Name: 在存在治疗性抗体的情况下，由FcγRIIIa参与驱动的人类自然杀伤细胞事件的评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 了解利用治疗性抗体评估FcγRIIIa驱动的人自然杀伤细胞事件的实验方案。该方法通过流式细胞术和蛋白质印迹分析脱颗粒、细胞因子产生及信号通路，无需抗原表达靶细胞即可研究分子机制。

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作者感谢 James Lee 和 Christopher Ng 对本文手稿提出的建议和编辑帮助。

以下方案符合iQ Bioscience人类研究伦理委员会的指导方针。
1. 外周血单个核细胞的分离及自然杀伤细胞的富集/纯化
注意：也可采用其他方法分离外周血单个核细胞（PBMCs）并进行富集/纯化。
<ol>
	<li>在受控条件下，抽取200 mL血液至含有肝素的试管中。</li>
	<li>将15 mL密度梯度介质加入一个带有孔隙屏障的50 mL试管中。以1000 x g离心30秒。</li>
	<li>向试管中加入12.5 mL血液，随后再加入12.5 mL PBS，轻轻倒置混匀3次。在室温（RT）下以800 x g离心15分钟，不启用刹车。</li>
	<li>在细胞离心过程中，为每个带孔隙屏障的试管准备一个含有40 mL PBS的50 mL离心管。</li>
	<li>离心结束后小心取出试管并进行检查。观察在50 mL试管20 mL至25 mL刻度之间、孔隙屏障上方是否存在一层薄而明显的白色PBMC层。</li>
	<li>使用移液器小心尽可能多地吸除上层液体，避免扰动下方薄薄的白色PBMC层。</li>
	<li>用一支洁净的10 mL刻度移液管，轻柔地吸取PBMC层以及其下方的澄清淡黄色液体层，直至到达试管滤膜处。</li>
	<li>将PBMC和液体排入步骤1.4中已准备好的含PBS的50 mL离心管中。在室温下以300 x g离心5分钟。</li>
	<li>吸除PBS洗涤液，并加入额外的40 mL PBS。在室温下以300 x g离心5分钟。</li>
	<li>洗涤后，计数细胞，并按每1 × 107个细胞加入40 µL含2% BSA的PBS重悬细胞。</li>
	<li>采用所选方法进行NK细胞的分离。可选方法包括手动或自动磁珠分选9,21。也可采用荧光激活细胞分选22。</li>
	<li>取少量细胞用于通过流式细胞术测定NK细胞纯度。设门策略如下：根据前向散射光与侧向散射光图谱圈选活细胞，然后在特定活细胞群体中依据NK细胞标志物（如CD3、CD56）评估纯度。典型纯度为&#62;95%。</li>
	<li>完成分离后，在室温下以300 x g离心5分钟，使细胞沉淀，然后吸除上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于RPMI 1640培养基中，终浓度为1 × 107个细胞/mL，培养基中包含营养物质、10%热灭活FBS、1 mM丙酮酸钠、55 mM 2-ME和10 mM HEPES（pH = 7.2）。</li>
</ol>
2. 通过 FcγRIIIa 的抗体介导 NK 细胞激活
<ol>
	<li>将制冷型微量离心机预设至 4 °C。</li>
	<li>将重悬的 NK 细胞按每份 1 × 106 个（即 100 µL）分装至 1.5 mL 离心管中，并置于冰上。 
	注意：若样本数量较多，可将细胞分装至 96 孔 U 型底板中。</li>
	<li>每份样本准备 1 µL 浓度为 100 µg/mL 的利妥昔单抗（或目标抗体），加入细胞中，使抗体终浓度为 1 μg/mL。 
	注意：此时或更早阶段可向细胞中添加其他分子，以评估联合效应。本实验中使用利妥昔单抗进行刺激；在先前研究中，小分子抑制剂已被加入刺激体系中9。</li>
	<li>将样本置于冰上孵育 30 分钟。在孵育期间，按每份样本准备含 50 μL 浓度为 50 µg/mL 抗人 κ 轻链抗体的培养基，并在加热块或水浴中预热至 37 °C。</li>
	<li>细胞冰上孵育结束后，加入 1 mL 冰冷培养基，于 4 °C 下以 135 x g 离心 5 分钟。再用 1 mL 冰冷培养基洗涤一次。</li>
	<li>最后一次洗涤后，吸除上清液，加入 50 µL 步骤 2.5 中配制的抗人 κ 轻链抗体混合液。</li>
	<li>立即在 37 °C 加热块或水浴中孵育样本，孵育时间由最终使用者确定。</li>
	<li>通过加入 1 mL 冰冷培养基终止刺激，并立即在制冷离心机中以 135 x g 于 4 °C 离心 5 分钟。再用 1 mL 冰冷培养基洗涤一次。</li>
</ol>
3. 下游应用与检测方法
<ol>
	<li>通过 Western 印迹分析检测 FcγRIIIa 刺激的 NK 细胞中的信号分子 
	注意：可使用不同的蛋白质分离和膜转移装置。
	<ol>
