>使用时，从-20 °C冰箱中取出预先制备的显微镜载玻片，待其恢复至室温后进行吉姆萨染色。 
	注意：根据欧盟法规（EC）第1272/2008号[CLP]，吉姆萨染色液属于高度易燃液体，吞咽后可能具有毒性，接触眼睛、皮肤或吸入后可能造成损害。使用前请查阅相关的安全数据表（SDS），获取该化学品的详细储存、操作及健康安全建议。</li>
	<li>在载玻片解冻的同时，配制20%吉姆萨染色液（染色约30张载玻片需25 mL），用磷酸酶缓冲液（pH 6.8）稀释。将溶液轻轻旋转混匀后，使用折叠滤纸置于漏斗中过滤。</li>
	<li>使用巴斯德吸管，向每张载玻片的细胞点样区域加入3–5滴过滤后的吉姆萨染液，静置8–10分钟。</li>
	<li>将载玻片先后浸入两份磷酸酶缓冲液中洗涤，再用冷水短暂冲洗以去除残留染液。随后将载玻片自然晾干。</li>
	<li>待载玻片完全干燥后，在通风橱中将其浸入二甲苯中10秒，然后在细胞点样区域中央滴加一滴封片介质，并加盖盖玻片。</li>
	<li>将染色后的载玻片置于通风橱中过夜干燥，之后进行人工镜检评分；载玻片可在室温下长期保存。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>根据经济合作与发展组织（OECD）测试指南487（2014年）11，为评估和量化因暴露于工程纳米材料（ENM）或化学试剂所诱导的DNA损伤，应使用光学显微镜（100倍油镜），每份生物学重复计数2000个单核细胞或1000个双核细胞，以检测微核的存在，如图4所示。</li>
</ol>
<img alt="微核试验示意图；概述急性与长期暴露；标明细胞毒性评估方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：微核试验计分决策树。 该示意图决策树强调了在采用三维模型进行急性或长期暴露处理后，使用微核试验时需采用不同的计分方法和细胞毒性评估程序。急性（≤24 h）暴露可采用细胞分裂阻断微核试验，而长期（≥24 h）暴露则需采用单核版本的微核试验；这两种方法均在OECD试验指南487中有所描述。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>根据所计数的单核或双核细胞中微核所占的比例，计算出遗传毒性值的百分比。</li>
	<li>为评估所观察到的DNA损伤并非由大量凋亡细胞引起的细胞碎片所致，需同时测定细胞毒性。在此情况下，根据是否使用细胞松弛素B，采用CPBI或RVCC计算方法（如图4所示）。根据OECD试验指南48711的定义，仅在细胞毒性低于55% ± 5%的样品中进行遗传毒性评价。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

三维肝模型的应用因所针对的特定生化终点或不良结局通路而有显著差异。每种模型都有其优势与局限性，例如原代人肝细胞（PHH）模型存在供体间变异，而细胞系模型则表现出较低的细胞色素P450活性，但所有这些模型在其适用范围内均具有重要价值6,12,18,19。在评估遗传毒性时，现有模型与监管机构认可的检测终点（如体外微核试验）之间的兼容性存在一定限制，因为这些方法要求细胞具有活跃的增殖能力。这是必要的，因为遗传毒性评估需在细胞分裂后对固定的DNA损伤进行定量分析，此时DNA修复机制已失去纠正短暂性损伤的机会。然而，高度分化的肝细胞（如HepaRG）形成的类球体或PHH微组织虽被认为最能模拟生理状态下肝脏的特征，却属于静止（非增殖性）模型12,19,20。