长期纳米材料暴露后体外基因毒性测试的高级 3D 肝脏模型

该程序被确定用于在体外培养先进的3D肝培养物，它可以提供与纳米材料暴露在急性或长期重复剂量制度相关的基因毒性危害的生理相关评估。

该 Hep G2 模型提供了一种相关的替代体外测试系统，以更可靠地评估长期暴露于纳米材料后固定 DNA 损伤的潜在诱导，以最大限度地减少动物测试的需要。Hep G2 球状体模型能够在 14 天内保持活力和功能，并维持适当的增殖水平。这支持一系列生化和遗传毒性终点的检测，包括微核测定。

在尝试此协议之前，我建议您先进行几次练习。细胞接种或更换培养基时要小心，因为这些需要一种微妙的方法。首先向 96 孔培养板的孔中加入 100 微升无菌室温 PBS。

倒置板盖，小心地将 20 微升细胞悬液滴入盖子每个孔槽的中心。使用多通道移液器，一次添加 2 到 4 滴，以确保放置的准确性。一次只接种四种类固醇，并确保移液器吸头在开始前全部对齐。

您握住多通道的角度将影响椭球体的形成方式。确保液滴位于盖子上孔的凹槽内，然后轻轻翻转板顶部的盖子，使液滴用 PBS 悬挂在孔上。将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育三天，然后将球体转移到琼脂糖上。

孵育后，从培养箱中取出板，小心地从板上掀开盖子，丢弃 PBS，轻敲板以去除任何残留液体，然后让板风干 2 到 3 分钟。融化琼脂糖后，轻轻旋转以去除任何气泡，并向每个孔的底部添加 50 μL。将板在室温下放置 2 分钟，然后在每个孔的固体琼脂糖层上添加 100 μL 预热的 DMEM。

将装有该球状液滴的盖子放回板顶部，使球状体再次悬空，然后以 200 倍 G 离心板 3 分钟，以将球状体转移到板的各个孔中。将板再孵育 24 小时，让球体沉淀。在工程纳米材料 （ENM） 分散后，用预热的 DMEM 将它们稀释至最终所需的浓度。

用球体从每个孔中吸出 50 微升培养基，并用 ENM 用 50 微升培养基代替。要收获球状体，请使用 200 微升移液器从每个孔中吸出 100 微升细胞培养基和球状体组织，注意避免与琼脂糖接触。将球体收集在无菌 15 ml 离心管中。

球状体悬浮液以 230 倍 G 离心 5 分钟，然后去除上清液并储存在零下 80 摄氏度直至进一步分析。在一毫升无菌室温 PBS 中洗涤球状体沉淀，然后以 230 倍 G 离心 3 分钟，弃去上清液。将球状体重悬于 500 微升 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液中，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 6 至 8 分钟。

孵育后，轻轻上下移液管胰蛋白酶消化的 Hep G2 细胞以完全解离并重悬，然后用 1 毫升 DMEM 中和。将细胞悬液以 230 倍 G 离心 5 分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 2 毫升 PBS 中。要创建比色皿漏斗设置，请将准备好的显微镜载玻片放入金属支架中，将滤光片卡放在载玻片顶部，然后将比色皿漏斗固定在顶部。

将比色皿漏斗布置在细胞离心机中，漏斗朝上，以便可以直接将 100 μL 细胞悬液添加到每个漏斗中。然后根据手稿说明继续固定幻灯片。制备用磷酸酶缓冲液稀释的 20% Giemsa 染色溶液。

轻轻上下移液以混合溶液，然后在漏斗中用折叠的滤纸过滤。使用巴斯德移液器向每张载玻片上的 cytodot 中加入 3 到 5 滴过滤后的 Giemsa 溶液，并在室温下放置 8 到 10 分钟。在两次连续的磷酸酶缓冲液洗涤中洗涤载玻片。

然后用冷水短暂冲洗以去除多余的污渍并风干。在进行任何体外毒理学评估之前，重要的是要检查 3D HepG2 球体是否已正确形成。接种后 4 天，应形成表面光滑且无视觉突起的紧凑球形球体。

这里展示了接种后 4 天的良好质量和劣质球体。通常，每块板形成的 90% 到 95% 的球体将正确形成，并且可用于进一步实验。在 14 天的培养期内评估活力和肝脏样功能，以确定肝脏球状体模型的寿命，并确定它是否可以支持长期 ENM 或基于化学的危害评估。

白蛋白浓度在培养期间保持一致，而每个球体的尿素产生量增加，然后在第 14 天开始下降。对于遗传毒性评估，微核测定用于确定急性和长期 ENM 暴露后微核的存在。将球体暴露于两种 ENM，二氧化钛和银。

在急性暴露于两种 ENM 后观察到相似的遗传毒性趋势，但在长期暴露 5 天后，遗传毒性反应升高并不明显。按照这种方法，上清液和球体都可以收获用于多种生化终点。这些包括细胞活力、肝功能检测、SID 450 分析、不良炎症标志物和基因表达。

该技术目前正在许多合同研究实验室中进行测试，这些实验室希望将其应用于化学品和纳米材料的常规地质毒性测试。这有可能减少对体内测试方法的依赖。