		<li>最后一次用预冷培养基洗涤后（步骤 2.8），在冰上用含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物的 20 µL RIPA 缓冲液裂解细胞，孵育 30 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 下以 2100 x g 离心 15 分钟。将裂解液转移至洁净的 1.5 mL 离心管中，并加入蛋白质分离所需的试剂。</li>
		<li>通过 SDS-PAGE 凝胶分离蛋白质，并按照标准操作流程将蛋白质转移至硝酸纤维素膜或 PVDF 膜上。</li>
		<li>根据一抗检测试剂说明书封闭并孵育膜（此处使用 pAKT、pPRAS40 和 pERK1/2 抗体）。</li>
		<li>在 PVDF 膜上按照生产商推荐条件加入 HRP 标记的二抗及化学发光试剂。使用 X 光胶片或检测仪器进行显影（此处 pAKT 在 60 kDa 处检测到，pPRAS40 在 40 kDa 处检测到，pERK1/2 在 42 kDa 和 44 kDa 处检测到）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FcγRIIIa 刺激的 NK 细胞 mRNA 的提取及基因表达分析准备（材料表）
	<ol>
		<li>达到刺激时间点后（步骤 2.7），将离心管置于冰上，并立即在预冷离心机中以 135 x g 离心 5 分钟（与步骤 2.8 类似）。</li>
		<li>弃去上清液，并用 1 mL 预冷 PBS 洗涤两次。</li>
		<li>使用硫氰酸胍法提取 RNA（材料表）。取 1 µg mRNA，使用随机六聚体引物和商用试剂盒进行反转录（材料表）。 
		注意：任何 RNA 提取或 cDNA 合成方法均可使用9,23,24。</li>
		<li>将 cDNA 在 -20 ˚C 冻存，直至进行基因表达分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FcγRIIIa 刺激的 NK 细胞中细胞骨架重排的评估
	<ol>
		<li>最后一次用预冷培养基洗涤后（步骤 2.8），用 50 µL 3.7% 多聚甲醛重悬细胞沉淀，在室温下孵育 10 分钟。</li>
		<li>加入 1 mL PBS，在室温下以 135 x g 离心 5 分钟。重复洗涤一次。</li>
		<li>加入 100 µL 含 0.1% Triton X-100 的 PBS，孵育 5 分钟以通透细胞，然后在室温下以 135 x g 离心 5 分钟收集细胞沉淀。</li>
		<li>加入 100 µL 用 1% BSA/PBS 稀释的 5 单位/mL AF488 标记鬼笔环肽，室温孵育 20 分钟。</li>
		<li>加入 1 mL PBS，在室温下以 135 x g 离心 5 分钟进行洗涤。将细胞沉淀重悬于适当体积中，用于流式细胞术分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过 CD107a 表面染色评估 FcγRIIIa 刺激的 NK 细胞脱颗粒
	<ol>
		<li>将细胞按照步骤 2.1–2.4 所述在冰上与目标抗体孵育。孵育期间，每份样品准备 50 µL 抗体混合液。在细胞培养基中配制混合液，终浓度为 50 µg/mL 抗人 κ 轻链抗体和 1 µg/mL 荧光染料标记的 CD107a 抗体。</li>
		<li>冰上孵育结束后，加入 1 mL 预冷培养基，在 4 °C 下以 135 x g 离心 5 分钟，再用 1 mL 预冷培养基洗涤一次。</li>
		<li>最后一次洗涤后弃去上清液，加入 50 µL 抗人 κ 轻链抗体混合液，在 37 °C 下按所需时间点进行孵育。</li>
		<li>在所需时间点，加入 1 mL PBS，在室温下以 135 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，加入 100 µL 4% 多聚甲醛，在室温下孵育 10 分钟。</li>
		<li>加入 1 mL PBS，在室温下以 135 x g 离心 5 分钟进行洗涤。将细胞沉淀重悬于适当体积中，用于流式细胞术分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FcγRIIIa 刺激的 NK 细胞趋化因子/细胞因子产生的评估 
	注意：可采用不同方法和/或试剂盒评估趋化因子和细胞因子的产生。
	<ol>
		<li>达到刺激时间点后（步骤 2.7），立即将离心管置于冰上，并在 4 °C 下以 135 x g 预冷离心机中离心 5 分钟。</li>
		<li>将上清液转移至洁净容器中。将上清液冻存，直至使用所需检测方法进行趋化因子或细胞因子分析。 
		注意：细胞沉淀现在可用预冷 PBS 洗涤，并用于信号通路、基因表达及细胞骨架重排研究。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