因此，本文所介绍的三维HepG2类球体模型提供了一种适合用于遗传毒性检测的替代方案。基于HepG2细胞系的类球体在其外层表面具有足够数量的活跃分裂细胞，同时仍保留基本的肝脏样特性，如白蛋白和尿素的生成以及部分CYP450活性5,12,19。该体外肝脏模型主要被开发用于支持微核试验，因为微核试验是遗传毒性检测组合中推荐的两项体外试验之一8,10,11,21。此外，该模型也可直接应用于DNA测序分析和基因表达（RNA）技术，并具备进一步拓展用于其他DNA损伤终点检测的潜力，例如彗星试验。尽管如此，仍需重视纳米材料（ENM）干扰在某些终点分析中的影响。例如，基于流式细胞术的分析可能不适用于ENM遗传毒性评估，主要原因在于颗粒物的干扰22。
对于正在进行细胞分裂的类球体模型而言，其尺寸是一个限制因素。接种密度的优化至关重要，因为细胞数量需足够多，以保证模型持续增殖；但又不能过高，否则会导致类球体过度致密，从而增大坏死核心。这种坏死的原因被认为是氧气和营养物质扩散受限，其扩散极限约为100–150 µm的组织厚度23,24。然而，这还取决于细胞类型、细胞数量、支架相互作用以及培养条件25。已有研究表明，为避免C3A类球体中心过早出现坏死，其直径应控制在约700 µm以内，因此每种类球体接种4000个HepG2细胞可确保在暴露实验时模型直径不超过500 µm26。此外，Shah等人发现，当每种类球体接种HepG2细胞超过5000个时，在培养7天后细胞活力下降25%，这可能与平均直径达680 µm以及20 µL悬滴中营养物质供应受限有关5。为克服这一问题，本实验方案中设计的模型包含一个关键步骤：在类球体初步形成后，将其从悬滴转移至琼脂糖包被的孔板中。此举可提供更大体积的培养基，以维持类球体内不断增长的细胞数量。因此，HepG2类球体模型在体外培养10天后仍能保持70%以上的细胞活力，可用于长期的体外危害评估。
尽管HepG2类球体模型可支持急性与长期暴露实验，但在长期培养过程中更换细胞培养基受到一定限制，因为完全更换培养基可能导致类球体丢失，因此不建议进行完全换液。通常认为，在暴露于工程纳米材料（ENM）时，均相ENM分散液易于发生团聚并沉降。然而值得注意的是，ENM的沉降速率可能因颗粒参数（如尺寸、形状和密度）的不同而有所差异，理论上可通过体外沉降、扩散与剂量测定（ISDD）模型或其近期衍生模型进行估算，这些模型在讨论ENM（悬浮液）暴露方法时常被引用27,28。基于此，理论上若仅从培养表面小心移除50%的培养基，对ENM剂量的扰动及损失应最小。然而，由于布朗运动的存在，实际情况可能并非如此，因此有必要针对每种待测ENM开展进一步研究，以明确其沉积与沉降行为，确保在长期暴露过程中维持准确的剂量27。这一点在实施重复给药方案时尤为重要，因为这可能直接影响最终的累积浓度。相比之下，化学物质暴露虽也有其局限性需考虑，但方法更为简便，因化学物质通常能稳定存在于溶液中，通过在换液时直接补充原有浓度及新增浓度的化学物质，即可有效补偿换液过程中损失的成分29。未来的研究应用可包括评估该模型在长期培养条件下进行重复暴露实验的适用性，因为重复给药策略对于评估特定器官系统是否能够缓解或克服外源性物质生物累积所引发的不良效应（如有）至关重要。
综上所述，这种三维体外肝模型能够用于评估多种现实的暴露情景，从而为常规且易于获取的体外方法提供支持，以更好地开展工程纳米材料和化学品危害评估。

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section was updated.
Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Cell culture analysis; graph of cell viability and bar charts of albumin, urea over time in days." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 6">
to:
<img alt="Cell viability, albumin, and urea levels over 14 days in culture; graphs of cell culture analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 6">
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &gt;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the ≥14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be ≥0.06 mg/mL whilst urea production should be ≥0.4 ng/µL before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &gt;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the ≥14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be ≥50.0 ng/μL whilst urea production should be ≥0.25 ng/µL before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

由于工程纳米材料（ENM）在众多面向人类的应用领域（如食品、化妆品、服装、运动器材、电子、交通和医药）中迅速发展并得到广泛应用，人类不可避免地会经常接触到这些ENM。随之而来的是人们日益担忧，这些材料因其新颖的、与尺寸相关的理化特性而在诸多应用中具有优势，但同时也可能对人类健康和环境造成不利影响。目前，许多&#160;国际性活动正在开展&#160;，旨在更真实地模拟人体对这些ENM的生理相关暴露情况，并评估这些材料在急性暴露、长期暴露以及重复低剂量暴露情景下的潜在毒性&#160;。
在考虑工程纳米材料（ENM）暴露时，肝脏毒理学至关重要，因为众所周知，肝脏是暴露后ENM积累的主要部位1,2。此外，肝脏是进入体循环的物质进行代谢和解毒的主要器官系统3。基于目前普遍认知，即二维肝细胞模型无法准确模拟复杂的多细胞相互作用，也不能恰当反映体内观察到的代谢活性，因此人们越来越重视开发稳健且具有生理相关性的体外三维肝脏模型，以替代体内实验技术4,5。利用先进的三维培养技术可延长体外肝模型的存活时间，从而能够研究长期、重复暴露的效应。此外，这种先进的培养形式有助于形成更接近生理状态的类器官特征，例如胆小管结构、活跃的转运过程以及增强的CYP450药物代谢能力，从而提高模型的预测准确性6。目前存在的体外三维肝模型包括单细胞培养（仅肝细胞）或共培养（肝细胞与非实质细胞）体系，其形式多样，包括超低黏附板中的微组织或球状体、悬滴法形成的球状体、细胞包埋于基质和/或支架中的结构，以及微流控细胞培养平台，这些均被视为有效的先进体外肝毒性评估模型6,7。然而，大多数此类模型系统维护成本高，需要专用设备且价格昂贵。此外，这些模型通常是静态的（即非分裂细胞模型），限制了其在危害终点评估中的应用，例如无法用于通过定量固定DNA损伤的方法进行遗传毒性测试。遗传毒性是监管毒理学中的核心前提，也是任何毒物风险评估的关键组成部分8。目前尚无单一检测方法可用于量化外源性物质暴露后可能出现的所有形式的DNA损伤。然而，体外遗传毒性测试组合中的核心检测之一是微核试验，该方法是一种可靠且多方面的技术，用于检测染色体整体损伤9。该技术被经济合作与发展组织（OECD）测试指南487所规定，是评估体外DNA损伤和遗传毒性的金标准，并属于监管危害评估所需测试组合的一部分10,11。
人肝细胞癌细胞系 HepG2 广泛用于初步危害评估筛选，因为该细胞易于获取、来源成本相对较低、培养简单，并适用于高通量筛选12,13。当培养成三维球状结构时，HepG2 细胞已被证明能够很好地模拟肝脏微环境，提供具有足够增殖能力的肝模型，以支持微核试验3。为进一步提升 HepG2 类球体模型的寿命和肝脏样功能，已对其进行了改进，使其能够在长期、重复暴露条件下（≤14 天）支持遗传毒性危害评估。因此，依据“3R 原则”（替代、减少和优化动物实验），本实验方案旨在建立一种先进的体外三维肝模型，能够常规且便捷地可靠评估多种毒理学终点指标（如肝脏功能、（前）炎症标志物、细胞毒性和遗传毒性），适用于急性、长期及重复化学物质和工程纳米材料暴露后的评价。
本文介绍一种建立生理相关三维肝细胞系体外模型系统的方法，用于评估急性或长期重复暴露于工程纳米材料（ENM）后的遗传毒性危害。该方案可分为六个关键步骤：冻存HepG2细胞的培养；HepG2细胞球的制备；将HepG2细胞球从悬滴转移至琼脂糖悬浮液；HepG2细胞球的收获；微核试验及计分；以及数据分析。