所有作者均曾是或目前是iQ Biosciences的员工或顾问。

本方案描述了研究抗体介导的自然杀伤细胞中由FcγRIIIa驱动事件的方法。这些技术可用于评估治疗性抗体潜在作用机制，据建议该机制为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）1,2。具体而言，这些方法在研究介导ADCC的潜在分子信号通路和细胞过程方面具有灵活性。它们还允许观察其他效应功能，例如趋化因子和细胞因子的产生。此外，这些方法有助于鉴定可能作为调控ADCC靶点的潜在生物标志物和分子。
本实验方案的基础是通过 FcγRIIIa 在无靶细胞存在的情况下，利用抗体对 NK 细胞进行人工刺激。通常情况下，与抗体结合的靶细胞可促进 Fc 受体的交联，形成驱动信号传导及下游效应的平台。而在本实验中，通过使用抗人 κ 轻链抗体实现受体交联，从而无需靶细胞即可刺激 NK 细胞。由于不使用靶细胞，只要 NK 细胞纯化过程成功，实验结果和观察到的现象即可直接归因于 NK 细胞本身。
重要的是，使用抗人κ轻链抗体交联该抗体不会干扰Fc段与FcγRIIIa的结合亲和力，而这种相互作用决定了反应强度10,11,12,13。事实上，已有研究表明，去岩藻糖基化的抗体因其对FcγRIIIa的亲和力增强，从而增强了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）10,11,12,13。后续研究进一步证实，这种增强的亲和力不受抗人κ轻链二抗替代物的影响，因此可用于研究ADCC增强的机制基础8。为确保NK细胞是通过抗体交联被激活，应设置两个阴性对照：1）仅使用治疗性抗体而不加抗人κ轻链二抗；2）仅使用抗人κ轻链二抗。在这两种情况下，均不应产生任何信号传导或效应功能。
该方法还为研究治疗性抗体与小分子抑制剂联合作用提供了灵活性。可在加入二抗进行交联之前先添加抑制剂，使其有足够时间结合靶点。然而，应开展实验以确定抑制剂预处理的最佳时间，从而使其对刺激产生最大抑制效应。此外，研究者也可选择在刺激后研究抑制剂的作用。在此情况下，可在交联后加入抑制剂，以研究其对已产生信号和生物学过程的影响。综上所述，本文所述方法在研究不同小分子抑制剂与治疗性抗体的联合效应方面具有高度灵活性。
如上所述，刺激后可进行多种检测。可通过不同厂商提供的SDS-PAGE和膜转移系统进行蛋白质印迹（Western blotting）以研究信号通路。同样，也可采用多种RNA提取方法、逆转录试剂和基因表达分析仪器来评估基因表达水平。最后，还可对细胞内或细胞外蛋白进行染色&#160;，样品可通过不同流式细胞仪进行分析。对于细胞内细胞因子和CD107a染色（步骤3.4，可同时检测），应加入莫能菌素和/或布雷菲德菌素A以增强信号。我们曾针对不同的实验目标使用过不同的平台，但仍观察到相似的结果。因此，该方法可根据研究需求结合多种试剂、平台和仪器进行补充和优化。
刺激所需的交联时间取决于研究目的。如果进行信号通路研究，典型的交联刺激时间为2分钟至10分钟。pAKT、pPRAS40和pERK1/2的积累在2分钟时达到峰值，并在10分钟后消失8,9。对于功能研究（例如涉及趋化因子/细胞因子产生的实验），细胞刺激时间必须至少持续30分钟，具体时长取决于待测分析物9。基因表达分析通常也需要30分钟的刺激时间9。使用RANTES基因表达作为检测指标时应谨慎，因为RANTES mRNA的产生不依赖于转录激活，其mRNA已在细胞内预先储存，可在刺激后迅速翻译并释放蛋白25。相比之下，脱颗粒反应则需要至少3小时的刺激时间。尽管存在上述一般规律，研究人员仍应开展动力学研究，以确定特定目标分子的最佳刺激时间。
类似地，研究人员应进行抗体滴定以确定其最佳浓度&#160;，因为即使同属同一亚型，不同特异性的抗体与FcγRIIIa的结合亲和力也各不相同。例如，利妥昔单抗（rituximab）和曲妥珠单抗（trastuzumab）均为IgG1亚型&#160;，但曲妥珠单抗对FcγRIIIa缬氨酸多态性的结合能力强于利妥昔单抗26,27。这种亲和力的差异可能导致功能上的不同，例如在已发表的研究中观察到的脱颗粒作用8。
确定最佳浓度也非常重要，因为抗体的 Fc 段与 FcγRIIIa 之间的亲和力较低。由于该实验方案在抗体与 Fc 受体结合后包含洗涤步骤，可能导致抗体被洗脱，从而引起检测灵敏度下降。&#160;如刺激后CD107a阳性细胞比例较低所示（图5）。然而，确定最佳浓度应能确保实验结果并非由于检测灵敏度不足所致。此外，在采用群体细胞而非单细胞检测的生化与功能检测中，细胞的活化状态表现得更为明显（图2, 图3, 图6).
该方案还存在局限性，因为它并未完全模拟生理条件下的实际情况。所使用的抗人K链二抗旨在模拟细胞表面表达的靶抗原所引发的交联效应。在此实验中，加入过量的二抗以产生最大反应。然而，不同的靶细胞表达的抗原水平各异，这将影响交联程度及反应强度。目前，该平台尚未优化以模拟不同抗原表达水平所带来的效应。
进行这些实验时需要考虑的另一个因素是供体之间的个体差异，这种差异源于不同个体之间的遗传背景和免疫学历史的不同。因此，在比较不同供体在同一检测中的自然杀伤细胞（NK细胞）反应时，必须谨慎。同样地，当使用不同供体时，应仅得出一般性结论。
综上所述，上述方法是一种简单且灵活的刺激平台，可用于研究抗体驱动的NK细胞中FcγRIIIa介导的事件。该方法已被用于深入理解去岩藻糖基化抗体所表现出的增强ADCC效应及更高疗效的分子基础8。该方法还曾被应用于一项联合使用治疗性抗体与PI3K小分子抑制剂的研究中9。此外，研究还发现了一种此前未知的由pS6调控的趋化因子和细胞因子产生机制9。因此，未来利用这一人工信号平台的研究可进一步阐明FcγRIIIa驱动的效应功能的调控机制，还可能发现参与这些机制的新分子，以及已知分子的新功能。

在过去几十年中，人们高度关注利用抗体开发靶向癌症疗法。治疗性抗体（如曲妥珠单抗和利妥昔单抗）通过多种机制发挥作用，包括阻止信号分子的二聚化以及激活免疫系统1,2。后者是通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）实现的，即抗体将称为自然杀伤（NK）细胞的淋巴细胞募集至靶细胞1,2。通过使这两种细胞相互靠近，NK细胞被激活，并可通过释放效应分子来裂解肿瘤/靶细胞3。
在分子水平上，抗体的Fab段结合肿瘤细胞表面表达的相应抗原，同时其Fc段与自然杀伤（NK）细胞上表达的FcγRIIIa结合，从而将两种细胞拉近1,2。FcγRIIIa被结合后，可激活信号通路（如MAPK和PI3K通路），驱动细胞骨架重排、细胞因子产生以及细胞毒作用4,5,6,7,8,9。因此，抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）是由FcγRIIIa驱动、由NK细胞和抗体共同介导的生物学事件。
由于人们认为ADCC是这些治疗性抗体的作用机制之一，研究人员试图通过对抗体进行改造来增强ADCC效应。其中一种改造方法是去除连接在天冬酰胺297位点上的寡糖链中的岩藻糖，这种修饰可提高抗体Fc区与FcγRIIIa受体的结合亲和力10,11,12。在动物研究中，接受去岩藻糖基化抗体的小鼠相较于接受岩藻糖基化抗体的小鼠，肿瘤生长速度更慢13。更重要的是，在慢性淋巴细胞白血病或滤泡性淋巴瘤患者中，去岩藻糖基化的奥妥珠单抗（如Gazyva，已获批的去岩藻糖基化抗体）相比其岩藻糖基化对应物利妥昔单抗（如Rituxan）显示出更优的疗效14,15。
直到最近，去岩藻糖基化抗体增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的机制仍不清楚。鉴于目前有大量研究项目正在开发利用FcγRIIIa驱动机制靶向癌细胞的治疗性抗体，建立能够检测这些抗体所促进的分子和细胞层面效应的体外检测方法显得尤为迫切。这不仅有助于深入理解其作用机制，还可能发现潜在的生物标志物。因此，研究人员建立了一种人工激活检测方法，用于研究抗体依赖的FcγRIIIa介导的功能，以及相关的信号转导和细胞特性8。通过这些研究，去岩藻糖基化抗体增强疗效的机制已得以阐明&#160;，即其增强的结合亲和力可促进信号传导，从而增强细胞特性和细胞毒效应8。
目前临床试验的趋势是联合使用多种治疗性分子16。其中最常见的突变通路之一是PI3K通路，这促使研究人员投入大量精力开发靶向该通路组分的小分子抑制剂17,18,19,20。然而，这些分子与治疗性抗体联用时的作用机制仍相对不明确，尤其是在抑制剂可能影响依赖PI3K通路才能发挥功能的分子的情况下，例如由治疗性抗体驱动的分子。
为此，用于非岩藻糖基化抗体研究的体外检测方法也被用于研究PI3K抑制剂与治疗性抗体的联合应用。这些研究明确了PI3K抑制对治疗性抗体介导的PI3K驱动事件的分子特征，并阐述了非岩藻糖基化抗体如何补偿此类信号传导的减弱9。这些发现具有重要意义&#160;，可为临床试验的设计提供潜在指导。此外，该系列实验还首次观察到PI3K信号通路的动力学调控可影响趋化因子/细胞因子的转录与产生，这些因子可能作为潜在的生物标志物9。
用于定义上述信号传导和细胞特性的体外人工激活实验，旨在研究在无靶细胞存在的情况下，抗体介导的自然杀伤（NK）细胞中由FcγRIIIa驱动的事件。由于体系中不含靶细胞，所观察到的所有信号传导事件和功能均可直接归因于NK细胞本身。在本实验中，将抗体加入纯化的NK细胞中，其Fc段与FcγRIIIa结合。随后使用抗人κ轻链抗体对表面结合的抗体进行交联，以人工刺激细胞。抗体的交联模拟了靶抗原的结合，从而形成一个可触发下游事件的信号平台。根据刺激时间的长短，研究人员可评估信号传导、细胞过程、细胞毒特性及效应功能8,9。类似地，该实验方法也具有灵活性，可用于研究抗体与其他分子联用时的上述生物学事件9。
综上所述，该体外实验是研究治疗性抗体通过其FcγRIIIa介导自然杀伤细胞（NK细胞）反应的作用机制的理想方法。本方案详细描述了该体外激活实验的操作流程，并介绍了可进行的多种检测读数。