<table><tbody><tr><td>黄曲霉毒素B1</td><td>Sigma Aldrich，英国</td><td>A6636-5MG</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma Aldrich，英国</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌指示胶带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCG白蛋白测定</td><td>Sigma Aldrich，英国</td><td>MAK124</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白粉末</td><td>Sigma Aldrich，英国</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>细胞冻存辅助剂</td><td>赛默飞世尔科技公司，英国</td><td>5100-0001 - Mr Frosty</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>细胞松弛素B</td><td>英国默克</td><td>250233</td><td></td></tr><tr><td>细胞学金属夹</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 离心机</td><td>赛默飞世尔科技公司，英国</td><td>CM00730202</td><td></td></tr><tr><td>含4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺的DMEM</td><td>GIBCO，英国佩斯利</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，酚红-free，含4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺和HEPES</td><td>GIBCO，英国佩斯利</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>DPX封片剂</td><td>FisherScientific，英国</td><td>D/5330/05</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>FisherScientific，英国</td><td>10048291</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO，英国佩斯利</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 滤膜卡片</td><td>FisherScientific，英国</td><td>15995742</td><td></td></tr><tr><td>磨砂玻璃载片</td><td>赛默飞世尔科技公司，英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>瑞氏-吉姆萨改良R66溶液，Gurr</td><td>VWR Chemicals，英国</td><td>MFCD00081642</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片（24 × 60）</td><td>Deckglaser，VWR</td><td>ECN631-1575</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板和盖玻片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜用浸油</td><td>蔡司，英国</td><td>518F，ISO8034</td><td></td></tr><tr><td>II级层流组织培养罩</td><td>Scanlaf Mars</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>蔡司，英国</td><td>Axiovert 40C</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>FisherScientific，英国</td><td>10284580</td><td></td></tr><tr><td>微波</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>未过滤、无菌 200&amp;micro;l 和 1000&amp;micro;移液器吸头</td><td>Greiner-Bio-One，英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuncMicroWell 96孔微孔板</td><td>赛默飞世尔科技，丹麦</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>P1000 和 P200 微量移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P300 和 P50 多通道移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 1×，MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 免费</td><td>GIBCO，Paisley，英国</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>GIBCO，英国佩斯利</td><td>15140-122，青霉素/链霉素 100 倍浓缩液或 10,000 