<table><tbody><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 鬼笔环肽</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 HRP 抗体</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS 仪器</td><td>Miltenyi</td><td></td><td>NK 细胞分离方法；可使用其他分离仪器</td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 V 型，无脂肪酸</td><td>Millipore Sigma</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>CD107a APC 抗体</td><td>Biolegend</td><td>328620</td><td></td></tr><tr><td>细胞因子 30-plex 人源检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LHC6003M</td><td>趋化因子/细胞因子检测方法；可使用其他趋化因子/细胞因子分析方法</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗人 &amp;kappa; 轻链抗体</td><td>Millipore Sigma</td><td>AP502</td><td></td></tr><tr><td>Halt 蛋白酶与磷酸酶抑制剂混合液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>高容量 cDNA 反转录试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4368814</td><td>cDNA 反转录方法；按制造商说明书操作</td></tr><tr><td>IFN-? 引物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs00989291_m1</td><td></td></tr><tr><td>Leukosep 管（50 ml 圆锥形带多孔屏障）</td><td>Greiner</td><td>227290</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep（密度梯度介质）</td><td>Stemcell</td><td>7851</td><td></td></tr><tr><td>MIP-1? 引物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs00234142_m1</td><td></td></tr><tr><td>MIP-1&amp;beta; 引物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs99999148_m1</td><td></td></tr><tr><td>NK 细胞分离试剂盒</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-657</td><td>NK 细胞分离试剂盒；可使用其他分离试剂盒</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>可使用其他蛋白分离系统</td></tr><tr><td>pAKT (S473) 抗体</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4060</td><td></td></tr><tr><td>pERK1/2 抗体</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4370</td><td></td></tr><tr><td>pPRAS40 抗体</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>13175</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 膜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>可使用硝酸纤维素膜</td></tr><tr><td>RANTES 引物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs00982282_m1</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 裂解缓冲液</td><td>Millipore Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 含谷氨酰胺</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>TNF-? 引物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs00174128_m1</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td>RNA 提取方法；按制造商说明书操作</td></tr><tr><td>Xcell Blot II 转膜模块</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>可使用其他蛋白分离系统</td></tr><tr><td>Xcell SureLock 蛋白凝胶电泳槽系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>可使用其他蛋白分离系统</td></tr><tr><td>&amp;beta;-actin HRP 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-actin 引物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs00982282_m1</td><td></td></tr></tbody></table>

通过治疗性抗体存在下fcγriiia结合驱动的人自然杀伤细胞事件评估

Assessment of Human Natural Killer Cell Events Driven by Fc&#947;RIIIa Engagement in the Presence of Therapeutic Antibodies