U/ml</td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶缓冲液片剂</td><td>GIBCO，Paisley，英国</td><td>10582-013</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Boy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific CytoSep 离心管适配器，适用于 Shandon Cytospin 4 离心机</td><td>FisherScientific，英国</td><td>11690581</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier SFX 550 240V CE 1/2&quot; - 探针</td><td>美国布拉森</td><td>101-063-971R</td><td></td></tr><tr><td>T-25 和 T-75 组织培养瓶</td><td>Greiner-Bio-One，英国</td><td>T-25 (690175) 和 T-75 (660175)</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma Aldrich，英国</td><td>T8154-100mL</td><td></td></tr><tr><td>尿素检测试剂盒</td><td>Sigma Aldrich，英国</td><td>MAK006</td><td></td></tr><tr><td>Virkon 消毒剂</td><td>杜邦公司，英国</td><td>Rely+On Virkon</td><td></td></tr><tr><td>水浴（37?C）</td><td>Grant JBNova 18</td><td></td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>FisherScientific，英国</td><td>10588070</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>GIBCO，Paisley，英国</td><td>5300-054</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL 和 1.0 mL 离心管</td><td>Greiner-Bio-One，英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45&amp;micro;m 滤波单元</td><td>Millex HA，MF-Millipore，英国</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mL 注射器</td><td>BD Plastipak，FisherScientific，英国</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>20 mL LS 闪烁玻璃小瓶，22-400 铝箔衬垫聚丙烯盖</td><td>DWK生命科学有限公司，德国</td><td>WHEA986581</td><td></td></tr><tr><td>37?C 和 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ISO 5级高效空气过滤器培养箱</td><td>NUAIRE DHD Autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 mL 巴斯德吸管</td><td>Greiner-Bio-One，英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形 Falcon 管</td><td>Greiner-Bio-One，英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 或 100 mL 玻璃瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 带裙边 Falcon 管</td><td>Greiner-Bio-One，英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL、10 mL 和 25 mL 移液管</td><td>Greiner-Bio-One，英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9.4厘米方形培养皿</td><td>Greiner-Bio-One，英国</td><td>688161</td><td></td></tr></tbody></table>

用于长期纳米材料暴露后体外遗传毒性检测的先进三维肝脏模型

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

由于各类工程纳米材料（ENM）的快速发展与广泛应用，人类不可避免地会暴露于ENM之中，因此建立可靠且具有预测性的体外测试系统至关重要。在考虑ENM暴露时，肝脏毒理学尤为关键，因为肝脏在维持代谢稳态和解毒过程中发挥着核心作用，同时也是ENM暴露后在体内蓄积的主要部位之一。基于这一事实，并结合目前普遍认可的观点——即二维肝细胞模型无法准确模拟体内复杂的多细胞相互作用和代谢活性——当前研究更加关注开发适用于ENM危害评估的生理相关性更强的三维肝模型。遵循“3R原则”（替代、减少和优化动物实验），已开发出一种基于3D HepG2细胞系的肝脏模型，该模型操作简便、成本较低，可支持长期及重复ENM暴露实验（≤14天）。这些球形模型（直径≥500 µm）保持了细胞增殖能力（即具有分裂能力的细胞模型），因此可与“金标准”微核试验联用，从而有效评估ENM的体外遗传毒性。该模型已通过多种ENM在急性（24小时）和长期（120小时）暴露条件下的测试，系统表征了其在多种毒理学终点上的响应能力，包括肝功能、（前）炎症反应、细胞毒性和遗传毒性。这种三维体外肝模型有望用于评估更接近真实情况的ENM暴露效应，从而为常规、便捷地开展ENM危害评估提供一种前景良好的体外解决方案。