治疗性抗体发挥临床疗效的作用机制之一是促进免疫相关功能，例如由自然杀伤（NK）细胞表面表达的FcγRIIIa（CD16）所驱动的细胞因子分泌和细胞毒性作用。这些发现促使研究聚焦于增强Fc受体介导事件的方法，其中包括去除抗体Fc区所含的岩藻糖基团。进一步的研究阐明了无岩藻糖基化抗体在信号转导、细胞过程及细胞毒特性方面的机制性改变，这些改变可增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性。此外，其他研究还表明，此类抗体与小分子抑制剂联用具有潜在益处。这些实验揭示了无岩藻糖基化抗体在联合用药中所产生益处的分子与细胞机制基础。许多上述观察结果基于一种人工体外激活实验体系，其中人NK细胞上的FcγRIIIa通过治疗性抗体被激活。该实验体系具有灵活性，可用于研究NK效应细胞的下游功能，如细胞因子产生和脱颗粒作用。此外，该体系已被用于探究信号通路，并鉴定可被调控或作为生物标志物的分子。最后，研究人员已在该体系中加入其他治疗分子（即小分子抑制剂），以深入了解这些治疗手段与治疗性抗体联用的效果，这在当前临床研究领域中至关重要。本论文旨在为开展这种人工人NK细胞激活实验提供技术基础。该实验方案展示了细胞激活的关键步骤，以及从功能性检测到更深入机制研究等多种潜在的下游应用。

NK细胞的纯度必须足够高，因为抗体的Fc段可结合其他细胞类型（如单核细胞）表面表达的FcγRIIIa。当纯度较高时，所观察到的现象可直接归因于NK细胞中FcγRIIIa介导的事件。本实验中，基于CD56和CD3染色结果，NK细胞纯度超过90%图1。此外，细胞活力 &gt;95%。使用活力较低的分离细胞时应谨慎操作。为确保信号由FcγRIIIa介导，对磷酸化AKT（pAKT）、磷酸化PRAS40（pPRAS40）和磷酸化ERK1/2（pERK1/2）进行了蛋白质印迹分析，其中自然杀伤细胞被激活1–5分钟。如图所示，观察到这些分子的累积图2）。类似地，通过基因表达分析显示，活化的NK细胞表达MIP-1α、MIP-1β、IFN-γ和TNF-α。图3).
此外，活化的细胞中还观察到细胞骨架重排（图4）。经刺激4小时后，部分NK细胞在细胞表面表达CD107a（图5）。此外，在刺激3小时后，上清液中可检测到IFN-γ、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β和RANTES（图6）。根据已发表的研究，这些检测结果是预期之中的，因为活化的NK细胞会表现出这些蛋白的磷酸化，以及上述趋化因子和细胞因子的基因表达与产生8,9。在所有实验中，刺激条件应包括仅含抗人κ轻链抗体的对照组，以及不含抗人κ轻链交联的抗体对照组。这些NK细胞不应表现出任何磷酸化信号、脱颗粒、趋化因子/细胞因子产生或趋化因子/细胞因子基因表达。
<img alt="CD3 与 CD56 流式细胞术图，显示分离前后细胞纯度百分比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61144/61144fig1v4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：从外周血单个核细胞（PBMC）中分离自然杀伤（NK）细胞后纯度的代表性流式图谱。从健康供体血液中分离外周血单个核细胞（PBMC），随后采用负向选择法富集NK细胞（材料表）。在富集前后，使用CD56和CD3抗体对细胞进行染色以评估纯度。图中为分离前后CD56与CD3的代表性点图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61144/61144fig1v4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Western blot 示意图，使用抗人抗体检测 pAKT、pPRAS40 和 pERK1/2。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61144/61144fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：FcγRIIIa 激活的 NK 细胞表现出磷酸化的信号分子。细胞用利妥昔单抗刺激 2 分钟，并按照方案制备细胞裂解液。裂解液在 4%–12% 凝胶上电泳分离，随后转移至 PVDF 膜。膜依次用抗 pAKT、pPRAS40、pERK1/2 和肌动蛋白抗体进行杂交检测。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61144/61144fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示 MIP-1α、MIP-1β、RANTES、IFN-γ、TNF-α 随时间（小时）变化的基因表达图谱。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61144/61144fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：FcγRIIIa 激活的 NK 细胞表达趋化因子和细胞因子基因。NK 细胞用利妥昔单抗分别刺激 0 h、0.5 h 和 1 h。收集 mRNA，进行逆转录，并通过 qPCR 检测 MIP-1α、MIP-1β、RANTES、IFN-γ 和 TNF-α 的表达（材料表）。(A) 各时间点 MIP-1α、MIP-1β 和 RANTES 的相对表达水平。(B) 各时间点 IFN-γ 和 TNF-α 的相对表达水平。数据经肌动蛋白基因标准化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61144/61144fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="利妥昔单抗诱导的MFI比值随时间变化；利妥昔单抗与IgG对照的折线图比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61144/61144fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：FcγRIIIa激活的NK细胞表现出细胞骨架重排。NK细胞分别经利妥昔单抗刺激0分钟、5分钟、15分钟和30分钟后，通过鬼笔环肽染色和流式细胞术检测细胞骨架重排情况。实验时间点MFI与0分钟时间点MFI的比值，分别对应利妥昔单抗刺激组（圆形，实线）和仅使用二抗对照组（方形，虚线）。误差线表示四次重复实验的标准差。星号表示基于双尾非配对Student t检验的统计学显著性（*p &lt; 0.05）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61144/61144fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="CD107a 表达量随时间变化的柱状图；利妥昔单抗，仅分泌；MFI，免疫应答分析，0-4 小时比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61144/61144fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：FcγRIIIa 激活的自然杀伤细胞表达 CD107a。自然杀伤细胞用利妥昔单抗刺激 4 小时，随后通过 CD107a 检测脱颗粒情况，并采用流式细胞术进行分析。(A) 利妥昔单抗（白色柱）或抗人 κ 轻链抗体（灰色柱）刺激 0 小时和 4 小时后，表达 CD107a 的自然杀伤细胞百分比。(B) 经利妥昔单抗（白色柱）或抗人 κ 轻链抗体（灰色柱）刺激 0 小时和 4 小时后，自然杀伤细胞的 CD107a MFI。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61144/61144fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="趋化因子和细胞因子产生量图表；时间与产生水平；比较分析结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61144/61144fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：FcγRIIIa激活的自然杀伤细胞分泌趋化因子和细胞因子。 NK细胞用利妥昔单抗刺激0、0.5、1、3和6小时。收集上清液，采用基于流式与微球的细胞因子检测方法测定MIP-1α、MIP-1β、RANTES、IFN-γ和TNF-α的释放水平材料表）。(A) 各时间点MIP-1α、MIP-1β和RANTES的产生情况。B每个时间点的 IFN-γ 和 TNF-α 产生情况。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61144/61144fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文描述了一种研究治疗性抗体在人自然杀伤细胞中通过FcγRIIIa介导的生物学事件的实验方案。该人工刺激平台可用于检测抗体FcγRIIIa受体及其Fc段结合所介导的下游效应功能，例如脱颗粒、趋化因子/细胞因子产生以及相关信号通路的激活。