通过开展基础表征研究，评估了基于该细胞系的三维肝类器官模型在长期培养及遗传毒性危害评估中的适用性，以确定该模型在培养14天期间的存活率和肝脏样功能，以及其在微核试验中的适用性。
3D HepG2 肝球状体模型的基线表征 
在进行任何体外毒理学评估之前，必须在实施琼脂糖转移或化学物质/工程纳米材料（ENM）处理前，确认3D HepG2球状体已正确形成。采用悬滴法生成的HepG2球状体通常在接种后2-3天（4000个细胞/球状体）形成结构致密、呈球形的球状体，平均直径为495.52 µm W × 482.69 µm H，如图5A-5C所示。用于体外毒理学评估的合格HepG2球状体必须具备结构致密、呈球形、表面光滑且无可见突起的特征。图5展示了高质量（图5D-F）和低质量（图5G-I）球状体的示例，其中后者应予以弃用。通常情况下，每块培养板中形成的球状体约有90-95%能够正常形成并具备后续实验所需的活性。
<img alt="细胞聚集过程、显微镜图像、9个样品显示形态、科学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图5：通过悬滴法形成的HepG2类球体自然形态的光学显微镜图像。（A-C）显示接种后第2天的类球体，（D-I）显示接种后第4天的HepG2肝类球体。（D-F）为高质量HepG2类球体的示例，而（G-I）显示形成不良的类球体。所有图像均使用显微镜在20倍物镜下拍摄。比例尺代表20 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为进一步确认 HepG2 类球体的存活率，可进行基本的比色溴甲酚绿白蛋白（BCG）检测或尿素检测，以评估其类似肝脏的功能。在为期14天的培养过程中，采用台盼蓝排斥法检测存活率的同时评估类肝脏功能，以确定肝脏类球体模型的持续活性，并验证其是否可用于长期或重复的纳米材料/化学物质危害评估（图6）。在培养期间，白蛋白浓度保持稳定。尿素生成量在培养第一周内随时间增加，每个类球体产生的尿素浓度在第7天达到平台期。值得注意的是，3D HepG2 类球体所产生的白蛋白和尿素水平显著高于以2D形式培养的相同细胞系。事实上，HepG2 细胞在2D培养条件下的白蛋白和尿素峰值分别为 0.001 mg/mL 和 0.010 ng/µL。此外，Shah 等人先前发表的研究中使用了几乎相同的 HepG2 类球体系统，作者指出，与2D培养的 HepG2 细胞相比，3D HepG2 体外模型系统的代谢活性（CYP1A1 和 CYP1A2）有显著提升5。
<img alt="细胞活力和蛋白质产量图表：培养天数中的活力（%）下降情况，白蛋白/尿素水平。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 6"> 
图 6：HepG2 肝脏类球体的14天基础表征数据。自悬滴法转移后，（A）显示了HepG2类球体模型在14天内的活力变化，而（B）和（C）分别显示了类似肝脏的白蛋白和尿素功能。数据以均值±标准误表示，n = 4。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
随着坏死核心的必然形成（这是已知的3D肝球状体培养的一个局限性），必须验证该基于HepG2的模型的活力，以证明其能够在维持微核试验所需的增殖能力的同时，支持长期（5–10天）的暴露方案。5确实，这种3D肝脏类球体模型已被证明能够保持 &gt;培养10天后细胞存活率超过70%。基于此结果，并结合在≥14天培养期内观察到的持续性肝样功能，该三维肝球体模型可支持长达10天的长期重复暴露实验（即在球体存活率降至70%以下之前）。作为参考，建议以4000个细胞/球体接种的HepG2球体，其白蛋白水平应≥20.0 ng/µL 尿素产量应≥0.25 ng/µL 在使用该模型进行体外毒理学评估之前。
工程纳米材料的遗传毒性评估 
为评估遗传毒性，采用微核试验检测急性（24 h）和长期（120 h）暴露于工程纳米材料（ENM）后微核的形成情况。黄曲霉毒素B1是一种已知的肝致癌物16,17，被推荐作为微核试验的阳性对照。优化实验表明，0.1 µM 黄曲霉毒素B1可在3D HepG2肝细胞球状体中诱导显著的阳性遗传毒性反应（≥2.0倍增加），因此在使用该模型进行的每一次微核试验中均采用此浓度。为确保采用HepG2球状体模型所得微核试验结果的有效性，该3D体外模型所用HepG2细胞的本底微核频率应处于0.6%–1.2%范围内。因此，黄曲霉毒素B1诱导的遗传毒性反应应至少比阴性对照高出两倍；即0.1 µM 黄曲霉毒素B1应诱导出1.5%–3.0%的微核频率。通过采用这些对照参数，可对体外条件下工程纳米材料相关的遗传毒性进行可靠评估。根据OECD试验指南487，需注意在测试工程纳米材料或化学物质时，所选浓度引起的细胞毒性不应超过55% ± 5%（以相对于阴性对照的CPBI或RVCC值降低为指标）11。图7展示了在HepG2球状体中，经急性及长期暴露后，黄曲霉毒素B1与两种工程纳米材料（二氧化钛（TiO2）和银（Ag））的评估结果，并通过微核试验分析其潜在遗传毒性。所评估的两种工程纳米材料均在非细胞毒性低剂量（5.00 µg/mL）下进行测试，分别经历急性（24 h）和长期（120 h）暴露方案。TiO2和Ag两种工程纳米材料在遗传毒性反应上表现出相似趋势：24小时暴露后出现的遗传毒性升高反应，在持续5天的长期暴露后不再明显。而作为阳性对照的黄曲霉毒素B1在两个时间点均持续诱导了显著的遗传毒性反应。