通过治疗性抗体存在下FcγRIIIa结合驱动的人自然杀伤细胞事件评估

治疗性抗体发挥临床疗效的作用机制之一是促进免疫相关功能，例如细胞因子分泌以及……

该方法可用于解析由 FC gamma R3A 驱动的细胞分子机制，而无需表达抗原的靶细胞。将制冷微量离心机设置为 4 摄氏度，或将微量离心机置于冷藏环境中。将 100 微升重悬的自然杀伤细胞分装至 1.5 毫升离心管或 96 孔 U 型底板中，并将细胞置于冰上。将利妥昔单抗或其他目标抗体配制为浓度100微克/毫升。每管细胞中加入1微升，使终浓度为1微克/毫升，冰上孵育30分钟。在孵育期间，用培养基配制浓度为50微克/毫升的抗人κ轻链抗体溶液。每份细胞样品所需的抗体溶液体积为50微升。将抗体溶液在金属浴或水浴中加热至37摄氏度。细胞孵育完成后，向每根离心管中加入1毫升预冷的培养基，并在4摄氏度条件下以135 × g离心5分钟。用一毫升预冷的培养基再次洗涤细胞。最后一次洗涤后，吸去上清液，加入50微升抗人κ轻链抗体溶液以活化细胞。立即将细胞样品置于37摄氏度的加热块或水浴中，并孵育至预定的分析或其他实验所需的时间点。处理多个样本的最佳方法是使用置于37摄氏度水浴中的浮动架，该浮动架可随时取出并立即置于冰上，以迅速终止所有反应。在需要进行western血液分析或细胞骨架重排评估的时间点，通过加入一毫升冰冻培养基来终止激活，并立即将样本在4摄氏度下以135 ×g离心五分钟。再用一毫升冰冻培养基洗涤一次。加入含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物的20微升RIPA裂解缓冲液，裂解细胞。将离心管置于冰上孵育30分钟，然后在4°C条件下以2,100 × g离心15分钟。将裂解液转移至新的1.5毫升离心管中，并加入蛋白分离所需的试剂。为终止激活，将细胞样品从水浴中取出并置于冰上。立即在4°C离心机中以135 ×g离心5分钟。将上清液转移至洁净容器中，并冷冻保存，用于后续趋化因子或细胞因子产生的检测。用一毫升预冷的PBS洗涤沉淀物两次。提取RNA并制备cDNA。将cDNA在-20°C下冷冻，直至进行基因表达分析。用50微升3.7%多聚甲醛重悬细胞沉淀。室温孵育10分钟后，加入1毫升PBS，于室温下以135 ×g离心5分钟。重复洗涤一次。加入100微升含0.1% Triton X-100的PBS以透化细胞。5分钟后，在室温下以135 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。然后加入100微升鬼笔环肽（phalloidin），于室温孵育20分钟。洗涤细胞时，加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS），在室温下以135 ×g离心五分钟。用所需体积的缓冲液重悬细胞沉淀，用于流式细胞术分析。在细胞与利妥昔单抗或其他目标抗体在冰上孵育的同时，每份样品准备50微升抗体混合液。最后一次洗涤并吸除细胞后，加入50微升CD107A抗体混合物，然后在37摄氏度孵育。在预定的时间点，向细胞中加入1毫升PBS，并在室温下以135 ×g离心5分钟。吸去上清液，加入100微升4%多聚甲醛。室温孵育10分钟。加入1毫升PBS，于室温下以135 ×g离心5分钟进行洗涤。将细胞沉淀重悬于所需体积中，用于流式细胞术分析。自然杀伤细胞从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离，并用CD56和CD3进行染色。细胞纯度高于90%，活力高于95%。细胞裂解液通过SDS-PAGE凝胶电泳分离。转移至PVDF膜后，对磷酸化AKT、磷酸化PRAS 40以及磷酸化ERK 1和2进行Western印迹检测。这些分子的积累表明，相关事件由FC gamma R3A介导。自然杀伤细胞用利妥昔单抗进行刺激。收集mRNA，进行逆转录，并进行qPCR分析。活化的自然杀伤细胞表达MIP-1α、MIP-1β、RANTES、干扰素γ和TNFα。用利妥昔单抗刺激0至30分钟后，自然杀伤细胞进行鬼笔环肽染色和流式细胞术分析。在活化的细胞中观察到细胞骨架重排。通过CD107A和流式细胞术评估自然杀伤细胞的脱颗粒情况。利妥昔单抗增加了表达CD107A的细胞百分比。自然杀伤细胞用利妥昔单抗分别刺激0、0.5、1、3和6小时。收集上清液，并通过基于流式微球的细胞因子检测方法进行分析。正如先前已发表研究预期的那样，在上清液中检测到趋化因子MIP-1α、MIP-1β和RANTES，以及细胞因子干扰素γ和TNFα。只有一小部分被激活的CD8 T细胞表达FC gamma R3A，本方案可能有助于识别通过FC gamma R3A介导事件发挥作用的治疗手段的生物标志物。

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癌细胞逃避免疫系统中自然杀伤（NK）细胞介导的清除作用，对癌症的发生和进展至关重要。本文介绍了两种基于非放射性的实验方案，用于评估NK细胞对肝肿瘤细胞的细胞毒性作用。此外，还提供了一种第三种方案，用于分析NK细胞的迁移能力。...

肝癌细胞背景下自然杀伤细胞介导的细胞毒性和迁移能力的测定

本文介绍了一种扩增外周血自然杀伤（PBNK）细胞、肝脏组织来源的NK细胞，以及由外周血单个核细胞（PBMCs）或脐带血（CB）衍生的嵌合抗原受体（CAR）-NK细胞的方法。该方案展示了利用221-mIL-21饲养细胞扩增NK细胞和CAR-NK细胞，并实现了扩增后NK细胞的优化纯度。...

利用膜结合型IL-21修饰的B细胞系扩增自然杀伤（NK）细胞和CAR-NK细胞的方法

本方案展示了如何在3D和2D培养条件下，从人类扩展潜能干细胞（hEPSCs）中分化出具有轻度细胞毒性的CD3−/CD45+CD56+细胞。该方法可在不破坏复杂微环境的前提下，实现常规的表型验证。...

从人类扩展潜能干细胞生成自然杀伤细胞

本文介绍一种用于鉴定可调节ADCC机制化合物的方法，ADCC是抗肿瘤抗体杀伤癌细胞的重要机制。通过该方法，在存在曲妥珠单抗（Trastuzumab）的条件下，检测自然杀伤（NK）细胞对乳腺癌细胞球状体的细胞毒性作用。图像分析可识别球状体中存活和死亡的效应细胞及靶细胞。...

在肿瘤类球体模型中定量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性：用于药物发现的应用

本方案描述了一种基于无透镜阴影成像技术的无标记方法，用于快速进行自然杀伤（NK）细胞数量和活性的单细胞分析。该方法通过计算机分析单个NK细胞的衍射图样，量化其形态学变化。...

可用于野外的无透镜成像平台用于自然杀伤细胞活化的快速无标记分析

本方案提供了一种标准化的 体外...

利用活细胞成像和流式细胞术定量分析嵌合抗原受体与治疗性抗体增强的自然杀伤细胞毒性

了解利用治疗性抗体评估FcγRIIIa驱动的人自然杀伤细胞事件的实验方案。该方法通过流式细胞术和蛋白质印迹分析脱颗粒、细胞因子产生及信号通路，无需抗原表达靶细胞即可研究分子机制。

通过治疗性抗体存在下FcγRIIIa结合驱动的人自然杀伤细胞事件评估

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