<img alt="柱状图分析急性暴露与长期暴露下微核频率（%），显示对照组与处理组结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7: TiO₂暴露后基因毒性评估2 以及Ag ENM暴露对HepG2肝球体的影响. 使用微核试验在（后）进行遗传毒性（微核频率）评估A急性（24小时）和（B长期（120 小时）暴露于 5.00 µg/mL TiO2 以及 Ag ENM。阴性对照为仅含培养基，而阳性对照为 0.1 µM 黄曲霉毒素B1。数据以均值±标准差表示（n=2）。与阴性对照组相比，显著性标记为：* = p ≤ 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

该方案旨在用于体外构建先进的三维肝细胞培养模型，可对纳米材料在急性或长期重复剂量暴露条件下相关的遗传毒性危害进行更符合生理状况的评估。

由于各种工程纳米材料（ENM）的快速发展与广泛应用，暴露于ENM已不可避免，且相关……的开发成为必要

该 Hep G2 模型为体外测试系统提供了一种相关替代方法，可更可靠地评估长期暴露于纳米材料后固定 DNA 损伤的潜在诱导作用，旨在尽量减少动物实验的需求。Hep G2 球状体模型能够在14天内保持活性和功能，并维持适当的增殖水平。这有助于对一系列生化和遗传毒性终点指标进行测试，包括微核试验。在尝试本方案之前，建议先进行几次练习操作。在细胞接种或更换培养基时需格外小心，因为这些步骤需要精细的操作。首先，向96孔培养板的各孔中加入100 µL无菌的室温PBS。将培养板的盖子倒置，在盖子每个凹槽的中心小心地加入20微升细胞悬液。使用多通道移液器，每次加入2至4滴，以确保加样位置准确。每次仅接种四个凹槽，并在开始前确保所有移液器吸头均对齐。持握多通道移液器的角度会影响类球体的形成方式。确保液滴位于盖板孔槽的中央，然后轻轻将盖板翻转至培养板上，使液滴悬于含有PBS的孔上方。在将类球体转移至琼脂糖前，于37摄氏度及5%二氧化碳条件下孵育三天。孵育结束后，将培养板从培养箱中取出，小心打开盖子，弃去 PBS，轻拍培养板以去除残留液体，并让培养板在空气中干燥 2 至 3 分钟。琼脂糖融化后，轻轻混匀以去除气泡，并向每个孔的底部加入 50 µL。室温静置 2 分钟后，向每孔中的凝固琼脂糖层上方加入 100 µL 预热的 DMEM 培养基。将带有这些球状体液滴的盖子重新放回培养板上方，使球状体再次倒挂，然后以200 ×g离心3分钟，以将球状体转移至培养板的各个孔中。继续孵育培养板24小时，使球状体沉降。在分散工程纳米材料（ENMs）后，用预热的DMEM将其稀释至最终所需浓度。用移液器从含有球状体的每个孔中吸出50微升培养基，并加入50微升含有ENM的培养基。收集球状体时，使用200微升移液器从每个孔中吸取含有球状体组织的100微升细胞培养基，注意避免接触琼脂糖。将球状体收集至无菌的15毫升离心管中。将球状体悬液在230 × g条件下离心5分钟，然后移除上清液，并将上清液于-80°C保存，以待进一步分析。用1 mL无菌的室温磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤球状体沉淀，随后在230 × g条件下离心3分钟，并弃去上清液。将球状体重悬于500 µL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液中，在37°C、5% CO₂条件下孵育6至8分钟。孵育后，轻轻吹打胰蛋白酶消化的 Hep G2 细胞，使其充分解离并重悬，随后加入一毫升 DMEM 进行中和。将细胞悬液在 230 × g 离心五分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于两毫升 PBS 中。为构建比色皿漏斗装置，先将制备好的显微镜载玻片放入金属支架中，将滤纸卡片置于载玻片上方，然后将比色皿漏斗固定在顶部。将离心管离心管漏斗放入细胞离心机中，漏斗口朝上，以便直接向每个漏斗中加入100 µL细胞悬液。随后按照文稿说明进行玻片固定。用磷酸盐缓冲液配制20%吉姆萨染色液。轻轻吹打溶液使其混匀，然后用折叠滤纸通过漏斗过滤。使用巴斯德移液管向每张载玻片上的细胞点加3至5滴过滤后的吉姆萨染液，在室温下染色8至10分钟。用磷酸酶缓冲液连续洗涤载玻片两次。然后用冷水短暂冲洗，以去除多余的染料，并让其自然晾干。在进行任何体外毒理学评估之前，必须确认3D HepG2球状体已正确形成。接种后第四天，应形成结构紧密、呈球形、表面光滑且无可见突起的球状体。此处展示了接种后第四天高质量和低质量类球体的示例。通常情况下，每块培养板中形成的类球体有90%至95%能够正常形成并具有活性，可用于后续实验。通过14天的培养周期评估了类球体的活性及类似肝脏的功能，以确定肝脏类球体模型的持续活性，并验证其是否适用于长期的ENM或化学物质危害评估。在培养期间，白蛋白浓度保持稳定，而每个球状体的尿素生成量在第14天前增加，随后开始下降。在遗传毒性评估中，采用微核试验检测急性及长期暴露于工程纳米材料（ENM）后微核的形成情况。球状体暴露于两种ENM，即二氧化钛和银。在急性暴露于两种工程纳米材料（ENMs）后，也观察到类似的遗传毒性趋势，但在为期五天的长期暴露后，遗传毒性反应的升高并不明显。采用该方法后，可同时收集上清液和球状体，用于多种生物化学终点的检测，包括细胞活力、肝功能检测、SID 450 分析、炎症相关标志物以及基因表达分析。目前，多家合同研究实验室正在测试该技术，希望将其应用于化学品和纳米材料的常规遗传毒性检测。这有望减少对体内检测方法的依赖。

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